JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол описывает рутинный метод использования последовательной блочной сканирующей электронной микроскопии (SBF-SEM), мощного метода 3D-визуализации. Успешное применение SBF-SEM зависит от правильной фиксации и окрашивания тканей, а также тщательного рассмотрения настроек визуализации. Этот протокол содержит практические соображения для всего этого процесса.

Аннотация

Последовательная блочная сканирующая электронная микроскопия (SBF-SEM) позволяет коллекционировать от сотен до тысяч серийно зарегистрированных ультраструктурных изображений, предлагая беспрецедентный трехмерный вид микроанатомии тканей. В то время как sBF-SEM в последние годы наблюдается экспоненциальный рост использования, технические аспекты, такие как надлежащая подготовка тканей и параметры визуализации, имеют первостепенное значение для успеха этого метода визуализации. Эта система визуализации выигрывает от автоматизированного характера устройства, позволяя оставлять микроскоп без присмотра во время процесса визуализации, с автоматизированным сбором сотен изображений, возможных за один день. Однако без соответствующей тканевой подготовки клеточная ультраструктура может быть изменена таким образом, что могут быть сделаны неправильные или вводящие в заблуждение выводы. Кроме того, изображения генерируются путем сканирования лицевой стороны блока биологического образца, встроенного в смолу, и это часто создает проблемы и соображения, которые необходимо решить. Накопление электронов внутри блока во время визуализации, известное как «заряд ткани», может привести к потере контраста и неспособности оценить клеточную структуру. Более того, в то время как увеличение интенсивности / напряжения электронного пучка или снижение скорости сканирования пучка может увеличить разрешение изображения, это также может иметь неприятный побочный эффект повреждения смоляного блока и искажения последующих изображений в серии изображений. Здесь мы представляем рутинный протокол подготовки образцов биологических тканей, который сохраняет клеточную ультраструктуру и уменьшает заряд тканей. Мы также предоставляем визуальные соображения для быстрого получения высококачественных серийных изображений с минимальным повреждением тканевого блока.

Введение

Последовательная блочная сканирующая электронная микроскопия (SBF-SEM) была впервые описана Лейтоном в 1981 году, где он создал сканирующий электронный микроскоп, дополненный встроенным микротомом, который мог разрезать и визуализировать тонкие участки ткани, встроенные в смолу. К сожалению, технические ограничения ограничили его использование проводящими образцами, поскольку непроводящие образцы, такие как биологическая ткань, накапливали неприемлемые уровни зарядки (накопление электронов в образцеткани) 1. В то время как покрытие грани блока между разрезами испаривающимся углеродным снижением тканевой зарядки, это значительно увеличило время получения изображений и хранения изображений оставалось проблемой, поскольку компьютерные технологии в то время были недостаточны для управления большими размерами файлов, созданных устройством. Эта методология была пересмотрена Denk и Horstmann в 2004 году с использованием SBF-SEM, оснащенного камерой переменного давления2. Это позволило ввести водяной пар в камеру визуализации, что уменьшает заряд внутри образца, делая визуализацию непроводниковых образцов жизнеспособной, хотя и с потерей разрешения изображения. Дальнейшие усовершенствования в методах подготовки тканей и визуализации теперь позволяют проводить визуализацию с использованием высокого вакуума, а визуализация SBF-SEM больше не полагается на водяной пар для рассеивания заряда3,4,5,6,7,8,9. В то время как sBF-SEM в последние годы наблюдается экспоненциальный рост использования, технические аспекты, такие как надлежащая подготовка тканей и параметры визуализации, имеют первостепенное значение для успеха этого метода визуализации.

SBF-SEM позволяет автоматически получать тысячи серийно зарегистрированных изображений электронной микроскопии с планарным разрешением до 3-5 нм10,11. Ткань, пропитанная тяжелыми металлами и встроенная в смолу, помещается в сканирующий электронный микроскоп (SEM), содержащий ультрамикротом, оснащенный алмазным ножом. Алмазным ножом ограняется плоская поверхность, нож убирается, а поверхность блока сканируется в растровом рисунке электронным пучком для создания изображения ультраструктуры ткани. Затем блок поднимается на определенное количество (например, 100 нм) по оси z, известное как «z-шаг», и новая поверхность разрезается перед повторением процесса. Таким образом, создается 3-мерный (3D) блок изображений по мере разрезания ткани. Эта система визуализации также выигрывает от автоматизированного характера устройства, позволяя оставлять микроскоп без присмотра во время процесса визуализации, с автоматизированным сбором сотен изображений, возможных за один день.

В то время как визуализация SBF-SEM в основном использует обратно рассеянные электроны для формирования изображения лица блока, вторичные электроны генерируются во время процесса визуализации12. Вторичные электроны могут накапливаться вместе с обратно рассеянными и первичными пучковыми электронами, которые не покидают блок, и производить «заряд ткани», что может привести к локализованному электростатическому полю на грани блока. Это накопление электронов может исказить изображение или привести к выбросу электронов из блока и способствовать сигналу, собранного детектором обратного рассеяния, уменьшая отношение сигнал/шум13. В то время как уровень заряда тканей может быть уменьшен за счет снижения напряжения или интенсивности электронного пучка или уменьшения времени пребывания пучка, это приводит к уменьшению отношения сигнал/шум14. Когда используется электронный пучок более низкого напряжения или интенсивности, или пучку разрешено обитать только в пределах каждого пиксельного пространства в течение более короткого периода времени, меньше обратно рассеянных электронов выбрасывается из ткани и захватывается электронным детектором, что приводит к более слабому сигналу. Денк и Хорстманн решли эту проблему, вводя водяной пар в камеру, тем самым уменьшая заряд в камере и на лицевой стороне блока за счет разрешения изображения. При давлении в камере 10-100 Па часть электронного пучка рассеивается, способствуя шуму изображения и потере разрешения, однако это также производит ионы в камере образца, которые нейтрализуют заряд в блоке образца2. Более поздние методы нейтрализации заряда внутри блока образца используют фокальный газовый впрыск азота по лицевой стороне блока во время визуализации или введение отрицательного напряжения на ступень SBF-SEM для уменьшения энергии зонда-пучка-зацепки и увеличения собранного сигналана 6,7,15. Вместо того, чтобы вводить смещение ступени, давление в камеру или локализованную инъекцию азота для уменьшения накопления заряда на поверхности блока, также можно увеличить проводимость смолы путем введения углерода в смесь смолы, что позволяет более агрессивные настройки изображения16. Следующий общий протокол является адаптацией протокола Deerinck et al., опубликованного в 2010 году, и охватывает модификации методологий подготовки тканей и визуализации, которые мы сочли полезными для минимизации заряда тканей при сохранении получения изображений с высоким разрешением3,17,18,19. В то время как ранее упомянутый протокол сосредоточен на обработке тканей и пропитке тяжелыми металлами, этот протокол дает представление о визуализации, анализе данных и рабочем процессе реконструкции, присущем исследованиям SBF-SEM. В нашей лаборатории этот протокол был успешно и воспроизводимо применен к широкому кругу тканей, включая структуры роговицы и переднего сегмента, веко, слезную и более твердую железу, сетчатку и зрительный нерв, сердце, легкие и дыхательные пути, почки, печень, мышцы кремастера и кору головного мозга / продолговатый мозг, а также у различных видов, включая мышь, крысу, кролика, морскую свинку, рыбу, монослойные и стратифицированные клеточные культуры, свиней, нечеловеческих приматов, а также человека20,21,22,23. Хотя небольшие изменения могут быть полезны для конкретных тканей и приложений, этот общий протокол оказался очень воспроизводимым и полезным в контексте нашего основного средства визуализации.

протокол

Все животные обрабатывались в соответствии с руководящими принципами, описанными в Заявлении Ассоциации исследований в области зрения и офтальмологии для использования животных в исследованиях зрения и офтальмологических исследованиях и Руководящих принципах обращения с животными Колледжа оптометрии Университета Хьюстона. Все процедуры для животных были одобрены учреждениями, в которых они обрабатывались: процедуры для мышей, крыс, кроликов, морских свинок и нечеловеческих приматов были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Университета Хьюстона, процедуры для рыбок данио были одобрены Комитетом по уходу за животными и использованию животных Университета ДеПау, а процедуры для свиней были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Медицинского колледжа Бейлора. Все человеческие ткани были обработаны в соответствии с Хельсинкской декларацией в отношении исследований тканей человека, и было получено соответствующее одобрение институционального наблюдательного совета.

1. Обработка тканей

  1. Готовят запасной раствор 0,4 М буфера какодилата натрия путем смешивания порошка какодилата натрия в ddH2O. Тщательно перемешайте буфер и pH дорегулируйте раствор до 7,3. Этот буфер используют для изготовления фиксаторного (композиция, описанная ниже на этапе 1.3), промывки буфера, а также растворов осмия и ферроцианида калия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фиксация перфузии часто является лучшим методом фиксации для исследований SBF-SEM, так как фиксация происходит быстро и по всему телу. Если фиксация перфузии невозможна в рамках вашего проекта исследования, перейдите к шагу 1.3.
  2. Выполняют перфузионную фиксацию с соответствующим физиологическим давлением для животного модели24,25,26. Это делается с помощью транскардиальной последовательной перфузии с гепаринизированным физиологическим раствором, за которым следует фиксатор, каждый из которых помещается на определенной высоте (например, 100 см) над организмом (соответствующему физиологическому давлению сосудистой системы в животной модели), с фиксатором, протекающим в левый желудочек и выходящим из разреза, сделанного в правом предсердии. Ткань, представляющий интерес, станет бледной, поскольку кровь заменяется фиксатором, если вся или часть вашей ткани не бланшируется, то ткань может быть не фиксирована должным образом, а ультраструктура может не сохраняться.
  3. Используйте лезвие бритвы или острый скальпель, чтобы обрезать образцы тканей на блоки размером не более 2 мм х 2 мм х 2 мм. Если шаг 1.2 был пропущен, сделайте это быстро, чтобы ткань могла быть зафиксирована как можно быстрее.
    1. В качестве альтернативы рассечение ткани под фиксатором и перевод на свежий фиксатор для завершения процесса погружения. Конечная композиция фиксатора состоит из 0,1 М буфера какодилата натрия, содержащего 2,5% глутаральдегида и 2 мМ хлорида кальция. Дайте фиксации продолжаться в течение минимум 2 часов при комнатной температуре и максимум в течение ночи при 4 °C. Если возможно, используйте качельку/наклонную пластину для осторожного перемешивать образцы во время фиксации.
    2. В качестве альтернативы, если инверторная микроволновая печь доступна, зафиксируйте ткань в вышеупомянутом фиксаторе под вакуумом при 150 Вт в течение 4 циклов 1 минута включена, 1 минута выключена. Микроволновая фиксация является предпочтительным методом для этапа 1.3, поскольку она быстро фиксирует ткань и сохраняет ультраструктуруткани 27.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ткани никогда не следует позволять высыхать во время этого протокола, следует позаботиться о том, чтобы быстро перенести ткань из одного раствора в другой.
  4. Промыть фиксированную ткань 5 раз в течение 3 минут каждая (всего 15 минут) при комнатной температуре в буфере какодилата натрия 0,1 М, содержащем 2 мМ хлорида кальция.
  5. Сделайте следующий раствор ферроцианида осмия свежим, предпочтительно во время предыдущих этапов промывки. Соединить 4% раствор тетроксида осмия (приготовленный в ddH2O) с равным объемом 3% ферроцианида калия в 0,2 М какодилатного буфера с 4 мМ хлорида кальция. После предыдущего этапа промывания поместите ткань в этот раствор на 1 час на лед в темноте и в вытяжной капюшон.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Тетроксид осмия представляет собой желтое кристаллическое вещество, которое входит в ампулу. Чтобы создать раствор тетроксида осмия, раскройте ампулу, добавьте ddH2O и прожайте ультразвуком в течение 3-4 часов в темноте до полного растворения кристаллов. Раствор тетроксида осмия представляет собой прозрачный желтый раствор, если раствор черный, осмий был восстановлен и больше не должен использоваться.
  6. Пока ткань инкубируется в растворе ферроцианида осмия, начинают приготовление раствора тиокарбогидразида (ТХ). Приготовьте этот раствор свежим и исправьте его в свободном доступе в конце 1-часового периода фиксации ферроцианида осмия. Соединить 0,1 г тиокарбогидразида с 10 мл ddH2Oи поместить этот раствор в духовку с 60 °C на 1 час. Чтобы раствор растворился, осторожно закручивайте каждые 10 минут. Перед использованием отфильтруйте этот раствор через шприцевой фильтр 0,22 мкм.
  7. Перед инкубацией в ТП промыть ткань с комнатной температурой ddH2O 5x в течение 3 минут каждая (всего 15 минут).
  8. Поместите ткань в фильтрованный раствор ТКП в общей сложности на 20 минут при комнатной температуре(рисунок 1А-С).
  9. После инкубации в ТП промойте ткань по 5 раз в течение 3 минут каждая (всего 15 минут) при комнатной температуре ddH2O.
  10. Поместите ткань в ddH2O, содержащую 2% тетроксид осмия (не осмий, восстановленный ферроцианидом калия) в течение 30 минут при комнатной температуре. Это следует делать в вытяжном капюшоне и в темноте, так как осмий может быть уменьшен светом (например, под алюминиевой фольгой)(рисунок 1D-F).
  11. После инкубации тетроксида осмия промыть ткань по 5 раз в течение 3 минут (всего 15 минут) при комнатной температуре ddH2O.
  12. Поместите ткань в 1% водный уранилацетат (порошок уранилацетата, смешанный с ddH2O) на ночь в холодильник при 4 °C.
  13. Непосредственно перед извлечением ткани из холодильника приготовьте свежий раствор аспартата свинца Уолтона. Начинают с растворения 0,066 г нитрата свинца в 10 мл 0,03 М раствора аспарагиновой кислоты (0,04 г аспарагиновой кислоты в 10 мл дистиллированной воды) и регулируют рН до 5,5 с 1 Н КОН (0,5611 г в 10 мл дистиллированной воды).
    ВНИМАНИЕ: При регулировке рН может образовываться осадок. Это неприемлемо.
    1. Используя перемешивающий батончик, медленно добавляйте 1 Н КОН по каплям при мониторинге рН. Предварительно нагрейте готовый прозрачный раствор аспартата свинца в духовке при температуре 60 °C в течение 30 минут. Если образуется осадок, раствор не может быть использован и должен быть приготовлен другой раствор.
  14. Достаньте салфетку из холодильника и промывайте по 5 раз по 3 минуты (всего 15 минут) при комнатной температуре ddH2O.
  15. После промывания поместите ткань в подогретый раствор аспартата свинца Уолтона на 30 минут, сохраняя при этом температуру на уровне 60 °C.
  16. После инкубации в аспартате свинца Уолтона промыть ткань 5x в течение 3 минут каждая (всего 15 минут) при комнатной температуре ddH2O(рисунок 1G-I).
  17. Обезвоживание ткани через ледяной ацетоновый ряд (30%, 50%, 70%, 95%, 95%, 100%, 100% и 100% ацетон (в ddH2O, где это применимо), давая 10 минут для каждой ступени в серии.
  18. После серии ледяного обезвоживания поместите ткань в ацетон комнатной температуры на 10 минут.
    1. За это время формулируют Embed 812 ACM смолу. Используйте рецепт «твердой смеси», так как она более устойчива к повреждению пучком. Тщательно перемешайте смолу и поместите ткань в Embed 812: ацетон (1: 3 смеси) в течение 4 часов, затем Embed 812: ацетон (1: 1 смесь) в течение 8 часов или на ночь, и, наконец, вставить 812: ацетон (3: 1 смесь) на ночь. Выполните эти шаги по инфильтрации смолы при комнатной температуре.
  19. На следующий день поместите ткань в 100% Embed 812 на 4-8 часов, затем в свежую 100% Embed 812 на ночь и, наконец, в свежую 100% Embed 812 в течение 4 часов. Выполните эти шаги по инфильтрации смолы при комнатной температуре.
    1. Непосредственно перед встраиванием поместите небольшое количество смолы в контейнер для смешивания и медленно перемешайте (деревянная палочка может быть использована для перемешивания) в порошке технического углерода, пока смола не насытится порошком, но все еще будет жидкой и не станет зернистой. Он должен напоминать толстые чернилки и уметь медленно капать с деревянной палочки без видимых комков.
  20. Сориентируйте образцы тканей в силиконовой резиновой форме и сделайте снимок, чтобы ориентация образца в смоляном блоке была записана и на нее можно было ссылаться. Накройте образцы насыщенной смолой технического углерода на кончике силиконовой формы и поместите форму в духовку на ~1 час при 65 °C.
    1. Поместите форму под наклон, чтобы она содержала смолу на кончике формы, где она покрывает образец ткани. Поместите этикетку с идентификатором образца эксперимента/ткани в форму на противоположном конце смолы(рисунок 2A).
  21. Извлеките силиконовую форму из духовки и заполните оставшуюся часть формы прозрачной смолой (без технического углерода), убедившись, что этикетка остается видимой. Отвержь смолу, настоявшую на саженом, достаточно, чтобы не смешиваться с прозрачной смолой.
    1. Подготовьте дополнительный колодец внутри формы, который не содержит ткани. Начиная с дополнительного колодца, заполните оставшуюся часть формы прозрачной смолой.
    2. Если смола, наполненная сажим углеродом, начинает сливаться в прозрачную смолу, поместите силиконовую форму обратно в духовку на дополнительное время (например, 15 минут).
    3. После того, как все образцы тканей будут покрыты прозрачной смолой, поместите силиконовую форму обратно в духовку (плоскую, без наклона) при 65 ° C в течение 48 часов, чтобы завершить процесс отверждения.

2. Подготовка блока

ПРИМЕЧАНИЕ: Метод будет зависеть от того, как образец ориентирован в блоке и как будет происходить секционирование. Однако наиболее распространенная ориентация ткани обнаруживает ткань, центрированную в кончике смоляного блока, перпендикулярную длинному концу смоляного блока.

  1. В большинстве случаев сначала обрезают конец блока, чтобы найти ткань, помещая блок образца в микротомный патрон с конусным концом, торчащий примерно на 5-6 мм из патрона. Зафиксируйте его на месте с помощью установленного винта и поместите под тепловую лампу.
  2. Через несколько минут блок станет податливым и легко обрезаемым. Поместите патрон в держатель стереомикроскопа и используйте новое лезвие бритвы с двойными краями, чтобы сделать тонкие участки параллельными лицевой стороне блока, пока ткань не будет видна. Это лучше всего видно, проводя свет через лицо блока, образец ткани будет менее отражающим и зернистым по сравнению с теми частями смолы, которые лишены ткани. Обратитесь к фотографии, сделанной образцами тканей перед введением насыщенной смолы технического углерода, чтобы получить представление о том, как и где находится ткань.
  3. Отложите один держатель штифта для обрезки. Этот держатель штифта никогда не помещается в камеру SEM и поэтому может работать без перчаток, это будет называться держателем для обрезки штифта. Любой держатель образца, предназначенный для размещения в камере визуализации, никогда не должен быть тронут без перчаток. Это позволяет избежать введения смазки и масла в камеру микроскопа.
  4. Поместите алюминиевый штифт в держатель обрезного штифта и слегка затяните установленный винт лицевой стороной (плоской поверхностью) штифта, удерживаемым на 3-4 мм выше держателя штифта.
  5. Сделайте несколько глубоких, пересекающихся царапин на лицевой стороне штифта, чтобы обеспечить большую площадь поверхности для клея, используемого для удержания образца на месте. Если используется алюминиевый штифт, для этого шага рекомендуется небольшая стальная отвертка с плоской головкой(рисунок 2B).
  6. Поместите патрон, содержащий образец ткани, обратно под тепловую лампу до тех пор, пока смола не станет мягкой и податливой, затем поместите ее в патрон-сосуд под стереомикроскопом.
  7. Использование обоюдоострого лезвия бритвы для обрезки избытка смолы из части смоляного блока, содержащего образец ткани. В конечном итоге размер тканевого блока, прикрепленного к штифту, составит примерно 3 мм в диаметре и 2-3 мм в высоту.
    1. Осторожно протолкнуйте бритву прямо вниз в смоляной блок примерно на 1-2 мм, затем осторожно протолкнуть бритву горизонтально в смоляной блок на глубине, равной предыдущему срезу. Делайте это медленно и с большой осторожностью, так как можно повредить или отрезать часть блока, содержащую образец ткани. Когда два разреза встречаются, избыток смолы отделяется от блока. Продолжайте удалять смолу до тех пор, пока не останется только приподнятая область 3 мм х 3 мм.
  8. После этой первоначальной обрезки поместите блок (все еще в патрон) под лампу нагрева на несколько минут.
  9. Как только смола станет мягкой и податливой, поместите блок обратно под стереомикроскоп. Используя новое лезвие бритвы с двойным лезвием, отрежьте верхнюю часть смоляного блока, примерно на 1 мм ниже обрезанной части, с одним гладким срезом. Плоская поверхность предпочтительнее, так как она будет приклеена к штифту образца. Будьте осторожны, чтобы не позволить образцу потеряться, так как этот шаг требует некоторой силы, которая может перейти на удаленную часть блока и заставить его улететь. Отложите разрезанный и обрезанный образец в сторону.
  10. Поместите держатель обрезного штифта, содержащий разрезанный алюминиевый штифт, в розетку стереомикроскопа. Нанесите тонкий слой цианоакрилатного клея на лицевую сторону булавки так, чтобы она полностью закрывала булавку, не образуя видимого мениска. Подберите обрезанный кусок тканевого блока щипцами и поместите на лицевую сторону булавки. Центрирование образца ткани на штифте образца. Нажмите на него и удерживайте в течение нескольких секунд. Дайте клею сложиться в течение нескольких минут.
  11. Когда клей полностью высохнет, поместите держатель обрезного штифта обратно под стереомикроскоп. Используя тонкий файл, уберите избыток смолы, чтобы ни одна смола не нависла над контактом. Форма смолы должна напоминать круглую головку булавки.
  12. Расположение ткани на приподнятой части вашего смоляного блока, для этого полезно косое освещение. С помощью бритвы с двойным лезвием приподнятая часть смолы, содержащая образец ткани, должна быть обрезана до площади не более 1мм2. По возможности блок-грань можно обрезать еще меньше, это снизит нагрузку на алмазный нож и улучшит его долговечность.
    1. Удалите как можно больше лишней смолы, оставив блок немного длиннее в одном измерении. Это делается медленно и с осторожностью, так как смола, содержащая образец ткани, может отколоться, если прикладывается слишком много силы. Хотя рекомендуется бритва, для этого шага можно использовать тонкий металлический файл.
  13. С тонким углом металлического напильни избытка смолы, в области за пределами поднятой части, содержащей образец ткани, вниз к краю штифта(рисунок 2C).
  14. Удалите частицы смолы и пыли из подготовленного образца перед нанесением серебряной краски с последующим распылением золота. Смешайте серебро с ацетоном так, чтобы оно было легко намазываемой жидкостью, похожей на лак для ногтей (но не настолько тонкой, чтобы она капает с аппликатора) и нанесите тонкий слой на всю поверхность блока образцов. Ацетон быстро испаряется, поэтому может потребоваться добавить дополнительный ацетон, когда серебряная краска начинает утолщаться.
    1. Дайте серебряной краске высохнуть в течение ночи перед загрузкой в микроскоп.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот серебряный слой должен быть тонким, чтобы избежать расширения грани блока за пределы 1 мм х 1 мм, и хотя серебряная краска никогда не повреждала алмазный нож, меньшие грани блока по-прежнему рекомендуются для сохранения долговечности алмазного ножа. Ацетон, смешанный с серебром, должен полностью испариться перед распылением золота или загрузкой образца в микроскоп, чтобы избежать введения паров ацетона в камеру визуализации.
    2. После нанесения серебряной краски нанесите тонкий слой золота на блок образца. При использовании стандартного вакуумного напыляющего устройства, оснащенного стандартной мишенью из золотой фольги, давление в камере 200 миллиТорр (газ аргон) и 40 миллиампер, работающее в течение 2 минут, приведет к золотому покрытию толщиной 20 нм.
  15. После нанесения покрытия поместите смонтированный и обрезанный блок в трубку с соответствующей экспериментальной этикеткой. Создавайте пользовательские трубки с помощью одноразовых трансферных пипеток.
    1. Разрежьте передаточную пипетку чуть ниже колбы, оставив короткую часть трубки для переноски, прикрепленную ниже луковичного конца. Укоротите трубчатую часть, которая была отрезана, и отрежьте наконечник пипетки назад настолько, чтобы алюминиевый штифт образца можно было прижать к нему.
    2. Поместите конец, содержащий алюминиевый образец штифта, в колбовый конец модифицированной передаточной пипетки.
  16. Перед загрузкой подготовленного тканевого блока аккуратно обрежьте избыток серебристой краски с поверхности блока.

3. Настройки SEM для визуализации лица блока

ПРИМЕЧАНИЕ: Приведенные ниже настройки изображения были созданы на устройстве, используемом авторами, которое указано в таблице материалов. Хотя это устройство способно к визуализации с переменным давлением, наилучшие результаты были получены при высоком вакууме.

  1. Время пребывания: Используйте 12 мкс/пиксель во время последовательного сечения. Когда область интереса идентифицирована, изображение с более высоким разрешением может быть получено при 32 мкс/пиксель.
  2. Настройки вакуума: Используйте давление пушки 9e-008 Pa, давление в колонке 1,1e-004 Pa и давление в камере 9,5e-002 Pa.
  3. Время захвата: С помощью вышеуказанных настроек фиксируйте стек изображений размером 2048x2048 пикселей со скоростью 50 секунд на изображение. Изображения с более высоким разрешением интересующих областей могут быть получены с разрешением 4096x4096 пикселей со скоростью чуть менее 9 минут на изображение.
  4. Толщина секции: Используйте 100-200 нм. Меньше возможно, но может потребоваться более низкое напряжение луча, интенсивность или время выдержки.
  5. Высокое напряжение (HV): Используйте 7-12 кВ. В то время как увеличение напряжения уменьшает размер пятна и увеличивает разрешение, это создает больше возможностей для повреждения луча. Более высокое кВ увеличивает проникновение луча, что приводит к потере деталей. Однако понижение кВ ухудшает отношение сигнал/шум(рисунок 3)14.
  6. Интенсивность луча (BI): Авторский прибор SBF-SEM предлагает шкалу интенсивности луча в диапазоне от 1 до 20. По этой шкале значения 5-7 дают качественные изображения без чрезмерной зарядки и повреждения луча. Чем выше BI, тем больше разрешение, однако, больше шансов на зарядку и повреждениелуча 14.
  7. Размер пятна и увеличение изображения: Определите размер пятна по интенсивности луча и уровню напряжения. В идеале размер пятна не должен быть больше используемого размера пикселя. Размер пикселя определяется путем деления поля зрения (FOV) на количество пикселей. Например, 25-мкм FOV с размером изображения 2048x2048 пикселей даст 12,2 нм на пиксель. Поэтому размер пятна не должен превышать 12,2 нм. На рисунке 4 показано, как связаны HV, BI и размер пятна.
  8. Рабочее расстояние (WD) - При блочной визуализации лица рабочее расстояние не регулируется. Это просто фактор фокусировки. Он будет почти идентичен для всех изображенных блоков. Хотя рабочее расстояние не регулируется, оно играет решающую роль в разрешении захваченного изображения. По мере уменьшения рабочего расстояния ограничение разрешения на захваченные изображения увеличивается. В некоторых случаях может быть возможно уменьшить рабочее расстояние путем внесения изменений в камеру визуализации, однако эти изменения должны быть сделаны по усмотрению пользователя. Чтобы уменьшить рабочее расстояние и увеличить разрешение изображения, мы ослабили винты микротома дверного крепления и перепозиционировали микротом так, чтобы он лежал примерно на 2 мм ближе к детектору луча после повторного затягивания винтов.
  9. Разрешение - Используя вышеуказанные настройки, возможно разрешение x & y до 3,8 нм. Важно отметить, что разрешение ограничено размером пятна луча, а также пиксельным разрешением захвата изображения (например, поле зрения 20 мкм, снятое в пиксельном изображении 2048x2048 пикселей, имеет разрешение в пикселях 9,8 нм, даже если использовался размер пятна 3,8 нм). Разрешение изображения в z-плоскости зависит от толщины сечения, мы находим, что 100-200 нм хорошо работает с этим протоколом.

Результаты

Роговица мыши
Этот протокол широко применялся к роговице мыши. Было показано, что с помощью визуализации SBF-SEM сеть пучков микрофибрила без эластина (EFMB) присутствует в роговице взрослой мыши. Ранее считалось, что эта сеть присутствовала только во время эмбрионального и ранне?...

Обсуждение

Целью данной работы по методам является освещение методологии подготовки и визуализации тканей, которая позволила нашей лаборатории надежно захватывать изображения серийной электронной микроскопии высокого разрешения, и указать на критические шаги, которые приводят к этому результ...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить д-ра Сэма Хэнлона, Эвелин Браун и Маргарет Гондо за их прекрасную техническую помощь. Это исследование было частично поддержано Национальными институтами здравоохранения (NIH) R01 EY-018239 и P30 EY007551 (Национальный институт глаз), частично Фондом льва для зрения, а частично NIH 1R15 HD084262-01 (Национальный институт детского здоровья и развития человека).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1/16 x 3/8 Aluminum RivetsIndustrial Rivet & Fastener Co.6N37RFLAP/1100Used as specimen pins.
2.5mm Flathead ScrewdriverWiha Quality Tools27225
AcetoneElectron Microscopy SciencesRT 10000Used to dilute silver paint.
Aspartic AcidSigma-AldrichA8949
Calcium ChlorideFisherScientificC79-500
Conductive Silver PaintTed Pella16062
Denton Desk-II Vacuum Sputtering Device equipped with standard gold foil targetDenton VacuumN/AThis is the gold-sputtering device used by the authors, alternates are acceptable.
Double-edged RazorsFisher Scientific50-949-411
Embed 812Electron Microscopy Sciences14120
Gatan 3View2 mounted in a Tescan Mira3 Field emission SEMGatan & TescanN/AThis is the SBF-SEM device used by the authors, alternates are acceptable.
Glass Shell Vials, 0.5 DRAM (1.8 ml)Electron Microscopy Sciences72630-05
GluteraldehydeElectron Microscopy Sciences16320
Gorilla Super Glue - Impact ToughNANARefered to as cyanoacrylate glue in text.
Ketjen BlackHM RoyalEC-600JDRefered to as carbon black in text.
KOHFisherScientific18-605-593
Lead NitrateFisher ScientificL62-100
MicrowavePelcoBioWave ProThis is the microwave used by the authors, alternates are acceptable.
Osmium TetroxideSigma-Aldrich201030
Potassium FerrocyanideSigma-AldrichP9387
Silicone Embedding MoldTed Pella10504
Sodium Cacodylate TrihydrateElectron Microscopy Sciences12300
Samco Transfer PipetteThermoFisher Scientific202Used to make specimen pin storage tubes.
Swiss Pattern Needle FilesElectron Microscopy Sciences62115
ThiocarbohydrazideSigma-Aldrich223220
Uranyl AcetatePolysciences, Inc.21447-25
Reconstruction Software
Amira SoftwareThermo ScientificN/AUsed to create the reconstructions found in figures 5-7 and 9.
Fiji (Fiji is Just ImageJ)ImageJ.netN/ATrakEM2 can be added to Fiji to asist in manual segmentation.
Microscopy Image Browser (MIB)University of Helsinki, Institute of BiotechnologyN/A
Reconstuct SoftwareNeural Systems LabN/A
SuRVoS WorkbenchDiamond Light Source & The University of NottinghamN/A
SyGlassIstoVisio, Inc.N/AAllows for reconstruction in virtual reality and histogram-based reconstruction methods.

Ссылки

  1. Leighton, S. B. SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM - a technical note. Scanning Electron Microscopy. , 73-76 (1981).
  2. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLOS Biology. 2 (11), 329 (2004).
  3. He, Q., Hsueh, M., Zhang, G., Joy, D. C., Leapman, R. D. Biological serial block face scanning electron microscopy at improved z-resolution based on Monte Carlo model. Scientific Reports. 8 (1), 12985 (2018).
  4. Zankel, A., Wagner, J., Poelt, P. Serial sectioning methods for 3D investigations in materials science. Micron. 62, 66-78 (2014).
  5. Titze, B., Genoud, C. Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure. Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).
  6. Ohta, K., et al. Beam deceleration for block-face scanning electron microscopy of embedded biological tissue. Micron. 43 (5), 612-620 (2012).
  7. Bouwer, J. C., et al. Deceleration of probe beam by stage bias potential improves resolution of serial block-face scanning electron microscopic images. Advanced Structural and Chemical Imaging. 2 (1), 11 (2017).
  8. Kizilyaprak, C., Longo, G., Daraspe, J., Humbel, B. M. Investigation of resins suitable for the preparation of biological sample for 3-D electron microscopy. Journal of Structural Biology. 189 (2), 135-146 (2015).
  9. Kittelmann, M., Hawes, C., Hughes, L. Serial block face scanning electron microscopy and the reconstruction of plant cell membrane systems. Journal of Microscopy. 263 (2), 200-211 (2016).
  10. Biazik, J., Vihinen, H., Anwar, T., Jokitalo, E., Eskelinen, E. L. The versatile electron microscope: an ultrastructural overview of autophagy. Methods. 75, 44-53 (2015).
  11. Peddie, C. J., Collinson, L. M. Exploring the third dimension: Volume electron microscopy comes of age. Micron. 61, 9-19 (2014).
  12. Piňos, J., Mikmeková, &. #. 3. 5. 2. ;., Frank, L. About the information depth of backscattered electron imaging. Journal of Microscopy. 266 (3), 335-342 (2017).
  13. Smith, D., Starborg, T. Serial block face scanning electron microscopy in cell biology: Applications and technology. Tissue Cell. 57, 111-122 (2019).
  14. Goggin, P., et al. Development of protocols for the first serial block-face scanning electron microscopy (SBF SEM) studies of bone tissue. Bone. 131, 115107 (2020).
  15. Deerinck, T. J., et al. High-performance serial block-face SEM of nonconductive biological samples enabled by focal gas injection-based charge compensation. Journal of Microscopy. 270 (2), 142-149 (2018).
  16. Nguyen, H. B., et al. Conductive resins improve charging and resolution of acquired images in electron microscopic volume imaging. Scientific Reports. 6, 23721 (2016).
  17. Deerinck, T. J., Bushong, E. A., Thor, A., Ellisman, M. H. NCMIR methods for 3D EM: a new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. National Center for Microscopy and Imaging Research. 6 (8), (2010).
  18. Deerinck, T. J., et al. Enhancing Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy to Enable High Resolution 3-D Nanohistology of Cells and Tissues. Microscopy and Microanalysis. 16, 1138-1139 (2010).
  19. Kubota, Y. New developments in electron microscopy for serial image acquisition of neuronal profiles. Microscopy (Oxf). 64 (1), 27-36 (2015).
  20. Courson, J. A., et al. Serial block-face scanning electron microscopy: A provocative technique to define 3-dimensional ultrastructure of microvascular thrombosis. Thrombosis Research. 196, 519-522 (2020).
  21. Courson, J. A., et al. Serial block-face scanning electron microscopy reveals neuronal-epithelial cell fusion in the mouse cornea. PLoS One. 14 (11), 0224434 (2019).
  22. Lafontant, P. J., et al. Cardiac Myocyte Diversity and a Fibroblast Network in the Junctional Region of the Zebrafish Heart Revealed by Transmission and Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy. PLoS One. 8 (8), 72388 (2013).
  23. Hanlon, S. D., Behzad, A. R., Sakai, L. Y., Burns, A. R. Corneal stroma microfibrils. Experimental Eye Research. 132, 198-207 (2015).
  24. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
  25. Davenport, A. T., Grant, K. A., Szeliga, K. T., Friedman, D. P., Daunais, J. B. Standardized method for the harvest of nonhuman primate tissue optimized for multiple modes of analyses. Cell Tissue Bank. 15 (1), 99-110 (2014).
  26. Schuster, A., et al. An isolated perfused pig heart model for the development, validation and translation of novel cardiovascular magnetic resonance techniques. Journal of Cardiovascular Magnetic Resonance. 12 (1), 53 (2010).
  27. Hanlon, S. D., Patel, N. B., Burns, A. R. Assessment of postnatal corneal development in the C57BL/6 mouse using spectral domain optical coherence tomography and microwave-assisted histology. Experimental Eye Research. 93 (4), 363-370 (2011).
  28. Longiéras, N., Sebban, M., Palmas, P., Rivaton, A., Gardette, J. L. Multiscale approach to investigate the radiochemical degradation of epoxy resins under high-energy electron-beam irradiation. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 44 (2), 865-887 (2006).
  29. Hashimoto, T., Thompson, G. E., Zhou, X., Withers, P. J. 3D imaging by serial block face scanning electron microscopy for materials science using ultramicrotomy. Ultramicroscopy. 163, 6-18 (2016).
  30. Rouquette, J., et al. Revealing the high-resolution three-dimensional network of chromatin and interchromatin space: A novel electron-microscopic approach to reconstructing nuclear architecture. Chromosome Research. 17 (6), 801 (2009).
  31. Briggman, K. L., Helmstaedter, M., Denk, W. Wiring specificity in the direction-selectivity circuit of the retina. Nature. 471 (7337), 183-188 (2011).
  32. Katoh, K. Microwave-Assisted Tissue Preparation for Rapid Fixation, Decalcification, Antigen Retrieval, Cryosectioning, and Immunostaining. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 2016, 7076910 (2016).
  33. Login, G. R., Dvorak, A. M. A review of rapid microwave fixation technology: its expanding niche in morphologic studies. Scanning. 15 (2), 58-66 (1993).
  34. Jamur, M. C., Faraco, C. D., Lunardi, L. O., Siraganian, R. P., Oliver, C. Microwave fixation improves antigenicity of glutaraldehyde-sensitive antigens while preserving ultrastructural detail. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 307-311 (1995).
  35. Leong, A. S., Sormunen, R. T. Microwave procedures for electron microscopy and resin-embedded sections. Micron. 29 (5), 397-409 (1998).
  36. Willingham, M. C., Rutherford, A. V. The use of osmium-thiocarbohydrazide-osmium (OTO) and ferrocyanide-reduced osmium methods to enhance membrane contrast and preservation in cultured cells. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 32 (4), 455-460 (1984).
  37. Khan, A. A., Riemersma, J. C., Booij, H. L. The reactions of osmium tetroxide with lipids and other compounds. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 9, 560-563 (1961).
  38. Belazi, D., Solé-Domènech, S., Johansson, B., Schalling, M., Sjövall, P. Chemical analysis of osmium tetroxide staining in adipose tissue using imaging ToF-SIMS. Histochemistry and Cell Biology. 132 (1), 105-115 (2009).
  39. Rivlin, P. K., Raymond, P. A. Use of osmium tetroxide-potassium ferricyanide in reconstructing cells from serial ultrathin sections. Journal of Neuroscience Methods. 20 (1), 23-33 (1987).
  40. Aguas, A. P. The use of osmium tetroxide-potassium ferrocyanide as an extracellular tracer in electron microscopy. Stain Technology. 57 (2), 69-73 (1982).
  41. Seligman, A. M., Wasserkrug, H. L., Hanker, J. S. A new staining method (OTO) for enhancing contrast of lipid--containing membranes and droplets in osmium tetroxide--fixed tissue with osmiophilic thiocarbohydrazide(TCH). Journal of Cell Biology. 30 (2), 424-432 (1966).
  42. Watson, M. L. Staining of tissue sections for electron microscopy with heavy metals. II. Application of solutions containing lead and barium. Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 4 (6), 727-730 (1958).
  43. Zhou, W., Apkarian, R., Wang, Z., Joy, D. Fundamentals of Scanning Electron Microscopy. Scanning Microscopy in Nanotechnology. , 1-40 (2006).
  44. Tapia, J. C., et al. High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy. Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).
  45. Buchacker, T., et al. Assessment of the Alveolar Capillary Network in the Postnatal Mouse Lung in 3D Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy. Frontiers in Physiology. 10, 1357 (2019).
  46. Keeling, E., et al. 3D-Reconstructed Retinal Pigment Epithelial Cells Provide Insights into the Anatomy of the Outer Retina. International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), (2020).
  47. Shang, P., et al. Chronic Alcohol Exposure Induces Aberrant Mitochondrial Morphology and Inhibits Respiratory Capacity in the Medial Prefrontal Cortex of Mice. Frontiers in Neuroscience. 14, 561173 (2020).
  48. Pfeifer, C. R., et al. Quantitative analysis of mouse pancreatic islet architecture by serial block-face SEM. Journal of Structural Biology. 189 (1), 44-52 (2015).
  49. Wilke, S. A., et al. Deconstructing complexity: serial block-face electron microscopic analysis of the hippocampal mossy fiber synapse. Journal of Neuroscience. 33 (2), 507-522 (2013).
  50. Cocks, E., Taggart, M., Rind, F. C., White, K. A guide to analysis and reconstruction of serial block face scanning electron microscopy data. Journal of Microscopy. 270 (2), 217-234 (2018).
  51. Borrett, S., Hughes, L. Reporting methods for processing and analysis of data from serial block face scanning electron microscopy. Journal of Microscopy. 263 (1), 3-9 (2016).
  52. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  53. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
  54. Fiala, J. C. Reconstruct: a free editor for serial section microscopy. Journal of Microscopy. 218, 52-61 (2005).
  55. Pidhorskyi, S., Morehead, M., Jones, Q., Spirou, G., Doretto, G. syGlass: interactive exploration of multidimensional images using virtual reality Head-mounted displays. arXiv . , (2018).
  56. Cardona, A., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLoS One. 7 (6), 38011 (2012).
  57. Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. Microscopy Image Browser: A Platform for Segmentation and Analysis of Multidimensional Datasets. PLOS Biology. 14 (1), 1002340 (2016).
  58. Luengo, I., et al. SuRVoS: Super-Region Volume Segmentation workbench. Journal of Structural Biology. 198 (1), 43-53 (2017).
  59. Anderson, H. R., Stitt, A. W., Gardiner, T. A., Archer, D. B. Estimation of the surface area and volume of the retinal capillary basement membrane using the stereologic method of vertical sections. Analytical & Quantitative Cytology & Histology. 16 (4), 253-260 (1994).
  60. Gibbons, C. H., Illigens, B. M., Wang, N., Freeman, R. Quantification of sweat gland innervation: a clinical-pathologic correlation. Neurology. 72 (17), 1479-1486 (2009).
  61. Knust, J., Ochs, M., Gundersen, H. J., Nyengaard, J. R. Stereological estimates of alveolar number and size and capillary length and surface area in mice lungs. Anat Rec. 292 (1), 113-122 (2009).
  62. Mahon, G. J., et al. Chloroquine causes lysosomal dysfunction in neural retina and RPE: implications for retinopathy. Current Eye Research. 28 (4), 277-284 (2004).
  63. Michel, R. P., Cruz-Orive, L. M. Application of the Cavalieri principle and vertical sections method to lung: estimation of volume and pleural surface area. Journal of Microscopy. 150, 117-136 (1988).
  64. Weibel, E. R. Stereological methods in cell biology: where are we--where are we going. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 29 (9), 1043-1052 (1981).
  65. Schmitz, C., Hof, P. R. Design-based stereology in neuroscience. Neuroscience. 130 (4), 813-831 (2005).
  66. Kristiansen, S. L., Nyengaard, J. R. Digital stereology in neuropathology. Apmis. 120 (4), 327-340 (2012).
  67. Howard, C. V., Reed, M. G. . Unbiased Stereology. 2nd edn. , (2005).
  68. Reith, A., Mayhew, T. M. . Stereology and Morphometry in Electron Microscopy: Problems and Solutions. , (1988).
  69. Mouton, P. R. . Principles and practices of unbiased stereology: an introduction for bioscientists. , (2002).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

169SBF SEM3D EM3D

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены