Avaliando as propriedades angiogenéticas de células-tronco do câncer de ovário usando o Sistema de Cocultura Tridimensional, NICO-1

Resumo

As células-tronco do câncer de ovário (OCSC) são responsáveis pelo início, recorrência, resistência terapêutica e metástase do câncer. Considera-se que o nicho vascular do OCSC promove a auto-renovação dos OCSCs, levando à quimiorresistência. Este protocolo fornece a base para o estabelecimento de um modelo de nicho vascular OCSC reprodutível in vitro.

Resumo

As células-tronco cancerígenas (CSCs) residem em um nicho de suporte, constituindo um microambiente composto por células estromais adjacentes, vasos e matriz extracelular. A capacidade das CSCs de participar do desenvolvimento do endotélio constitui uma característica importante que contribui diretamente para a compreensão geral dos mecanismos de tumorigênese e metástase tumoral. O objetivo deste trabalho é estabelecer uma metodologia reprodutível para investigar a capacidade de iniciação tumoral de células-tronco de câncer de ovário (OCSCs). Neste trabalho, examinamos o mecanismo de neovascularização entre células endoteliais e OCSCs, juntamente com as alterações morfológicas das células endoteliais, usando o modelo de co-cultura in vitro NICO-1. Este protocolo permite a visualização da etapa de neovascularização em torno dos OCSCs de forma temporal. A técnica pode fornecer informações sobre as propriedades angiogenéticas dos OCSCs na metástase tumoral.

Introdução

O câncer de ovário é a oitava neoplasia maligna mais comum em mulheres em todo o mundo, com aproximadamente 300.000 novos diagnósticos e uma estimativa de 180.000 mortes anuais¹. No diagnóstico inicial, o câncer de ovário geralmente se apresenta com sintomas graves, com cerca de 75% das pacientes já no estágio III-IV. Assim, a taxa de sobrevida em 5 anos é de <30% e a taxa de mortalidade é a mais alta entre os cânceres ginecológicos², com a eficiência do tratamento para o câncer de ovário sendo altamente dependente de fatores clínicos, como a realização bem-sucedida da cirurgia de debulking, resistência à quimioterapia e recorrência após a terapia inicial.

Os tecidos do câncer de ovário são hierarquicamente organizados, com nem todos os componentes do tumor sendo igualmente capazes de gerar descendentes. As únicas células capazes de se auto-renovar e produzir uma população heterogênea de células tumorais são consideradas como representando células-tronco cancerígenas (CSCs)³. A auto-renovação do CSC e o início do tumor são acompanhados pela promoção da angiogênese para remodelar seu microambiente tumoral com a finalidade de manter um nicho de suporte. No entanto, modelos anteriores não puderam ser utilizados para análises in vitro devido à reprodutibilidade limitada do cultivo de CSCs derivadas de amostras clínicas devido à ruptura de esferoides após múltiplas passagens. Mais recentemente, métodos experimentais para cultivar CSCs de pacientes têm sido desenvolvidos para diversas aplicações 4,5,6,7. Em particular, ao explorar a característica de crescimento das CSCs formando esferoides em placas de fixação ultrabaixa com meio livre de soro, as CSCs cultivadas são induzidas a expressar um marcador de superfície de células-tronco que não é expresso em células tumorais normais com potencial de diferenciação de múltiplas linhagens ^8,9.

Dados recentes têm mostrado que a persistência de (O)CSCs ovarianos dormentes visualizados como disseminação no peritônio está associada à sua regeneração como tumores recorrentes¹⁰. A compreensão das características moleculares e biológicas dos OCSCs pode, portanto, permitir o direcionamento e a erradicação efetivos dessas células, resultando em potencial remissão tumoral. Em particular, pouco se sabe sobre as características mecanicistas celulares e moleculares dos papéis das CSCs na angiogênese¹¹. Portanto, no presente protocolo, utilizamos OCSCs derivados de pacientes em um ambiente in vitro para investigar a propriedade angiogênica de células endoteliais usando o modelo de cocultura, que pode imitar o microambiente tumoral de CSCs e células endoteliais no local metastático no ambiente clínico. Em última análise, como a neovascularização constitui um processo crítico necessário para apoiar o crescimento e a metástase do tumor, uma melhor compreensão de seu mecanismo permitirá o desenvolvimento de uma nova terapia direcionada para OCSCs no local metastático.

Aqui, apresentamos um protocolo para visualizar a etapa de neovascularização em torno das CSCs de forma temporal. A vantagem do protocolo inclui permitir investigações totalmente reprodutíveis usando o sistema de cocultura 3D, NICO-1, permitindo assim a observação dos efeitos em pacientes da capacidade de iniciação de tumores derivados do OCSC durante a angiogênese de células endoteliais.

Protocolo

Todos os procedimentos foram realizados sob o protocolo aprovado pelo Comitê de Ética para o bem-estar humano. Todos os pacientes forneceram consentimento informado por escrito para o uso em pesquisa de suas amostras, e a coleta e o uso de tecidos para este estudo foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa em Análise de Genes do Genoma Humano, da Universidade de Teikyo.

1. Isolamento e cultura de células-tronco de câncer de ovário (OCSCs) de pacientes com câncer de ovário e ascite em um gabinete de biossegurança de nível 2

1. Isole células-tronco cancerígenas da ascite do câncer de ovário humano obtido por paracentese. Colete pelo menos 100-250 mL de ascite de pacientes para tomar um número suficiente de células-tronco cancerígenas. Além disso, avalie os perfis de expressão de marcadores de células-tronco cancerígenas (ou seja, EpCAM, Calretinina, CD133, CD44, CD45, ALDH1 e Oct4) e marcadores de câncer de ovário (pAX-8, WT-1) por citometria de fluxo.
   1. Centrifugar a ascite do cancro do ovário humano a 300 x g durante 10 minutos à temperatura ambiente no prazo de 24 h após a aspiração da ascite.
   2. Remover o sobrenadante e adicionar 2 mL de meio OCSC e 8 mL de solução salina tamponada com Histodenz/fosfato a 30% (PBS, pH 7,4).
   3. Prepare o meio OCSC: suplemento StemPro hESC, DMEM⁄F-12 com L-glutamina (meio GlutaMAX), 25% BSA, 100 μM 2-mercaptoetanol, 8 ng/mL FGF BASIC, 10 μM de insulina e 20 μM Y-27632.
   4. Sobrepor cuidadosamente 2 ml de meio OCSC à solução celular na fase 1.1.2 num tubo de 15 ml e centrífuga a 450 x g durante 20 minutos à temperatura ambiente num rotor de balde oscilante sem travagem.
   5. Transfira cuidadosamente a camada OCSC (sem ser perturbada na interfase) para um novo tubo de 15 mL por pipeta de transferência.
   6. Encha com PBS até 15 mL. Centrifugar a 300 x g durante 5 min à temperatura ambiente e remover o sobrenadante.
   7. Ressuspender o pellet celular em meio OCSC e semear em um prato de cultura de fixação ultrabaixa; as culturas devem ser mantidas a 37 °C em 5% de CO₂.
   8. Mude o meio a cada três dias. Posicione cuidadosamente o prato de cultura por cerca de 1 minuto, descarte parte do sobrenadante e adicione o novo meio.
2. Passagem de CSCs
   1. Recolher OCSCs num tubo de 15 ml e centrifugar a 200 x g durante 5 min à temperatura ambiente.
   2. Remova o sobrenadante, encha com PBS e centrifugar a 200 x g por 5 min à temperatura ambiente.
   3. Remova o sobrenadante, adicione 1 mL da solução de descolamento celular que consiste em enzimas proteolíticas e colagenolíticas (por exemplo, AccuMax) e incube a 37 °C por 10 min.
   4. Misturar bem por pipetagem e incubar a 37 °C durante 5 min. Certifique-se de que as células estão em uma única suspensão.
   5. Misture bem por pipetagem, encha com PBS e centrifuga a 300 x g por 5 min à temperatura ambiente.
   6. Remover o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em meio OCSC para posterior semeadura em placas de cultura de fixação ultrabaixa e manutenção a 37 °C em CO₂ a 5%.

2. Cultura de células endoteliais HUEhT-1

1. Passagem de células HUEhT-1
   1. Retire o meio da placa de cultura HUEhT-1 e lave as células com PBS.
   2. Adicionar 1 mL de tripsina a 0,025% e incubar por 3 min à temperatura ambiente.
   3. Adicionar 5 mL de Meio de Crescimento Celular Endotelial 2, coletar células em um tubo de 15 mL e centrifugar a 200 x g por 5 min à temperatura ambiente.
   4. Retirar o sobrenadante, ressuspender o pellet celular em meio HUEhT-1 e semear as células em placas de cultura revestidas de colágeno, seguidas de manutenção a 37 °C em 5% de CO₂.
   5. Mude o meio a cada três dias.

3. Preparação da Placa de Cocultura NICO-1 para ensaio de formação de tubos utilizando células HUEhT-1

1. Monte NICO-1 e revestimento com o hidrogel à base de matriz extracelular (Matrigel Matrix).
   1. Monte um lado do NICO-1 seguindo as instruções do fabricante e mantenha-o no gelo.
   2. Cubra a superfície do NICO-1 com 300 μL de PBS frio e, em seguida, remova o tampão tamponamento.
   3. Adicionar 300 μL de hidrogel à base de matriz extracelular refrigerado e incubar a 37 °C durante 60 min.
   4. Para equilibrar, mergulhe o filtro com 100% de etanol e, em seguida, lave um filtro ICCP de 13 mm (0,6 μm) com PBS por 1 min.
   5. Monte o NICO-1 incluindo as partes principais do corpo A (câmara direita) e B (câmara esquerda), juntamente com o anel O e o filtro equilibrado.

4. Semeando células HUEhT-1 e CSCs no sistema NICO-1

1. Preparar suspensões celulares HUEhT-1 tripsinizando as monocamadas celulares e ressuspendendo as células em meio de crescimento celular endotelial com soro fetal de bezerro a 2%.
2. Adicione 1,2 mL da suspensão celular (1,5 x 10⁵ células) a cada poço revestido de hidrogel à base de matriz extracelular.
3. Adicione 1,5 mL de OCSCs cultivados por cinco dias ao outro poço.
4. Incubar NICO-1 a 37 °C em 5% de CO₂; a formação de tubos pode ser observada ao microscópio e a formação de redes em hidrogel extracelular à base de matriz, medida por meio do número de ramos.

Resultados

Foram coletados fluidos de ascite obtidos de pacientes com câncer de ovário avançado durante cirurgia ou paracentese com o objetivo de realizar uma cultura estável a longo prazo para esferoides. Aqui, apresentamos casos de uma cultura esferoide de longo prazo de CSCs ovarianos denominadas CSC1 e CSC2. Ambas as linhagens celulares carregam o mesmo diagnóstico e perfis histológicos. Os papéis mecanicistas dos OCSCs subjacentes à interação com as células endoteliais necessárias p...

Discussão

O protocolo apresentado descreve como imitar o microambiente tumoral de OCSCs em um ambiente in vitro. O componente primário do método constitui o modelo de cocultura altamente reprodutível obtido usando o sistema NICO-1, um sistema de co-cultura Transwell indireto. Muitos dos modelos de cocultura atualmente disponíveis examinam os efeitos do contato direto célula-célula em populações celulares cocultivadas 12,13,14,15,16,17,18.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.025% Trypsin	Thermo	R001100
10 mL Pipet	Thermo	170356N
1250 µL Pipet tip	QSP	T112XLRS-Q
15 mL tube	Nunc	339650
200 µL Pipet tip	QSP	T110RS-NEW
2-Mercaptoethanol	Thermo (Gibco)	21985023
5 mL Pipet	Thermo	170366N
50 mL tube	Corning	430290
AccuMAX	Innovative Cell Technologies	AM105
BioCoatTM Collagen I 60mm Dish	Corning	356401
Centrifuge	KUBOTA	2800
Costar 6 Well Clear Flat Bottom Ultra Low Attachment Multiple Well Plates	Corning	3471
Endothelial Cell Growth Medium 2	PromoCell	C-22011
Ethanol	WAKO	057-00456
FGF-Basic	Thermo (Gibco)	PHG0021
Histodenz	SIGMA	D2158
HUEhT-1 cell	JCRB Cell Bank	JCRB1458
ICCP Filter 0.6 µm	Ginrei Lab.	2525-06
Insulin, human	SIGMA (Roche)	11376497001
Luminometer	PerkinElmer	ARVO MX-flad
Matrigel Matrix	Corning	356234
Microscope	Yokogawa	CQ-1
NICO-1	Ginrei Lab.	2501-02
OptiPlate-96	PerkinElmer	6005290
P1000 Pipet	Gilson	F123602
P200 Pipet	Gilson	F123601
PBS	Thermo (Gibco)	14190-144
StemPro hESC SFM	Thermo (Gibco)	A1000701
Transfer Pipet	FALCON	357575
Y-27632	WAKO	253-00513