Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Yumurtalık kanseri kök hücreleri (OKSK) kanserin başlamasından, nüksetmesinden, terapötik direncinden ve metastazından sorumludur. OCSC vasküler nişinin, OKSC'lerin kendi kendini yenilemesini teşvik ettiği ve kemorezistansa yol açtığı düşünülmektedir. Bu protokol, in vitro olarak tekrarlanabilir bir OCSC vasküler niş model oluşturmak için temel sağlar.

Özet

Kanser kök hücreleri (CSC'ler), bitişik stromal hücrelerden, damarlardan ve hücre dışı matristen oluşan bir mikro ortam oluşturan destekleyici bir niş içinde bulunur. CSC'lerin endotel gelişimine katılma yeteneği, tümörigenez ve tümör metastazı mekanizmalarının genel olarak anlaşılmasına doğrudan katkıda bulunan önemli bir özellik oluşturmaktadır. Bu çalışmanın amacı, yumurtalık kanseri kök hücrelerinin (OKSK) tümör başlatma yeteneğini araştırmak için tekrarlanabilir bir metodoloji oluşturmaktır. Bu çalışmada, endotel hücreleri ve OKSK'ler arasındaki neovaskülarizasyon mekanizması ve endotel hücrelerinin morfolojik değişiklikleri in vitro ko-kültür modeli NICO-1 kullanılarak incelenmiştir. Bu protokol, OKSK'leri çevreleyen neovaskülarizasyon adımının zaman içinde görüntülenmesini sağlar. Bu teknik, tümör metastazında OKSK'lerin anjiyogenetik özellikleri hakkında fikir verebilir.

Giriş

Yumurtalık kanseri, dünya çapında kadınlarda sekizinci en yaygın malignitedir ve yaklaşık 300.000 yeni tanı ve yılda tahmini 180.000 ölüm1. İlk tanıda, yumurtalık kanseri sıklıkla şiddetli semptomlarla ortaya çıkar ve hastaların yaklaşık% 75'i zaten evre III-IV'tedir. Buna göre, 5 yıllık sağkalım oranı% <30'dur ve mortalite oranı jinekolojik kanserler arasında en yüksektir2, yumurtalık kanseri tedavisinin etkinliği, debulking cerrahisinin başarılı bir şekilde gerçekleştirilmesi, kemoterapiye direnç ve ilk tedaviden sonra nüks gibi klinik faktörlere büyük ölçüde bağlıdır.

Yumurtalık kanseri dokuları hiyerarşik olarak organize edilmiştir, tüm tümör bileşenleri eşit derecede torunlar üretemez. Kendi kendini yenileyebilen ve heterojen bir tümör hücresi popülasyonu üretebilen tek hücrenin kanser kök hücrelerini (CSC'ler) temsil ettiği düşünülmektedir3. CSC kendini yenileme ve tümör başlangıcına, destekleyici bir niş sağlamak amacıyla tümör mikro çevresini yeniden şekillendirmek için anjiyogenezin teşvik edilmesi eşlik eder. Bununla birlikte, önceki modeller, çoklu pasajdan sonra sferoidlerin bozulması nedeniyle klinik örneklerden türetilen CSC'lerin yetiştirilmesinin sınırlı tekrarlanabilirliği nedeniyle in vitro analizler için kullanılamamıştır. Daha yakın zamanlarda, hastalardan CSC'leri yetiştirmek için deneysel yöntemlerçeşitli uygulamalar için geliştirilmiştir 4,5,6,7. Özellikle, CSC'lerin serumsuz ortama sahip ultra düşük bağlantı plakalarında sferoidler oluşturarak büyüme özelliğinden yararlanarak, ekili CSC'ler, çok soylu farklılaşma potansiyeline sahip normal tümör hücrelerinde eksprese edilmeyen bir kök hücre yüzey belirtecini ifade etmek için uyarılır 8,9.

Son veriler, peritonda yayılım olarak görselleştirilen uykudaki over (O)CSC'lerin kalıcılığının, tekrarlayan tümörler olarak rejenerasyonları ile ilişkili olduğunu göstermiştir10. OCSC'lerin moleküler ve biyolojik özelliklerinin anlaşılması, bu hücrelerin etkili bir şekilde hedeflenmesine ve eradikasyonuna izin verebilir ve bu da potansiyel tümör remisyonuna neden olabilir. Özellikle, CSC'lerin anjiyogenez11'deki rollerinin hücresel ve moleküler mekanik özellikleri hakkında çok az şey bilinmektedir. Bu nedenle, bu protokolde, klinik ortamda metastatik bölgedeki CSC'lerin ve endotel hücrelerinin tümör mikroortamını taklit edebilen ko-kültür modelini kullanarak endotel hücrelerinin anjiyojenik özelliğini araştırmak için in vitro ortamda hasta kaynaklı OCSC'ler kullandık. Nihayetinde, neovaskülarizasyon, tümör büyümesini ve metastazını desteklemek için gerekli kritik bir süreç oluşturduğundan, mekanizmasının daha iyi anlaşılması, metastatik bölgedeki OKSK'ler için yeni bir hedefleme tedavisinin geliştirilmesine izin verecektir.

Burada, CSC'leri çevreleyen neovaskülarizasyon adımını zaman çizelgesinde görselleştirmek için bir protokol sunuyoruz. Protokolün avantajı, 3D ko-kültür sistemi NICO-1 kullanılarak tamamen tekrarlanabilir araştırmalara izin vermeyi içerir, böylece endotel hücre anjiyogenezi sırasında OKSC kaynaklı tümör başlatma yeteneğinin hastalar üzerindeki etkilerinin gözlemlenmesine izin verir.

Protokol

Tüm prosedürler insan refahı için Etik Kurul tarafından onaylanan protokol kapsamında gerçekleştirilmiştir. Tüm hastalar, örneklerinin araştırma kullanımı için yazılı bilgilendirilmiş onam verdiler ve bu çalışma için dokuların toplanması ve kullanılması, Teikyo Üniversitesi İnsan Genomu, Gen Analizi Araştırma Etik Kurulu tarafından onaylandı.

1. Yumurtalık kanseri kök hücrelerinin (OKSK) izolasyonu ve kültürü Yumurtalık kanseri ve asit hastalarından seviye 2 biyogüvenlik kabininde

  1. Kanser kök hücrelerini, parasentez yoluyla elde edilen insan yumurtalık kanseri asitlerinden izole edin. Yeterli sayıda kanser kök hücresi almak için hastalardan en az 100-250 mL asit toplayın. Ek olarak, kanser kök hücre belirteçlerinin (yani, EpCAM, Calretinin, CD133, CD44, CD45, ALDH1 ve Oct4) ve yumurtalık kanseri belirteçlerinin (pAX-8, WT-1) ekspresyon profillerini akış sitometrisi ile değerlendirin.
    1. İnsan yumurtalık kanseri asitlerini asit aspirasyonundan sonra 24 saat içinde oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj edin.
    2. Süpernatantı çıkarın ve 2 mL OCSC ortamı ve 8 mL% 30 Histodenz / fosfat tamponlu salin (PBS, pH 7.4) çözeltisi ekleyin.
    3. OCSC ortamını hazırlayın: StemPro hESC takviyesi, L-glutamin (GlutaMAX ortamı) ile DMEM⁄F-12,% 25 BSA, 100 μM 2-merkaptoetanol, 8 ng / mL FGF BASIC, 10 μM insülin ve 20 μM Y-27632.
    4. 15 mL'lik bir tüpte 1.1.2 adımında hücre çözeltisine 2 mL OCSC ortamını dikkatlice yerleştirin ve frenlemeden sallanan kova rotorunda oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj yapın.
    5. OCSC tabakasını (interfazda bozulmadan) transfer pipeti ile dikkatlice yeni bir 15 mL tüpe aktarın.
    6. 15 mL'ye kadar PBS ile doldurun. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj yapın ve süpernatanı çıkarın.
    7. Hücre peletini OCSC ortamında yeniden askıya alın ve ultra düşük tutturmalı bir kültür kabına tohumlayın; kültürler %5 CO2 ile 37 °C'de tutulmalıdır.
    8. Ortamı her üç günde bir değiştirin. Kültür tabağını yaklaşık 1 dakika boyunca dikkatlice bekletin ve süpernatantın bir kısmını atın ve yeni ortamı ekleyin.
  2. CSC'lerin geçişi
    1. OCSC'leri 15 mL'lik bir tüpte toplayın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj yapın.
    2. Süper natantı çıkarın, PBS ile doldurun ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj yapın.
    3. Süpernatanı çıkarın, proteolitik ve kollajenolitik enzimlerden (örneğin, AccuMax) oluşan hücre ayrılma çözeltisinin 1 mL'sini ekleyin ve 10 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
    4. Pipetleme yaparak iyice karıştırın ve 5 dakika boyunca 37 °C'de inkübe edin. Hücrelerin tek bir süspansiyonda olduğundan emin olun.
    5. Pipetleme yaparak iyice karıştırın, PBS ile doldurun ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yapın.
    6. Süpernatantı çıkarın ve ultra düşük ataşmanlı kültür kaplarında daha sonra tohumlama ve% 5 CO2'de 37 ° C'de bakım için OCSC ortamında hücre peletini yeniden askıya alın.

2. HUEhT-1 endotel hücre kültürü

  1. HUEhT-1 hücrelerinin geçişi
    1. HUEhT-1 kültür kabından besini çıkarın ve hücreleri PBS ile yıkayın.
    2. 1 mL% 0.025 tripsin ekleyin ve oda sıcaklığında 3 dakika kuluçkaya yatırın.
    3. 5 mL Endotel Hücre Büyüme Ortamı 2 ekleyin, hücreleri 15 mL'lik bir tüpte toplayın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj yapın.
    4. Süpernatanı çıkarın, hücre peletini HUEhT-1 ortamında yeniden askıya alın ve hücreleri kollajen kaplı kültür kaplarına tohumlayın, ardından% 5 CO2'de 37 ° C'de bakım yapın.
    5. Ortamı her üç günde bir değiştirin.

3. HUEhT-1 hücreleri kullanılarak tüp oluşum testi için NICO-1 Kokültür Plakasının hazırlanması

  1. NICO-1'i ve kaplamayı hücre dışı matris bazlı hidrojel (Matrigel Matrix) ile birleştirin.
    1. Üreticinin talimatlarını izleyerek NICO-1'in bir tarafını monte edin ve buz üzerinde tutun.
    2. NICO-1'in yüzeyini 300 μL soğuk PBS ile örtün ve ardından tamponu çıkarın.
    3. 300 μL soğutulmuş hücre dışı matris bazlı hidrojel ekleyin ve 60 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
    4. Dengelemek için filtreyi %100 etanol ile batırın, ardından 13 mm'lik bir ICCP Filtresini (0,6 μm) PBS ile 1 dakika yıkayın.
    5. Hem ana gövde parçaları A (sağ oda) hem de B (sol oda) dahil olmak üzere NICO-1'i, O halkası ve dengeli filtre ile birlikte monte edin.

4. HUEhT-1 Hücrelerinin ve CSC'lerin NICO-1 sistemine tohumlanması

  1. Hücre monokatmanlarını tripsinize ederek ve endotel hücre büyüme ortamındaki hücreleri% 2 fetal buzağı serumu ile yeniden askıya alarak HUEhT-1 hücre süspansiyonlarını hazırlayın.
  2. Her hücre dışı matris bazlı hidrojel kaplı kuyuya 1,2 mL hücre süspansiyonu (1,5 x 105 hücre) ekleyin.
  3. Diğer kuyuya beş gün boyunca kültürlenmiş 1,5 mL OCSC ekleyin.
  4. NICO-1'i 37 °C'de% 5 CO2'de inkübe edin; Mikroskop altında tüp oluşumu ve dal sayısı ile ölçülen hücre dışı matris bazlı hidrojel üzerinde ağ oluşumu gözlenebilir.

Sonuçlar

Cerrahi veya parasentez sırasında ilerlemiş yumurtalık kanseri olan hastalardan elde edilen asit sıvılarını, sferoidler için uzun süreli stabil bir kültür gerçekleştirmek amacıyla topladık. Burada, CSC1 ve CSC2 olarak adlandırılan yumurtalık CSC'lerinin uzun süreli sferoid kültürü vakalarını sunuyoruz. Her iki hücre hattı da aynı tanı ve histolojik profilleri taşır. OKSK'leri çevreleyen endotel hücrelerinin neovaskülarizasyonunu indüklemek için gerekli ...

Tartışmalar

Sunulan protokol, OCSC'lerin tümör mikroçevresinin in vitro bir ortamda nasıl taklit edileceğini açıklamaktadır. Yöntemin birincil bileşeni, dolaylı bir Transwell ortak kültür sistemi olan NICO-1 sistemi kullanılarak elde edilen yüksek oranda tekrarlanabilir kokültür modelini oluşturur. Şu anda mevcut olan kokültür modellerinin çoğu, doğrudan hücre-hücre temasının kokültürlenmiş hücre popülasyonları üzerindeki etkilerini incelemektedir 12,13,14,15,16,17,18.<...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, Japonya Eğitim, Bilim ve Kültür Bakanlığı'ndan Bilimsel Araştırma C (K.N.'ye hibe no. 19K09834) tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
0.025% Trypsin ThermoR001100
10 mL PipetThermo170356N
1250 µL Pipet tipQSPT112XLRS-Q
15 mL tubeNunc339650
200 µL Pipet tipQSPT110RS-NEW
2-MercaptoethanolThermo (Gibco)21985023
5 mL PipetThermo170366N
50 mL tubeCorning430290
AccuMAXInnovative Cell TechnologiesAM105
BioCoatTM Collagen I 60mm DishCorning356401
CentrifugeKUBOTA2800
Costar 6 Well Clear Flat Bottom Ultra Low Attachment Multiple Well PlatesCorning3471
Endothelial Cell Growth Medium 2 PromoCellC-22011 
EthanolWAKO057-00456
FGF-BasicThermo (Gibco)PHG0021
HistodenzSIGMAD2158
HUEhT-1 cellJCRB Cell BankJCRB1458
ICCP Filter 0.6 µmGinrei Lab.2525-06
Insulin, humanSIGMA (Roche)11376497001
LuminometerPerkinElmerARVO MX-flad
Matrigel MatrixCorning356234
MicroscopeYokogawaCQ-1
NICO-1Ginrei Lab.2501-02
OptiPlate-96PerkinElmer6005290
P1000 PipetGilsonF123602
P200 PipetGilsonF123601
PBSThermo (Gibco)14190-144
StemPro hESC SFMThermo (Gibco)A1000701
Transfer PipetFALCON357575
Y-27632WAKO253-00513

Referanslar

  1. Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA, a Cancer Journal for Clinicians. 68, 394-424 (2018).
  2. Lengyel, E. Ovarian cancer development and metastasis. American Journal of Pathology. 177 (3), 1053-1064 (2010).
  3. Lytle, N. K., Barber, A. G., Reya, T. Stem cell fate in cancer growth, progression and therapy resistance. Nature Reviews Cancer. 18 (11), 669-680 (2018).
  4. Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes and Development. 17 (10), 1253-1270 (2003).
  5. Lonardo, E., et al. Nodal/Activin signaling drives selfrenewal and tumorigenicity of pancreatic cancer stem cells and provides a target for combined drug therapy. Cell Stem Cell. 9 (5), 433-446 (2011).
  6. Ricci-Vitiani, L., et al. Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells. Nature. 445 (7123), 111-115 (2007).
  7. Ohata, H., et al. Induction of the stem-like cell regulator CD44 by Rho kinase inhibition contributes to the maintenance of colon cancer-initiating cells. Cancer Research. 72 (19), 5101-5110 (2012).
  8. Ishiguro, T., et al. Establishment and characterization of an in vitro model of ovarian cancer stem-like cells with an enhanced proliferative capacity. Cancer Research. 76 (1), 150-160 (2016).
  9. Singh, S. K., et al. Identification of a cancer stem cell in human brain tumors. Cancer Research. 63 (18), 5821-5828 (2003).
  10. Zong, X., Nephew, K. P. Ovarian cancer stem cells: role in metastasis and opportunity for therapeutic targeting. Cancers (Basel). 11 (7), 934 (2019).
  11. Lizárraga-Verdugo, E., et al. Cancer stem cells and its role in angiogenesis and vasculogenic mimicry in gastrointestinal cancers. Frontiers in oncology. 10, 413 (2020).
  12. Renaud, J., Martinoli, M. G. Development of an insert co-culture system of two cellular types in the absence of cell-cell contact. Journal of Visualized Experiments. (113), e54356 (2016).
  13. Richardson, S. M., et al. Intervertebral disc cell-mediated mesenchymal stem cell differentiation. Stem Cells. 24 (3), 707-716 (2006).
  14. Plotnikov, E. Y., et al. Cell-to-cell cross-talk between mesenchymal stem cells and cardiomyocytes in co-culture. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 12 (5), 1622-1631 (2008).
  15. Sheng, H., et al. A critical role of IFN-gamma in priming MSC-mediated suppression of T cell proliferation through up-regulation of B7-H1. Cell Research. 18 (8), 846-857 (2008).
  16. Csaki, C., Matis, U., Mobasheri, A., Shakibaei, M. Co-culture of canine mesenchymal stem cells with primary bone-derived osteoblasts promotes osteogenic differentiation. Histochemistry and Cell Biology. 131 (2), 251-266 (2009).
  17. Aguirre, A., Planell, J. A., Engel, E. Dynamics of bone marrow-derived endothelial progenitor cell/mesenchymal stem cell interaction in co-culture and its implications in angiogenesis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 400 (2), 284-291 (2010).
  18. Proffen, B. L., Haslauer, C. M., Harris, C. E., Murray, M. M. Mesenchymal stem cells from the retropatellar fat pad and peripheral blood stimulate ACL fibroblast migration, proliferation, and collagen gene expression. Connective Tissue Research. 54 (1), 14-21 (2013).
  19. Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level. Journal of the Royal Society & Interface. 11 (96), 20140065 (2014).
  20. De Palma, M., Biziato, D., Petrova, T. Microenvironmental regulation of tumour angiogenesis. Nature Reviews Cancer. 17, 457-474 (2017).
  21. Burger, R., et al. Incorporation of bevacizumab in the primary treatment of ovarian cancer. New England Journal of Medicine. 365, 2473-2483 (2011).
  22. Goel, H., Mercurio, A. VEGF targets the tumour cell. Nature Reviews Cancer. 13, 871-882 (2013).
  23. Yu, L., et al. Interaction between bevacizumab and murine VEGF-A: a reassessment. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 49 (2), 522-527 (2008).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyolojiSay 166yumurtal k kanseriasitkanser k k h cresivask ler niko k lt ranjiyogenez

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır