المجهر الإلكتروني المتسلسل لمسح الوجه الكتلي (SBF-SEM) لعينات الأنسجة البيولوجية

Summary

يحدد هذا البروتوكول طريقة روتينية لاستخدام المجهر الإلكتروني للمسح التسلسلي لوجه الكتلة (SBF-SEM)، وهي تقنية تصوير ثلاثية الأبعاد قوية. يعتمد التطبيق الناجح ل SBF-SEM على تقنيات التثبيت وتلطيخ الأنسجة المناسبة ، بالإضافة إلى النظر بعناية في إعدادات التصوير. ويتضمن هذا البروتوكول اعتبارات عملية لهذه العملية برمتها.

Abstract

يسمح المجهر الإلكتروني المتسلسل لمسح الوجه الكتلي (SBF-SEM) بجمع مئات إلى آلاف الصور فائقة الهيكلة المسجلة بشكل متسلسل ، مما يوفر رؤية ثلاثية الأبعاد غير مسبوقة لاستئصال الأنسجة الدقيقة. في حين شهدت SBF-SEM زيادة هائلة في الاستخدام في السنوات الأخيرة ، فإن الجوانب التقنية مثل إعداد الأنسجة السليمة ومعلمات التصوير لها أهمية قصوى لنجاح طريقة التصوير هذه. يستفيد نظام التصوير هذا من الطبيعة الآلية للجهاز ، مما يسمح للمرء بترك المجهر دون مراقبة أثناء عملية التصوير ، مع إمكانية جمع مئات الصور تلقائيا في يوم واحد. ومع ذلك، دون إعداد الأنسجة المناسبة البنية الفوقية الخلوية يمكن تغييرها بطريقة يمكن استخلاص استنتاجات غير صحيحة أو مضللة. وبالإضافة إلى ذلك، يتم إنشاء الصور عن طريق مسح الوجه الكتلي لعينة بيولوجية مضمنة في الراتنج، وهذا غالبا ما يمثل تحديات واعتبارات يجب معالجتها. تراكم الإلكترونات داخل الكتلة أثناء التصوير، والمعروفة باسم "شحن الأنسجة"، يمكن أن يؤدي إلى فقدان التباين وعدم القدرة على تقدير الهيكل الخلوي. وعلاوة على ذلك، في حين أن زيادة كثافة شعاع الإلكترون / الجهد أو خفض سرعة مسح شعاع يمكن أن تزيد من دقة الصورة، وهذا يمكن أن يكون أيضا الآثار الجانبية المؤسفة من إتلاف كتلة الراتنج وتشويه الصور اللاحقة في سلسلة التصوير. هنا نقدم بروتوكول روتيني لإعداد عينات الأنسجة البيولوجية التي تحافظ على البنية الفوقية الخلوية ويقلل من شحن الأنسجة. كما نقدم اعتبارات التصوير للحصول السريع على صور تسلسلية عالية الجودة مع الحد الأدنى من الضرر لكتلة الأنسجة.

Introduction

تم وصف المجهر الإلكتروني (SBF-SEM) لأول مرة من قبل Leighton في عام 1981 حيث صمم مجهرا إلكترون المسح الضوئي معززا بفغر صغير مدمج يمكن أن يقطع ويصور أقساما رقيقة من الأنسجة المضمنة في الراتنج. لسوء الحظ، القيود التقنية حصرت استخدامه في العينات التوصيلية، حيث تراكمت عينات غير موصلة مثل الأنسجة البيولوجية مستويات غير مقبولة من الشحن (تراكم الإلكترون داخل عينة الأنسجة)¹. في حين طلاء كتلة الوجه بين التخفيضات مع الكربون المتبخر خفض شحن الأنسجة، وهذا الوقت زيادة كبيرة في اقتناء التصوير وتخزين الصور ظلت مشكلة كما تكنولوجيا الكمبيوتر في ذلك الوقت لم تكن كافية لإدارة أحجام الملفات الكبيرة التي أنشأها الجهاز. تمت إعادة النظر في هذه المنهجية من قبل دنك وهورستمان في عام 2004 باستخدام SBF-SEM مجهزة بغرفة ضغط^{متغيرة 2}. وقد سمح ذلك بإدخال بخار الماء إلى غرفة التصوير مما يقلل من الشحن داخل العينة ، مما يجعل تصوير العينات غير التوصيلية قابلا للتطبيق وإن كان مع فقدان دقة الصورة. مزيد من التحسينات في إعداد الأنسجة وطرق التصوير تسمح الآن للتصوير باستخدام فراغ عالية، والتصوير SBF-SEM لم يعد يعتمد على بخار الماء لتبديل الشحن^{3،4،5،6،7،8،9}. في حين شهدت SBF-SEM زيادة هائلة في الاستخدام في السنوات الأخيرة ، فإن الجوانب التقنية مثل إعداد الأنسجة السليمة ومعلمات التصوير لها أهمية قصوى لنجاح طريقة التصوير هذه.

SBF-SEM يسمح لجمع الآلي من الآلاف من الصور المجهر الإلكتروني المسجلة تسلسليا، مع قرار مستو صغيرة مثل 3-5 نانومتر^10،11. يتم وضع الأنسجة، المشربة بالمعادن الثقيلة والمضمنة في الراتنج، داخل المجهر الإلكتروني المسح الضوئي (SEM) التي تحتوي على بروتين فائق مزود بسكين الماس. يتم قطع سطح مستو بسكين الماس ، ويتم سحب السكين ، ويتم مسح سطح الكتلة في نمط النقطية مع شعاع الإلكترون لإنشاء صورة للبنية فوقية الأنسجة. ثم يتم رفع الكتلة كمية محددة (على سبيل المثال، 100 نانومتر) في المحور z، والمعروفة باسم "خطوة z"، ويتم قطع سطح جديد قبل تكرار العملية. وبهذه الطريقة يتم إنتاج كتلة ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) من الصور أثناء قطع الأنسجة. يستفيد نظام التصوير هذا بشكل أكبر من الطبيعة الآلية للجهاز ، مما يسمح للمرء بترك المجهر دون مراقبة أثناء عملية التصوير ، مع إمكانية جمع مئات الصور تلقائيا في يوم واحد.

في حين أن التصوير SBF-SEM يستخدم في المقام الأول الإلكترونات المكثرة لتشكيل صورة لوجه الكتلة ، يتم إنشاء الإلكترونات الثانوية أثناء عملية التصوير¹². يمكن أن تتراكم الإلكترونات الثانوية ، إلى جانب الإلكترونات المكبتة والحزمة الأولية التي لا تفلت من الكتلة ، وتنتج "شحن الأنسجة" ، مما يمكن أن يؤدي إلى حقل كهربائي محلي في وجه الكتلة. يمكن أن يشوه تراكم الإلكترون هذا الصورة أو يتسبب في إخراج الإلكترونات من الكتلة والمساهمة في الإشارة التي يجمعها كاشف الرواصد الخلفي ، مما يقلل من نسبة الإشارة إلى الضوضاء^13. في حين يمكن خفض مستوى شحن الأنسجة عن طريق تقليل الجهد شعاع الإلكترون أو كثافة، أو تقليل وقت الإسهاب شعاع، وهذا يؤدي إلى انخفاض نسبة الإشارة إلى الضوضاء¹⁴. عندما يتم استخدام شعاع إلكترون من الجهد المنخفض أو الكثافة ، أو يسمح للشعاع فقط بالسكن داخل كل مساحة بكسل لفترة أقصر من الزمن ، يتم إخراج الإلكترونات الأقل تشتتا من الأنسجة والتقاطها بواسطة كاشف الإلكترونات مما يؤدي إلى إشارة أضعف. تعامل دنك وهورستمان مع هذه المشكلة من خلال إدخال بخار الماء إلى الغرفة ، وبالتالي تقليل الشحن في الغرفة وعلى وجه الكتلة على حساب دقة الصورة. مع ضغط غرفة من 10-100 السلطة الفلسطينية، وتناثر جزء من شعاع الإلكترون المساهمة في ضوضاء الصورة وفقدان الدقة، ولكن هذا ينتج أيضا أيونات في غرفة العينة التي تحييد تهمة داخل كتلة العينة². أساليب أكثر حداثة لتحييد تهمة داخل كتلة عينة استخدام حقن الغاز البؤري من النيتروجين على كتلة الوجه أثناء التصوير، أو إدخال الجهد السلبي إلى مرحلة SBF-SEM لتقليل طاقة المسبار شعاع الشحن وزيادة^إشارةجمعت 6^،7،15. بدلا من إدخال التحيز المرحلة، ضغط الغرفة أو حقن النيتروجين المترجمة لتقليل تراكم تهمة على سطح الكتلة، فمن الممكن أيضا لزيادة الموصلية من الراتنج عن طريق إدخال الكربون إلى مزيج الراتنج السماح لإعدادات التصوير أكثر عدوانية¹⁶. البروتوكول العام التالي هو تكييف لبروتوكول Deerinck et al. الذي نشر في عام 2010 ويغطي التعديلات على منهجيات إعداد الأنسجة والتصوير التي وجدناها مفيدة لتقليل شحن الأنسجة مع الحفاظ على اكتساب صورة عالية الدقة^3و17و^18و19. في حين أن البروتوكول المذكور سابقا ركز على معالجة الأنسجة وتلقيح المعادن الثقيلة ، يوفر هذا البروتوكول نظرة ثاقبة في سير عمل التصوير وتحليل البيانات وإعادة الإعمار المتأصل في دراسات SBF-SEM. في مختبرنا، تم تطبيق هذا البروتوكول بنجاح واستنساخ على مجموعة واسعة من الأنسجة بما في ذلك القرنية وهياكل الجزء الأمامي، الجفن، الغدة الكظرية والأصعب، شبكية العين والعصب البصري، القلب، الرئة والمجرى الهوائي، الكلى، الكبد، عضلة كريماستر، والقشرة الدماغية / النخاع، وفي مجموعة متنوعة من الأنواع بما في ذلك الماوس، الفئران، الأرانب، خنزير غينيا، الأسماك، أحادي الطبقة وثقافات الخلايا الطبقية، الخنزير، الرئيسيات غير البشرية، وكذلك الإنسان^{20،21،22،23}. في حين أن التغييرات الصغيرة قد تكون جديرة بالاهتمام بالنسبة لأنسجة وتطبيقات محددة ، فقد أثبت هذا البروتوكول العام أنه قابل للاستنساخ ومفيد للغاية في سياق منشأة التصوير الأساسية لدينا.

Protocol

تم التعامل مع جميع الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية الموصوفة في بيان جمعية البحوث في الرؤية وطب العيون لاستخدام الحيوانات في أبحاث الرؤية وطب العيون وكلية هيوستن للمبادئ التوجيهية للتعامل مع الحيوانات البصريات. تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل المؤسسات التي تم التعامل معها: الماوس والجرذ والأرنب وخنزير غينيا ، وتمت الموافقة على إجراءات الرئيسيات غير البشرية من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات في جامعة هيوستن ، وتمت الموافقة على إجراءات حمار وحشي من قبل لجنة رعاية الحيوان واستخدامه في جامعة ديباو ، ووافقت لجنة رعاية واستخدام الحيوانات في كلية بايلور للطب. وقد عولجت جميع الأنسجة البشرية وفقا لإعلان هلسنكي فيما يتعلق بالبحوث المتعلقة بالأنسجة البشرية وتم الحصول على موافقة مجلس المراجعة المؤسسية المناسبة.

1. معالجة الأنسجة

1. إعداد محلول الأسهم من 0.4 M صوديوم cacodylate العازلة عن طريق خلط مسحوق cacodylate الصوديوم في ddH₂O. مزيج تماما العازلة وHH ضبط الحل إلى 7.3. يستخدم هذا المخزن المؤقت لجعل مثبت (تكوين الموضحة أدناه في الخطوة 1.3)، المخزن المؤقت الغسيل، وكذلك حلول الأوسميوم والبوتاسيوم ferrocyanide.
   ملاحظة: تثبيت Perfusion غالبا ما يكون أفضل طريقة لتثبيت الدراسات SBF-SEM، كما التثبيت يحدث بسرعة وفي جميع أنحاء الجسم. إذا لم يكن تثبيت التغلغل ممكنا في تصميم الدراسة، فتخطى الخطوة 1.3.
2. تنفيذ تثبيت التشوه مع الضغط الفسيولوجي المناسب لنموذج الحيوان^24،25،26. ويتم ذلك عن طريق التشوه التسلسلي عبر القلب مع محلول ملحي مهجر يليه مثبت ، يتم وضع كل منها على ارتفاع محدد (على سبيل المثال ، 100 سم) فوق الكائن الحي (مناسب للضغط الفسيولوجي لنظام الأوعية الدموية في النموذج الحيواني) ، مع تدفق مثبت إلى البطين الأيسر ، والخروج من شق في الأذين الأيمن. سوف تصبح الأنسجة ذات الاهتمام شاحبة حيث يتم استبدال الدم بتثبيت ، إذا لم يبيض كل أو جزء من الأنسجة الخاصة بك ، فقد لا تكون الأنسجة ثابتة بشكل مناسب وقد لا يتم الحفاظ على البنية الفوقية.
3. استخدم شفرة حلاقة أو مشرط حاد لتقليم عينات الأنسجة إلى كتل لا يزيد حجمها عن 2 مم × 2 مم × 2 مم. إذا تم تخطي الخطوة 1.2، قم بذلك بسرعة بحيث يمكن إصلاح الأنسجة في أسرع وقت ممكن.
   1. بدلا من ذلك، تشريح الأنسجة تحت المثبت ونقلها إلى مثبت جديد لإكمال عملية الغمر. التركيب النهائي للمثبت يتكون من 0.1 M صوديوم cacodylate العازلة التي تحتوي على 2.5٪ الغلوتارالدهيد و 2 MM كلوريد الكالسيوم. السماح التثبيت المضي قدما لمدة لا تقل عن 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة والحد الأقصى لليلة واحدة في 4 °C. إذا كان ذلك ممكنا، استخدم لوحة الروك / الميل للتحريض بلطف العينات أثناء تحديد.
   2. بدلا من ذلك، إذا كان الميكروويف العاكس متوفرا، قم بإصلاح الأنسجة في المثبت المذكور أعلاه تحت الفراغ عند 150 واط لمدة 4 دورات من دقيقة واحدة، و1 دقيقة. تثبيت الميكروويف هو الطريقة المفضلة للخطوة 1.3 لأنه يصلح بسرعة الأنسجة ويحافظ على البنية الفوقية للأنسجة²⁷.
      ملاحظة: لا ينبغي السماح للأنسجة بالجفاف خلال هذا البروتوكول، وينبغي توخي الحذر لنقل الأنسجة بسرعة من محلول إلى آخر.
4. غسل الأنسجة الثابتة 5x لمدة 3 دقائق لكل منهما (مجموع 15 دقيقة) في درجة حرارة الغرفة في 0.1 M صوديوم cacodylate العازلة التي تحتوي على 2 mM كلوريد الكالسيوم.
5. جعل محلول أوسميوم ferrocyanide التالية الطازجة، ويفضل خلال خطوات غسل السابقة. الجمع بين محلول 2 أكسيد الأوسميوم 4٪ (أعدت في DDH₂O) مع حجم متساو من 3٪ فيروكيانيد البوتاسيوم في 0.2 M cacodylate العازلة مع كلوريد الكالسيوم 4 MM. بعد خطوة الغسيل السابقة، ضع الأنسجة في هذا المحلول لمدة ساعة واحدة على الجليد في الظلام، وفي غطاء الدخان.
   ملاحظة: تيج أكسيد الأوسميوم هو مادة بلورية صفراء تأتي في أمبول. لإنشاء محلول tetroxide osmium، الكراك فتح أمبول، إضافة ddH₂O، و sonicate لمدة 3-4 ساعات في الظلام حتى يتم حل البلورات تماما. محلول تيج أكسيد الأوسميوم هو حل أصفر واضح ، إذا كان الحل أسود فقد تم تقليل الأوسميوم ويجب ألا يستخدم بعد الآن.
6. في حين أن النسيج هو احتضان في محلول فيروكيانيد أوسميوم، والبدء في إعداد محلول ثيوكاربوهيدرازيد (TCH). إعداد هذا الحل الطازجة ويكون ذلك متاحة بسهولة في نهاية فترة تثبيت أوسميوم ferrocyanide 1 ساعة. الجمع بين 0.1 غرام من ثيوكاربوهيدرازايد مع 10 مل من DDH₂O ووضع هذا الحل في فرن 60 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. لضمان حل الحل، قم بتدفيره برفق كل 10 دقائق. قبل الاستخدام، قم بتصفية هذا الحل من خلال فلتر حقنة 0.22 ميكرومتر.
7. قبل احتضان في TCH، وغسل الأنسجة مع درجة حرارة الغرفة ddH₂O 5x لمدة 3 دقائق لكل منهما (15 دقيقة المجموع).
8. ضع الأنسجة في محلول TCH المصفى لمدة إجمالية قدرها 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة(الشكل 1A-C).
9. بعد الحضانة في TCH، اغسل الأنسجة 5x لمدة 3 دقائق لكل منها (إجمالي 15 دقيقة) في درجة حرارة الغرفة ddH₂O.
10. ضع الأنسجة في DDH₂O التي تحتوي على 2٪ من التيتروكسيد أوسميوم (وليس الأوسميوم خفضت مع فيروكيانيد البوتاسيوم) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. وينبغي أن يتم ذلك في غطاء الدخان وفي الظلام كما يمكن تخفيض osmium بواسطة الضوء (على سبيل المثال، تحت رقائق الألومنيوم) (الشكل 1D-F).
11. بعد حضانة أكسيد الأوسميوم، اغسل الأنسجة 5x لمدة 3 دقائق لكل منها (إجمالي 15 دقيقة) في درجة حرارة الغرفة ddH₂O.
12. ضع الأنسجة في 1٪ خلات أورانيل مائي (مسحوق خلات أورانيل مختلطة في ddH₂O) بين عشية وضحاها في ثلاجة عند 4 درجة مئوية.
13. قبل إزالة الأنسجة من الثلاجة، قم بإعداد محلول الأسبارتات الرصاصي الطازج لوالتون. ابدأ بحل 0.066 غرام من نترات الرصاص في 10 مل من محلول حمض الأسبارتيك 0.03 M (0.04 غرام من حمض الأسبارتيك في 10 مل من الماء المقطر) وضبط درجة الحموضة إلى 5.5 مع 1 N KOH (0.5611 غرام في 10 مل من الماء المقطر).
    تنبيه: يمكن أن يتشكل عجل عند ضبط درجة الحموضة. هذا غير مقبول.
    1. باستخدام شريط تحريك، إضافة ببطء 1 N KOH دروبوايز أثناء رصد pH. سخني مسبقا محلول الأسبارتات الرصاصي الواضح النهائي في فرن 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. إذا كان التعجيل يشكل الحل لا يمكن استخدامها ويجب إعداد حل آخر.
14. إزالة الأنسجة من الثلاجة وغسل 5x لمدة 3 دقائق لكل منهما (15 دقيقة المجموع) في درجة حرارة الغرفة ddH₂O.
15. بعد الغسيل، ضع الأنسجة في محلول الأسبارتات الرصاصي الدافئ ل والتون لمدة 30 دقيقة مع الحفاظ على درجة الحرارة عند 60 درجة مئوية.
16. بعد الحضانة في aspartate الرصاص والتون، وغسل الأنسجة 5X لمدة 3 دقائق لكل منهما (15 دقيقة المجموع) في درجة حرارة الغرفة ddH₂O (الشكل 1G-I).
17. يجفف النسيج من خلال سلسلة الأسيتون الباردة الجليد (30٪، 50٪، 70٪، 95٪، 95٪، 100٪، 100٪، و 100٪ الأسيتون (في ddH₂O حيثما ينطبق ذلك) مما يسمح 10 دقائق لكل خطوة في هذه السلسلة.
18. بعد سلسلة الجفاف البارد، ضع الأنسجة في الأسيتون في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
    1. خلال هذا الوقت، صياغة تضمين 812 ACM الراتنج. استخدام وصفة "المزيج الصلب" كما هو أكثر مقاومة للضرر شعاع. خلط الراتنج جيدا، ووضع الأنسجة في تضمين 812:الأسيتون (1:3 مزيج) لمدة 4 ساعات، تليها تضمين 812:الأسيتون (1:1 مزيج) لمدة 8 ساعات أو بين عشية وضحاها، وأخيرا تضمين 812:الأسيتون (3:1 مزيج) بين عشية وضحاها. قم بتنفيذ خطوات تسلل الراتنج هذه في درجة حرارة الغرفة.
19. في اليوم التالي، ضع الأنسجة في تضمين 100٪ 812 لمدة 4-8 ساعات، ثم في تضمين 812 100٪ الطازجة بين عشية وضحاها، وأخيرا في تضمين 100٪ جديدة 812 لمدة 4 ساعات. قم بتنفيذ خطوات تسلل الراتنج هذه في درجة حرارة الغرفة.
    1. قبل التضمين مباشرة، ضع كمية صغيرة من الراتنج في حاوية خلط واخلط ببطء (يمكن استخدام عصا خشبية للإثارة) في مسحوق أسود كربوني حتى تشبع الراتنج بالمسحوق ولكنه لا يزال سائلا ولا يصبح محببا. وينبغي أن تشبه الحبر السميك وتكون قادرة على بالتنقيط ببطء من عصا خشبية دون كتل مرئية.
20. توجيه عينات الأنسجة في قالب مطاطي السيليكون واتخاذ صورة بحيث يتم تسجيل اتجاه العينة داخل كتلة الراتنج ويمكن الرجوع إليها. تغطية العينات في الكربون الأسود المشبعة الراتنج في غيض من قالب السيليكون ووضع القالب في الفرن لمدة ~ 1 ساعة في 65 درجة مئوية.
    1. ضع القالب في منحدر لاحتواء الراتنج في طرف القالب حيث يغطي عينة الأنسجة. ضع ملصقا مع معرف عينة التجربة /الأنسجة في القالب في الطرف المقابل من الراتنج(الشكل 2A).
21. إزالة قالب السيليكون من الفرن وملء ما تبقى من القالب مع الراتنج واضحة (لا أسود الكربون) التأكد من أن التسمية لا تزال مرئية. علاج الراتنج غرست مع أسود الكربون بما فيه الكفاية لعدم خلط بسهولة مع الراتنج واضحة.
    1. إعداد بئر إضافية داخل القالب الذي لا يحتوي على الأنسجة. بدءا من بئر اضافية، وملء ما تبقى من القالب مع الراتنج واضحة.
    2. إذا بدأ الراتنج المشبع بغاز الكربون الأسود ينزف في الراتنج الواضح ، ضع قالب السيليكون مرة أخرى في الفرن لوقت إضافي (على سبيل المثال ، 15 دقيقة).
    3. مرة واحدة وقد تصدرت جميع عينات الأنسجة قبالة مع الراتنج واضحة، ووضع قالب السيليكون مرة أخرى في الفرن (شقة، لا المنحدر) في 65 درجة مئوية لمدة 48 ساعة لإكمال عملية المعالجة.

2. إعداد كتلة

ملاحظة: الأسلوب يعتمد على كيفية توجيه العينة في الكتلة وكيفية المقطع هو أن تأخذ مكان. ومع ذلك ، فإن اتجاه الأنسجة الأكثر شيوعا يجد الأنسجة المتمركزة في طرف كتلة الراتنج ، عموديا على النهاية الطويلة لكتلة الراتنج.

1. في معظم الحالات، تقليم أولا نهاية الكتلة لتحديد موقع الأنسجة عن طريق وضع كتلة العينة في تشاك microtome مع نهاية مدبب الشائكة ما يقرب من 5-6 ملم من تشاك. قفله في مكانه مع المسمار مجموعة ووضعه تحت مصباح الحرارة.
2. بعد عدة دقائق سوف تكون كتلة مرن وسهلة لتقليم. ضع تشاك في حامل المنظار المجسم واستخدم شفرة حلاقة جديدة ذات حافة مزدوجة لجعل المقاطع الرقيقة متوازية مع وجه الكتلة حتى يصبح النسيج مرئيا. وينظر إلى هذا أفضل من خلال الصيد الضوء عبر الوجه كتلة، فإن عينة الأنسجة تكون أقل عاكسة وحبيبية بالمقارنة مع تلك الأجزاء من الراتنج التي تخلو من الأنسجة. راجع الصورة الملتقطة لعينات الأنسجة قبل إدخال الراتنج المشبع الأسود الكربوني للحصول على فكرة عن كيفية ومكان وجود الأنسجة.
3. وضع حامل دبوس عينة واحد جانبا لأغراض التشذيب. هذا الدبوس حامل أبدا وضعت في غرفة SEM، وبالتالي يمكن التعامل معها دون قفازات، وهذا سوف يشار إلى حامل دبوس التشذيب. أي حامل عينة متجهة إلى وضعها في غرفة التصوير لا ينبغي أبدا أن تطرق دون قفازات. وهذا يتجنب إدخال الشحوم والزيت إلى غرفة المجهر.
4. ضع دبوس عينة الألومنيوم في حامل دبوس التشذيب وتشديد قليلا المسمار مجموعة مع الوجه (سطح مستو) من دبوس عقد 3-4mm فوق حامل دبوس.
5. جعل العديد من الخدوش العميقة، متقاطعة في وجه دبوس لتوفير مساحة أكبر للغراء المستخدمة لعقد العينة في مكانها. إذا تم استخدام دبوس الألومنيوم، ينصح مفك مسطح الصلب الصغيرة لهذه الخطوة(الشكل 2B).
6. ضع تشاك التي تحتوي على عينة الأنسجة مرة أخرى تحت مصباح الحرارة حتى يصبح الراتنج لينة ومرنة، ثم وضعه في وعاء تشاك تحت المنظار المجسم.
7. باستخدام شفرة حلاقة ذات حدين لتقليم الراتنج الزائد من جزء من كتلة الراتنج التي تحتوي على عينة الأنسجة. في نهاية المطاف حجم كتلة الأنسجة تعلق على دبوس سيكون ما يقرب من 3 ملم في القطر و 2-3 ملم في الارتفاع.
   1. ادفع ماكينة الحلاقة بعناية إلى أسفل مباشرة إلى كتلة الراتنج حوالي 1-2 مم ، ثم ادفع الحلاقة بعناية أفقيا إلى كتلة الراتنج على عمق يساوي القطع السابق. القيام بذلك ببطء وبعناية كبيرة، كما أنه من الممكن أن تلحق الضرر أو قطع جزء من كتلة تحتوي على عينة الأنسجة. كما يلتقي خفضين، فإن الراتنج الزائدة منفصلة عن الكتلة. استمر في إزالة الراتنج حتى تبقى مساحة مرفوعة 3 مم × 3 مم فقط.
8. بعد هذا التشذيب الأولي، ضع الكتلة (لا تزال في تشاك) تحت مصباح الحرارة لعدة دقائق.
9. بمجرد أن يصبح الراتنج ناعما ومرنا ، ضع الكتلة مرة أخرى تحت المنظار المجسم. باستخدام شفرة حلاقة جديدة ذات حافة مزدوجة، قطع الجزء العلوي من كتلة الراتنج، ما يقرب من 1 ملم تحت الجزء قلصت، مع قطع واحد على نحو سلس. سطح مستو هو الأفضل لأن هذا سيتم لصقها على دبوس العينة. يجب الحرص على عدم السماح للعينة لتصبح فقدت، كما تتطلب هذه الخطوة بعض القوة التي يمكن نقلها إلى الجزء إزالتها من كتلة وتسبب لها أن تطير بعيدا. ضع العينة المقطوعة والمشذبة جانبا.
10. ضع حامل دبوس التشذيب الذي يحتوي على دبوس الألومنيوم المقطوع في وعاء المنظار المجسم. تطبيق طبقة رقيقة من الغراء سيانواكريلات على الوجه دبوس بحيث يغطي تماما دبوس دون تشكيل الغضروف المفصلي مرئية. التقاط قطعة قلصت من كتلة الأنسجة مع ملقط ومكان في على الوجه دبوس. مركز عينة الأنسجة على دبوس العينة. ادفعه للأسفل واحمله لعدة ثوان. السماح للغراء لتعيين لعدة دقائق.
11. عندما يكون الغراء جاف تماما، ضع حامل دبوس التشذيب مرة أخرى تحت المنظار المجسم. باستخدام ملف غرامة، ملف بعيدا الراتنج الزائد بحيث لا الراتنج هو معلقة دبوس. يجب أن يشبه شكل الراتنج رأس الدبوس الدائري.
12. تحديد موقع الأنسجة على الجزء الذي أثار من كتلة الراتنج الخاص بك، والإضاءة المائلة مفيدة لهذا الغرض. باستخدام شفرة حلاقة ذات حافة مزدوجة ، يجب أن يتم تشذيب الجزء المرفوع من الراتنج الذي يحتوي على عينة الأنسجة إلى منطقة لا تزيد عن 1 مم^2. إذا كان ذلك ممكنا، يمكن قلصت كتلة الوجه حتى أصغر، وهذا سوف يقلل من الضغط على سكين الماس وتحسين طول العمر.
    1. إزالة الراتنج الزائد قدر الإمكان، وترك كتلة أطول قليلا في بعد واحد. ويتم ذلك ببطء وبعناية، حيث أنه من الممكن للراتنج الذي يحتوي على عينة الأنسجة أن ينفصل إذا تم تطبيق الكثير من القوة. في حين ينصح الحلاقة، يمكن استخدام ملف معدني غرامة لهذه الخطوة.
13. مع زاوية ملف معدني غرامة الراتنج الزائد، في المنطقة خارج الجزء الذي أثار يحتوي على عينة الأنسجة، وصولا الى حافة دبوس(الشكل 2C).
14. إزالة جزيئات الراتنج والغبار من العينة المعدة قبل تطبيق الطلاء الفضي تليها الذهب البصق. مزيج الفضة مع الأسيتون بحيث يكون السائل يمكن نشرها بسهولة، أقرب إلى طلاء الأظافر (ولكن ليس رقيقة بحيث يقطر الخروج من قضيب) وتطبيق معطف رقيقة على سطح كتلة العينة بأكملها. أسيتون يتبخر بسرعة، لذلك قد يكون من الضروري إضافة الأسيتون إضافية كما يبدأ الطلاء الفضة لسماكة.
    1. السماح للطلاء الفضة لتجف بين عشية وضحاها قبل تحميل في المجهر.
       ملاحظة: يجب أن تكون هذه الطبقة الفضية رقيقة من أجل تجنب توسيع الوجه كتلة وراء 1 مم × 1 ملم، وعلى الرغم من أن الطلاء الفضي لم يضر سكين الماس، لا يزال ينصح أصغر كتلة وجوه للحفاظ على طول العمر من سكين الماس. يجب أن يتبخر الأسيتون المختلط مع الفضة تماما قبل رش الذهب أو تحميل العينة في المجهر لتجنب إدخال بخار الأسيتون إلى غرفة التصوير.
    2. بعد تطبيق الطلاء الفضي، وتطبيق طبقة رقيقة من الذهب إلى كتلة العينة. باستخدام جهاز فراغ قياسي مجهز بهدف قياسي لرقائق الذهب ، سيؤدي ضغط الغرفة البالغ 200 مللي تور (غاز الأرجون) و 40 مللي أمبير يعمل لمدة دقيقتين إلى طلاء ذهبي سميك 20 نانومتر.
15. بعد الطلاء، ضع الكتلة المثبتة والمشذبة في أنبوب مع ملصق التجربة المناسب المرفق. إنشاء أنابيب مخصصة باستخدام ماصة نقل المتاح.
    1. قطع ماصة نقل فقط تحت لمبة، وترك جزء قصير من أنبوب نقل ماصة تعلق تحت نهاية لمبة. تقصير الجزء الأنبوبي الذي تم قطع بعيدا، وقطع تلميح ماصة مرة أخرى بما فيه الكفاية بحيث يمكن دفع دبوس عينة الألومنيوم دافئ داخله.
    2. ضع النهاية التي تحتوي على دبوس عينة الألومنيوم داخل الطرف اللامع من ماصة النقل المعدلة.
16. قبل تحميل كتلة الأنسجة المعدة، تقليم بعناية بعيدا الطلاء الفضة الزائدة من سطح الوجه كتلة.

3. إعدادات SEM لتصوير الوجه بلوك

ملاحظة: تم إنتاج إعدادات التصوير التالية على الجهاز المستخدم من قبل المؤلفين، والمدرج في جدول المواد المقدمة. في حين أن هذا الجهاز قادر على التصوير الضغط المتغير، تم التقاط أفضل النتائج تحت فراغ عالية.

1. وقت السكن: استخدم 12 ميكروجرام/بكسل أثناء المقطع التسلسلي. عندما يتم تحديد منطقة ذات أهمية، يمكن الحصول على صورة ذات دقة أعلى عند 32 ميكروجرام/بكسل.
2. إعدادات الفراغ: استخدام ضغط بندقية من 9e-008 السلطة الفلسطينية، وضغط العمود من 1.1e-004 السلطة الفلسطينية، وضغط غرفة من 9.5e-002 السلطة الفلسطينية.
3. وقت الالتقاط: مع الإعدادات المذكورة أعلاه، التقط مكدس صور 2048x2048 بكسل بمعدل 50 ثانية لكل صورة. يمكن التقاط صور ذات دقة أعلى للمناطق ذات الأهمية بمعدل 4096 × 4096 بكسل بمعدل أقل بقليل من 9 دقائق لكل صورة.
4. سمك المقطع: استخدام 100-200 نانومتر. أقل من الممكن، ولكن قد تتطلب انخفاض الجهد شعاع، وكثافة، أو يسكن الوقت.
5. الجهد العالي (HV): استخدام 7-12 كيلو فولت. في حين أن زيادة الجهد يقلل من حجم البقعة ويزيد من الدقة ، فإنه يقدم المزيد من إمكانية تلف الحزمة. ارتفاع كيلو فولت يزيد من اختراق الحزمة مما يؤدي إلى فقدان التفاصيل. ومع ذلك، خفض كيلو فولت يحط من نسبة الإشارة إلى الضوضاء (الشكل 3)¹⁴.
6. كثافة الحزمة (BI): يقدم جهاز SBF-SEM الخاص بالمؤلف مقياسا لشدة الحزم يتراوح بين 1-20. على هذا المقياس، تعطي قيم 5-7 صورا عالية الجودة دون شحن مفرط وتلف في الحزمة. كلما ارتفع BI كلما زادت الدقة ، هناك فرصة أكبر للشحن وتلف^{الحزمة 14.}
7. حجم البقعة وتكبير الصورة: تحديد حجم البقعة من خلال كثافة الحزمة ومستوى الجهد. وبشكل مثالي، يجب ألا يكون حجم النقطة أكبر من حجم البكسل المستخدم. يتم تحديد حجم البكسل بقسمة حقل العرض (FOV) على عدد وحدات البكسل. على سبيل المثال، سوف يعطي FOV 25 ميكرومتر بحجم صورة 2048x2048 بكسل 12.2 نانومتر لكل بكسل. ولذلك يجب أن لا يزيد حجم البقعة عن 12.2 نانومتر. ويبين الشكل 4 كيف ترتبط HV، BI وحجم بقعة.
8. مسافة العمل (WD) - مع تصوير الوجه الكتلي، لا يمكن ضبط مسافة العمل. إنه ببساطة عامل تركيز. وسوف تكون متطابقة تقريبا لجميع الكتل المصورة. على الرغم من أن مسافة العمل غير قابلة للتعديل، إلا أنها تلعب دورا حاسما في دقة الصورة الملتقطة. ومع انخفاض مسافة العمل، يزداد الحد الأقصى للدقة على الصور الملتقطة. في بعض الحالات قد يكون من الممكن تقليل مسافة العمل عن طريق إجراء تعديلات داخل غرفة التصوير ، ولكن يجب إجراء هذه التعديلات وفقا لتقدير المستخدم. من أجل تقليل مسافة العمل وزيادة دقة الصورة ، قمنا بتخفيف مسامير جبل الباب microtome وإعادة وضع microtome بحيث يستريح ~ 2 ملم أقرب إلى كاشف الحزمة بعد إعادة إحكام البراغي.
9. الدقة - باستخدام الإعدادات أعلاه، يمكن استخدام دقة x وy التي يصل ارتفاعها إلى 3.8 نانومتر. من المهم ملاحظة أن الدقة محدودة بحجم بقعة الحزمة بالإضافة إلى دقة البكسل لالتقاط الصورة (على سبيل المثال، حقل رؤية 20 ميكرومتر تم التقاطه في صورة بكسل 2048x2048 بدقة بكسل 9.8 نانومتر، حتى لو تم استخدام حجم بقعة 3.8 نانومتر). دقة الصورة في الطائرة z يعتمد على سمك المقطع، نجد أن 100-200 نانومتر يعمل بشكل جيد مع هذا البروتوكول.

النتائج

ماوس كورنيا
تم تطبيق هذا البروتوكول بشكل مكثف على قرنية الماوس. باستخدام التصوير SBF-SEM شبكة من حزم الألياف الدقيقة الخالية من الإيلاستين (EFMBs) تبين أن تكون موجودة داخل القرنية الماوس الكبار. وكان يعتقد في السابق أن هذه الشبكة لم تكن موجودة إلا أثناء النمو الجنيني والمبكر بعد الول?...

Discussion

الغرض من ورقة الأساليب هذه هو تسليط الضوء على منهجية إعداد الأنسجة والتصوير التي سمحت لمختبرنا بالتقاط صور المجهر الإلكتروني التسلسلي عالية الدقة بشكل موثوق ، والإشارة إلى الخطوات الحاسمة التي تؤدي إلى هذه النتيجة وكذلك المزالق المحتملة التي يمكن أن تحدث عند إجراء التصوير SBF-SEM. النجاح ب?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1/16 x 3/8 Aluminum Rivets	Industrial Rivet & Fastener Co.	6N37RFLAP/1100	Used as specimen pins.
2.5mm Flathead Screwdriver	Wiha Quality Tools	27225
Acetone	Electron Microscopy Sciences	RT 10000	Used to dilute silver paint.
Aspartic Acid	Sigma-Aldrich	A8949
Calcium Chloride	FisherScientific	C79-500
Conductive Silver Paint	Ted Pella	16062
Denton Desk-II Vacuum Sputtering Device equipped with standard gold foil target	Denton Vacuum	N/A	This is the gold-sputtering device used by the authors, alternates are acceptable.
Double-edged Razors	Fisher Scientific	50-949-411
Embed 812	Electron Microscopy Sciences	14120
Gatan 3View2 mounted in a Tescan Mira3 Field emission SEM	Gatan & Tescan	N/A	This is the SBF-SEM device used by the authors, alternates are acceptable.
Glass Shell Vials, 0.5 DRAM (1.8 ml)	Electron Microscopy Sciences	72630-05
Gluteraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16320
Gorilla Super Glue - Impact Tough	NA	NA	Refered to as cyanoacrylate glue in text.
Ketjen Black	HM Royal	EC-600JD	Refered to as carbon black in text.
KOH	FisherScientific	18-605-593
Lead Nitrate	Fisher Scientific	L62-100
Microwave	Pelco	BioWave Pro	This is the microwave used by the authors, alternates are acceptable.
Osmium Tetroxide	Sigma-Aldrich	201030
Potassium Ferrocyanide	Sigma-Aldrich	P9387
Silicone Embedding Mold	Ted Pella	10504
Sodium Cacodylate Trihydrate	Electron Microscopy Sciences	12300
Samco Transfer Pipette	ThermoFisher Scientific	202	Used to make specimen pin storage tubes.
Swiss Pattern Needle Files	Electron Microscopy Sciences	62115
Thiocarbohydrazide	Sigma-Aldrich	223220
Uranyl Acetate	Polysciences, Inc.	21447-25
Reconstruction Software
Amira Software	Thermo Scientific	N/A	Used to create the reconstructions found in figures 5-7 and 9.
Fiji (Fiji is Just ImageJ)	ImageJ.net	N/A	TrakEM2 can be added to Fiji to asist in manual segmentation.
Microscopy Image Browser (MIB)	University of Helsinki, Institute of Biotechnology	N/A
Reconstuct Software	Neural Systems Lab	N/A
SuRVoS Workbench	Diamond Light Source & The University of Nottingham	N/A
SyGlass	IstoVisio, Inc.	N/A	Allows for reconstruction in virtual reality and histogram-based reconstruction methods.