Microscopia eletrônica de varredura de blocos de bloco serial (SBF-SEM) de amostras de tecido biológico

Resumo

Este protocolo descreve um método de rotina para o uso de microscopia eletrônica de varredura em bloco serial (SBF-SEM), uma poderosa técnica de imagem 3D. A aplicação bem sucedida do SBF-SEM depende de técnicas adequadas de fixação e coloração de tecidos, bem como cuidadosa consideração das configurações de imagem. Este protocolo contém considerações práticas para a totalidade deste processo.

Resumo

A microscopia eletrônica de varredura em bloco serial (SBF-SEM) permite a coleta de centenas a milhares de imagens ultraestruturais registradas em série, oferecendo uma visão tridimensional sem precedentes da microanato tecidual. Embora a SBF-SEM tenha visto um aumento exponencial no uso nos últimos anos, aspectos técnicos como a preparação adequada do tecido e parâmetros de imagem são primordiais para o sucesso dessa modalidade de imagem. Este sistema de imagem se beneficia da natureza automatizada do dispositivo, permitindo que se deixe o microscópio desacompanhado durante o processo de imagem, com a coleta automatizada de centenas de imagens possíveis em um único dia. No entanto, sem a preparação adequada da ultraestrutura celular de preparação tecidual pode ser alterada de tal forma que conclusões incorretas ou enganosas possam ser tiradas. Além disso, as imagens são geradas pela varredura da face do bloco de uma amostra biológica incorporada à resina e isso muitas vezes apresenta desafios e considerações que devem ser abordadas. O acúmulo de elétrons dentro do bloco durante a imagem, conhecido como "carregamento de tecido", pode levar a uma perda de contraste e uma incapacidade de apreciar a estrutura celular. Além disso, enquanto o aumento da intensidade/tensão do feixe de elétrons ou a diminuição da velocidade de varredura do feixe pode aumentar a resolução da imagem, isso também pode ter o infeliz efeito colateral de danificar o bloco de resina e distorcer imagens subsequentes na série de imagens. Aqui apresentamos um protocolo de rotina para a preparação de amostras de tecido biológico que preserva a ultraestrutura celular e diminui o carregamento de tecidos. Também fornecemos considerações de imagem para a rápida aquisição de imagens seriais de alta qualidade com danos mínimos ao bloco tecidual.

Introdução

A microscopia eletrônica de varredura facial de blocos seriais (SBF-SEM) foi descrita pela primeira vez por Leighton em 1981, onde ele criou um microscópio eletrônico de varredura aumentado com um microtome embutido que poderia cortar e imagem fina seções de tecido embutido na resina. Infelizmente, limitações técnicas restringiram seu uso a amostras condutoras, pois amostras não condutoras como tecido biológico acumularam níveis inaceitáveis de carregamento (acúmulo de elétrons dentro da amostra de tecido)¹. Embora o revestimento da face do bloco entre os cortes com o carregamento de tecido reduzido de carbono evaporado, este tempo de aquisição de imagens muito maior e o armazenamento de imagens permaneceu um problema, pois a tecnologia de computador na época era insuficiente para gerenciar os grandes tamanhos de arquivos criados pelo dispositivo. Esta metodologia foi revisitada por Denk e Horstmann em 2004 usando um SBF-SEM equipado com uma câmara de pressão variável². Isso permitiu a introdução de vapor de água na câmara de imagem que reduz o carregamento dentro da amostra, tornando viável a imagem de amostras não condutoras, embora com perda de resolução de imagem. Melhorias adicionais nos métodos de preparação e imagem de tecidos agora permitem imagens usando alto vácuo, e a imagem SBF-SEM não depende mais de vapor de água para dissipar o carregamento^{3,4,5,6,7,8,9}. Embora a SBF-SEM tenha visto um aumento exponencial no uso nos últimos anos, aspectos técnicos como a preparação adequada do tecido e parâmetros de imagem são primordiais para o sucesso dessa modalidade de imagem.

O SBF-SEM permite a coleta automatizada de milhares de imagens de microscopia eletrônica registradas em série, com resolução planar tão pequena quanto 3-5 nm^10,11. O tecido, impregnado com metais pesados e embutido em resina, é colocado dentro de um microscópio eletrônico de varredura (SEM) contendo um ultramicrotome equipado com uma faca de diamante. Uma superfície plana é cortada com a faca de diamante, a faca é retraída, e a superfície do bloco é escaneada em um padrão raster com um feixe de elétrons para criar uma imagem de ultraestrutura tecidual. O bloco é então levantado uma quantidade especificada (por exemplo, 100 nm) no eixo z, conhecido como "passo z", e uma nova superfície é cortada antes que o processo seja repetido. Desta forma, um bloco de imagens tridimensionais (3D) é produzido à medida que o tecido é cortado. Este sistema de imagem beneficia ainda mais a natureza automatizada do dispositivo, permitindo que se deixe o microscópio desacompanhado durante o processo de imagem, com a coleta automatizada de centenas de imagens possíveis em um único dia.

Enquanto a imagem SBF-SEM usa principalmente elétrons encarnicados para formar uma imagem do rosto do bloco, elétrons secundários são gerados durante o processo de imagem¹². Elétrons secundários podem se acumular, ao lado de elétrons de feixe primário e requesque-a-pena que não escapam do bloco, e produzem "carregamento de tecido", o que pode levar a um campo eletrostático localizado na face do bloco. Esse acúmulo de elétrons pode distorcer a imagem ou fazer com que os elétrons sejam ejetados do bloco e contribuam para o sinal coletado pelo detector de backscatter, diminuindo a relação sinal-ruído¹³. Embora o nível de carga tecidual possa ser diminuído reduzindo a tensão ou intensidade do feixe de elétrons, ou reduzindo o tempo de moradia do feixe, isso resulta em uma diminuição da relação sinal-ruído¹⁴. Quando um feixe de elétrons de menor tensão ou intensidade é usado, ou o feixe só é permitido habitar dentro de cada espaço de pixel por um período mais curto de tempo, elétrons menos encalulados são ejetados do tecido e capturados pelo detector de elétrons resultando em um sinal mais fraco. Denk e Horstmann lidaram com esse problema introduzindo vapor de água na câmara, reduzindo assim a carga na câmara e na face do bloco ao custo da resolução de imagem. Com uma pressão de câmara de 10-100 Pa, uma porção do feixe de elétrons é espalhada contribuindo para o ruído da imagem e uma perda de resolução, porém isso também produz íons na câmara de espécimes que neutraliza a carga dentro do bloco de amostra². Métodos mais recentes para neutralizar a carga dentro do bloco de amostra usam injeção de gás focal de nitrogênio sobre a face do bloco durante a imagem, ou introduzindo tensão negativa ao estágio SBF-SEM para diminuir a energia de embarque de feixes de sonda e aumentar o sinal coletado^6,7,15. Em vez de introduzir viés de palco, pressão de câmara ou injeção de nitrogênio localizada para diminuir o acúmulo de carga na superfície do bloco, também é possível aumentar a condutividade da resina introduzindo carbono na mistura de resina permitindo configurações de imagem mais agressivas¹⁶. O protocolo geral a seguir é uma adaptação do protocolo Deerinck et al. publicado em 2010 e abrange modificações nas metodologias de preparação e imagem de tecidos que consideramos úteis para minimizar o carregamento de tecidos, mantendo a aquisição de imagens de alta resolução^3,17,18,19. Embora o protocolo mencionado anteriormente tenha focado no processamento de tecidos e na impregnação de metais pesados, este protocolo fornece uma visão sobre o fluxo de trabalho de imagem, análise de dados e reconstrução inerente aos estudos da SBF-SEM. Em nosso laboratório, este protocolo tem sido aplicado com sucesso e reprodutivelmente a uma grande variedade de tecidos, incluindo córneas e estruturas de segmentos anteriores, pálpebras, glândulas lacrimais e mais duras, retina e nervo óptico, coração, pulmão e vias aéreas, rim, fígado, músculo cremaster e córtex cerebral/medula, e em uma variedade de espécies incluindo rato, rato, coelho, cobaia, peixe, monocamada e culturas celulares estratificadas, porco, primata não humano, bem como humano^20,21,22,23. Embora pequenas mudanças possam valer a pena para tecidos e aplicações específicas, este protocolo geral tem se mostrado altamente reprodutível e útil no contexto de nossa instalação de imagem principal.

Protocolo

Todos os animais foram manuseados de acordo com as diretrizes descritas na Declaração de Visão e Oftalmologia da Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia para o Uso de Animais em Visão e Pesquisa Oftalmológica e nas diretrizes de manejo animal da Faculdade de Optometria da Universidade de Houston. Todos os procedimentos de animais foram aprovados pelas instituições em que foram tratados: procedimentos de rato, rato, coelho, cobaia e primatas não humanos foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Houston, procedimentos de zebrafish foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de DePauw, e procedimentos de suínos foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Faculdade de Medicina da Baylor. Todo o tecido humano foi tratado de acordo com a Declaração de Helsinque sobre pesquisas sobre tecido humano e aprovação do conselho de revisão institucional apropriada foi obtida.

1. Processamento de tecidos

1. Prepare uma solução de estoque de tampão de cacodilato de sódio de 0,4 M misturando pó de cacodilato de sódio em ddH₂O. Misture completamente o tampão e o pH ajuste a solução para 7,3. Este buffer é usado para tornar fixativo (composição descrita abaixo na etapa 1.3), tampão de lavagem, bem como soluções de ferrocineto de ósmio e potássio.
   NOTA: A fixação por perfusão é frequentemente o melhor método de fixação para estudos SBF-SEM, pois a fixação ocorre rapidamente e em todo o corpo. Se a fixação por perfusão não for possível dentro do seu projeto de estudo, pule para a etapa 1.3.
2. Realizar fixação de perfusão com a pressão fisiológica adequada para o modelo animal^24,25,26. Isso é feito via perfusão sequencial transcárdica com soro fisiológico heparinizado seguido de fixação, cada um colocado em uma altura específica (por exemplo, 100 cm) acima do organismo (adequado à pressão fisiológica do sistema vascular no modelo animal), com fluxo fixativo para o ventrículo esquerdo, e saindo de uma incisão feita no átrio direito. O tecido de interesse ficará pálido à medida que o sangue for substituído por fixador, se toda ou uma parte do seu tecido não branquear, então o tecido pode não ser adequadamente fixado e a ultraestrutura pode não ser preservada.
3. Use uma lâmina de barbear ou bisturi afiado para aparar amostras de tecido em blocos não maiores que 2 mm x 2 mm x 2 mm. Se o passo 1.2 foi ignorado, faça isso rapidamente para que o tecido possa ser corrigido o mais rápido possível.
   1. Alternativamente, dissecar tecido sob fixação e transferir para fixação fresca para completar o processo de imersão. A composição final do fixador consiste em 0,1 M tampão de cacodilato de sódio contendo 2,5% de glutaraldeído e cloreto de cálcio de 2 mM. A previsão é de que a fixação prossiga por uma mínima de 2 horas em temperatura ambiente e máxima de durante a noite a 4 °C. Se possível, use uma placa de roqueiro/inclinação para agitar suavemente as amostras durante a fixação.
   2. Alternativamente, se um micro-ondas inversor estiver disponível, fixe o tecido no fixador acima mencionado sob vácuo a 150 watts durante 4 ciclos de 1 minuto, 1 minuto de folga. A fixação do micro-ondas é o método preferido para o passo 1.3, pois fixa rapidamente o tecido e preserva a ultraestrutura tecidual²⁷.
      NOTA: O tecido nunca deve ser permitido secar durante este protocolo, deve-se tomar cuidado para transferir tecido rapidamente de uma solução para outra.
4. Lave o tecido fixo 5x por 3 minutos cada (15 minutos no total) à temperatura ambiente em 0,1 M tampão de cacodilato de sódio contendo cloreto de cálcio de 2 mM.
5. Torne a seguinte solução de ferrocianida de ósmio fresco, de preferência durante as etapas anteriores de lavagem. Combine uma solução de tetroxida de 4% de ósmio (preparada em ddH₂O) com um volume igual de ferrocianida de potássio de 3% em tampão de cacodilato de 0,2 M com cloreto de cálcio de 4 mM. Após a etapa anterior de lavagem, coloque o tecido nesta solução por 1 hora no gelo no escuro, e no capô da fumaça.
   NOTA: O tetroxida de ósmio é uma substância cristalina amarela que vem em uma ampola. Para criar a solução de tetroxida de ósmio, abra a ampola, adicione ddH₂O e sonicar por 3-4 horas no escuro até que os cristais sejam completamente dissolvidos. A solução de tetroxida de ósmio é uma solução amarela clara, se a solução for preta o ósmio foi reduzido e não deve mais ser usado.
6. Enquanto o tecido está incubando na solução de ferrocianida de ósmio, comece a preparar a solução de tiocarbohydrazida (TCH). Prepare esta solução fresca e tenha-a prontamente disponível no final do período de fixação de ferrocisídio de 1 hora. Combine 0,1 g de tiocarbohydrazida com 10 mL de ddH₂O e coloque esta solução em um forno de 60 °C por 1 hora. Para garantir que a solução seja dissolvida, gire suavemente a cada 10 minutos. Antes de usar, filtre esta solução através de um filtro de seringa de 0,22 μm.
7. Antes de incubar em TCH, lave o tecido com temperatura ambiente ddH₂O 5x por 3 minutos cada (15 minutos no total).
8. Coloque o tecido na solução TCH filtrada por um total de 20 minutos à temperatura ambiente(Figura 1A-C).
9. Após a incubação em TCH, lave o tecido 5x por 3 minutos cada (15 minutos no total) em temperatura ambiente ddH₂O.
10. Coloque tecido em ddH₂O contendo 2% de tetroxida de ósmio (não osmium reduzido com ferrocida de potássio) por 30 minutos à temperatura ambiente. Isso deve ser feito no capô da fumaça e no escuro, pois o ósmio pode ser reduzido pela luz (por exemplo, sob papel alumínio)(Figura 1D-F).
11. Após a incubação do tetroxida de ósmio, lave o tecido 5x por 3 minutos cada (15 minutos no total) em temperatura ambiente ddH₂O.
12. Coloque tecido em acetato de urânyl 1% aquoso (pó de acetato de urântil misturado em ddH₂O) durante a noite em uma geladeira a 4 °C.
13. Pouco antes de remover tecido da geladeira, prepare a solução de aspartato de chumbo de Walton fresco. Comece dissolvendo 0,066 g de nitrato de chumbo em 10 mL de solução de ácido aspartic de 0,03 M (0,04 g ácido aspartico em 10 mL de água destilada) e ajuste pH para 5,5 com 1 N KOH (0,5611 g em 10 mL de água destilada).
    ATENÇÃO: Um precipitado pode se formar ao ajustar o pH. Isso não é aceitável.
    1. Usando uma barra de mexida, adicione lentamente o 1 N KOH dropwise durante o monitoramento do pH. Pré-aqueça a solução de aspartato de chumbo claro acabado em um forno de 60 °C por 30 minutos. Se um precipitado for a solução não pode ser usada e outra solução deve ser preparada.
14. Retire o tecido da geladeira e lave 5x por 3 minutos cada (15 minutos no total) em temperatura ambiente ddH₂O.
15. Após a lavagem, coloque o tecido na solução de aspartato de chumbo de Walton aquecida por 30 minutos, mantendo a temperatura a 60 °C.
16. Após a incubação no aspartato de chumbo de Walton, lave o tecido 5x por 3 minutos cada (15 minutos no total) em temperatura ambiente ddH₂O(Figura 1G-I).
17. Desidratar o tecido através de uma série de acetona gelada (30%, 50%, 70%, 95%, 95%, 100%, 100% e acetona 100% (em ddH₂O, quando aplicável) permitindo 10 minutos para cada passo da série.
18. Seguindo a série de desidratação gelada, coloque tecido em acetona de temperatura ambiente por 10 minutos.
    1. Durante este período, formular a resina Abed 812 ACM. Use a receita "hard mix", pois é mais resistente ao dano do feixe. Misture bem a resina e coloque o tecido em Incorporar 812:acetona (1:3 mix) por 4 horas, seguido por Embed 812:acetona (1:1 mix) por 8 horas ou durante a noite, e finalmente Incorporar 812:acetona (3:1 mix) durante a noite. Realize estas etapas de infiltração de resina à temperatura ambiente.
19. No dia seguinte, coloque o tecido em 100% Incorporar 812 por 4-8 horas, depois em 100% fresco incorporar 812 durante a noite, e finalmente em 100% fresco Incorporar 812 por 4 horas. Realize estas etapas de infiltração de resina à temperatura ambiente.
    1. Pouco antes de incorporar, coloque uma pequena quantidade de resina em um recipiente de mistura e misture lentamente (uma vara de madeira pode ser usada para mexer) em pó preto carbono até que a resina esteja saturada com o pó, mas ainda é fluida e não se torna granulada. Deve se assemelhar a tinta grossa e ser capaz de gotejar lentamente da vara de madeira sem aglomerados visíveis.
20. Oriente as amostras de tecido em um molde de borracha de silicone e tire uma foto para que a orientação da amostra dentro do bloco de resina seja registrada e possa ser referenciada. Cubra as amostras em resina saturada preta de carbono na ponta do molde de silicone e coloque o molde em um forno por ~1 hora a 65 °C.
    1. Coloque o molde em uma inclinação para conter a resina na ponta do molde onde cobre a amostra de tecido. Coloque um rótulo com um identificador de amostra de experimento/tecido no molde na extremidade oposta da resina (Figura 2A).
21. Retire o molde de silicone do forno e encha o restante do molde com resina clara (sem preto carbono) certificando-se de que o rótulo permaneça visível. Cure a resina infundida com carbono preto o suficiente para não se misturar prontamente com a resina clara.
    1. Prepare um poço extra dentro do molde que não contenha tecido. Começando com o poço extra, encha o restante do molde com resina clara.
    2. Se a resina infundida preta de carbono começar a sangrar na resina clara, coloque o molde de silicone de volta no forno por mais tempo (por exemplo, 15 minutos).
    3. Uma vez que todas as amostras de tecido tenham sido cobertas com resina clara, coloque o molde de silicone de volta no forno (plano, sem inclinação) a 65 °C por 48 horas para completar o processo de cura.

2. Preparação do bloco

NOTA: O método dependerá de como a amostra é orientada no bloco e como a secção deve ocorrer. No entanto, a orientação tecidual mais comum encontra o tecido centrado na ponta do bloco de resina, perpendicular à extremidade longa do bloco de resina.

1. Na maioria dos casos, primeiro corte a extremidade do bloco para localizar o tecido colocando o bloco de espécime no mandril de microtoma com a extremidade afilada furando aproximadamente 5-6 mm para fora do mandril. Coloque-o no lugar com o parafuso definido e coloque-o sob uma lâmpada de calor.
2. Após alguns minutos, o bloco será maleável e fácil de aparar. Coloque o mandril no suporte do estereomicroscope e use uma nova lâmina de barbear de duas bordas para fazer seções finas paralelas com a face do bloco até que o tecido esteja visível. Isso é melhor visto pela luz de angling através da face do bloco, a amostra de tecido será menos reflexiva e granular em comparação com as porções da resina que são desprovidas de tecido. Consulte a fotografia tirada de amostras de tecido antes da introdução de resina saturada preta de carbono para uma ideia de como e onde o tecido está localizado.
3. Coloque um suporte de pino de amostra de lado para fins de corte. Este suporte de pinos nunca é colocado na câmara SEM e, portanto, pode ser manuseado sem luvas, este será referido como o suporte de pino de corte. Qualquer porta-espécimes destinado a ser colocado na câmara de imagem nunca deve ser tocado sem luvas. Isso evita introduzir graxa e óleo na câmara de microscópio.
4. Coloque um pino de alumínio no suporte do pino de corte e aperte ligeiramente o parafuso do conjunto com a face (superfície plana) do pino 3-4mm acima do suporte do pino.
5. Faça vários arranhões profundos e cruzados na face do pino para fornecer uma área de superfície maior para a cola usada para manter o espécime no lugar. Se um pino de alumínio for usado, uma pequena chave de fenda de aço é recomendada para esta etapa(Figura 2B).
6. Coloque o mandril contendo a amostra de tecido de volta sob a lâmpada de calor até que a resina fique macia e maleável, em seguida, coloque-a no recipiente de mandril sob o estereóscópio.
7. Usando uma lâmina de barbear de dois gumes para cortar o excesso de resina da porção do bloco de resina contendo a amostra de tecido. Em última análise, o tamanho do bloco de tecido ligado ao pino terá aproximadamente 3 mm de diâmetro e 2-3 mm de altura.
   1. Empurre cuidadosamente a navalha para baixo no bloco de resina cerca de 1-2 mm, em seguida, empurre cuidadosamente a navalha horizontalmente para o bloco de resina a uma profundidade igual ao corte anterior. Faça isso devagar e com muito cuidado, pois é possível danificar ou cortar a porção do bloco que contém a amostra de tecido. À medida que os dois cortes se encontram, o excesso de resina se separará do bloco. Continue a remover a resina até que apenas uma área elevada de 3 mm x 3 mm permaneça.
8. Após este corte inicial, coloque o bloco (ainda no mandril) sob a lâmpada de calor por vários minutos.
9. Uma vez que a resina se torne macia e maleável, coloque o bloco de volta sob o estereóscópio. Usando uma nova lâmina de barbear de dois gumes, corte a parte superior do bloco de resina, cerca de 1 mm abaixo da porção aparada, com um único corte suave. Uma superfície plana é preferível, pois esta será colada ao pino do espécime. Tenha cuidado para não permitir que a amostra se perca, pois esta etapa requer alguma força que possa ser transferida para a parte removida do bloco e fazê-la voar para longe. Coloque a amostra cortada e aparada de lado.
10. Coloque o suporte do pino de corte contendo o pino de alumínio cortado no recipiente estereomicroscope. Aplique uma fina camada de cola cianoacrilato no rosto do pino de tal forma que cubra completamente o pino sem formar um menisco visível. Pegue o pedaço aparado do bloco de tecido com fórceps e coloque na cara do pino. Centralizar a amostra de tecido no pino da amostra. Empurre-o para baixo e segure-o por vários segundos. Deixe a cola definida por vários minutos.
11. Quando a cola estiver completamente seca, coloque o suporte do pino de corte de volta sob o estereomicroscópio. Usando um arquivo fino, arquive o excesso de resina para que nenhuma resina esteja sobrecarregando o pino. A forma de resina deve se assemelhar à cabeça do pino circular.
12. Localize o tecido na parte levantada do seu bloco de resina, a iluminação oblíqua é útil para isso. Utilizando uma navalha de duas bordas, a porção elevada da resina contendo a amostra de tecido deve ser aparada a uma área não maior que 1 mm². Se possível, o face do bloco pode ser aparado ainda menor, isso reduzirá o estresse na faca de diamante e melhorará sua longevidade.
    1. Remova o máximo de excesso de resina possível, deixando o bloco um pouco mais longo em uma dimensão. Isso é feito lentamente e com cuidado, pois é possível que a resina contendo a amostra de tecido se rompam se muita força for aplicada. Enquanto uma navalha é recomendada, um arquivo de metal fino pode ser usado para esta etapa.
13. Com um ângulo de arquivo metálico fino o excesso de resina, na área fora da porção levantada contendo a amostra de tecido, até a borda do pino(Figura 2C).
14. Remova partículas de resina e poeira da amostra preparada antes de aplicar tinta prateada seguida de sputtering de ouro. Misture a prata com acetona de modo que seja um líquido facilmente difundido, semelhante ao esmalte (mas não tão fino que escorre do aplicador) e aplique uma camada fina em toda a superfície do bloco de amostra. A acetona evapora rapidamente, por isso pode ser necessário adicionar acetona adicional à medida que a tinta prateada começa a engrossar.
    1. Deixe a tinta prateada secar durante a noite antes de carregar no microscópio.
       NOTA: Esta camada de prata deve ser fina para evitar a expansão da face do bloco para além de 1 mm x 1 mm, e embora a tinta prateada nunca tenha danificado a faca de diamante, rostos de blocos menores ainda são recomendados para preservar a longevidade da faca de diamante. A acetona misturada com a prata deve evaporar completamente antes de sputtering de ouro ou carregar a amostra no microscópio para evitar a introdução de vapor de acetona na câmara de imagem.
    2. Após a aplicação da tinta prateada, aplique uma fina camada de ouro no bloco de amostra. Usando um dispositivo padrão de espiar a vácuo equipado com um alvo de folha de ouro padrão, uma pressão de câmara de 200 militor (gás Argon) e 40 miliamperes funcionando por 2 minutos resultará em um revestimento dourado de 20 nm de espessura.
15. Após o revestimento, coloque o bloco montado e aparado em um tubo com o rótulo de experimento apropriado anexado. Crie tubos personalizados usando pipetas de transferência descartáveis.
    1. Corte a pipeta de transferência logo abaixo da lâmpada, deixando uma pequena parte do tubo de pipeta de transferência preso abaixo da extremidade bulbosa. Encurte a porção tubular que foi cortada, e corte a ponta da pipeta para trás o suficiente para que o pino da amostra de alumínio possa ser empurrado aconchegantemente dentro dele.
    2. Coloque a extremidade contendo o pino da amostra de alumínio dentro da extremidade bulbosa da pipeta de transferência modificada.
16. Antes de carregar um bloco de tecido preparado, corte cuidadosamente o excesso de tinta prateada da superfície da face do bloco.

3. Configurações SEM para imagem da face do bloco

NOTA: As configurações de imagem que se seguem foram produzidas no dispositivo utilizado pelos autores, que está listado na Tabela de Materiais fornecidas. Embora este dispositivo seja capaz de imagens de pressão variável, os melhores resultados foram capturados sob alto vácuo.

1. Tempo de moradia: Use 12 μs/px durante a seção serial. Quando uma região de interesse foi identificada, uma imagem de maior resolução pode ser adquirida a 32 μs/px.
2. Configurações de vácuo: Use uma pressão de arma de 9e-008 Pa, uma pressão de coluna de 1.1e-004 Pa, e uma pressão de câmara de 9.5e-002 Pa.
3. Tempo de captura: Com as configurações acima, capture uma pilha de imagens 2048x2048 px a uma taxa de 50 segundos por imagem. Imagens de maior resolução de regiões de interesse podem ser capturadas em 4096x4096 px a pouco menos de 9 minutos por imagem.
4. Espessura da seção: Use 100-200 nm. Menos é possível, mas pode exigir menor tensão do feixe, intensidade ou tempo de moradia.
5. Alta Tensão (HV): Use 7-12 kV. Embora o aumento da tensão reduza o tamanho da mancha e aumente a resolução, ele introduz mais possibilidade de danos nos raios. KV mais alto aumenta a penetração do feixe, o que resulta em perda de detalhes. No entanto, a redução do kV degrada a relação sinal para ruído(Figura 3)¹⁴.
6. Intensidade do feixe (BI): O dispositivo SBF-SEM do autor oferece uma escala de intensidade de feixe que varia de 1 a 20. Nesta escala, os valores de 5-7 dão imagens de qualidade sem carregamento excessivo e danos na viga. Quanto maior o BI, maior a resolução, porém, há mais chance de cobrança e dano de feixe¹⁴.
7. Tamanho do ponto e ampliação da imagem: Determine o tamanho da mancha pelo nível de intensidade e tensão do feixe. Idealmente, o tamanho do spot não deve ser maior do que o tamanho do pixel usado. O tamanho do pixel é determinado dividindo o campo de visão (FOV) pelo número de pixels. Por exemplo, um FOV de 25 μm com um tamanho de imagem de 2048x2048 px daria 12,2 nm por pixel. Portanto, o tamanho da mancha não deve ser superior a 12,2 nm. A Figura 4 mostra como hv, BI e tamanho da mancha estão relacionados.
8. Distância de Trabalho (WD) - Com a imagem do rosto do bloco, a distância de trabalho não é ajustável. É simplesmente um fator de foco. Será quase idêntico para todos os blocos retratados. Embora a distância de trabalho não seja ajustável, ela desempenha um papel crítico na resolução da imagem capturada. À medida que a distância de trabalho diminui, o limite de resolução das imagens capturadas aumenta. Em alguns casos, pode ser possível diminuir a distância de trabalho fazendo modificações dentro da câmara de imagem, porém essas modificações devem ser feitas a critério do usuário. A fim de diminuir a distância de trabalho e aumentar a resolução da imagem, afrouxamos os parafusos de microtómeo do suporte da porta e reposicionamos o microtómeo para que ele descansasse ~2 mm mais perto do detector de feixe depois de reposicionar os parafusos.
9. Resolução - Utilizando as configurações acima, é possível a resolução x & y de até 3,8 nm. É importante notar que a resolução é limitada pelo tamanho do ponto do feixe, bem como a resolução de pixels das capturas de imagem (por exemplo, um campo de visão de 20 μm capturado em uma imagem de 2048x2048 pixel tem uma resolução de pixel de 9,8 nm, mesmo que um tamanho de ponto de 3,8 nm tenha sido usado). A resolução de imagem no z-plane depende da espessura de secção, descobrimos que 100-200 nm funciona bem com este protocolo.

Resultados

Córnea-de-rato
Este protocolo foi aplicado extensivamente à córnea do rato. Utilizando imagens SBF-SEM, uma rede de pacotes de microfibril sem elastina (EFMBs) mostrou-se presente dentro da córnea do rato adulto. Acreditava-se anteriormente que essa rede só estava presente durante o desenvolvimento pós-natal embrionário e precoce. A SBF-SEM revelou uma extensa rede EFMB em toda a córnea, com fibras individuais encontradas com 100-200 nm de diâmetro quando medidas em seção transversal. Verif...

Discussão

O objetivo deste artigo de métodos é destacar a metodologia de preparação e imagem de tecidos que permitiu ao nosso laboratório capturar de forma confiável imagens de microscopia eletrônica serial de alta resolução, e apontar passos críticos que levam a esse resultado, bem como potenciais armadilhas que podem ocorrer ao realizar imagens SBF-SEM. O sucesso com este protocolo requer fixação adequada do tecido, impregnação de metais pesados na amostra, modificações da resina de incorporação para reduzir o ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1/16 x 3/8 Aluminum Rivets	Industrial Rivet & Fastener Co.	6N37RFLAP/1100	Used as specimen pins.
2.5mm Flathead Screwdriver	Wiha Quality Tools	27225
Acetone	Electron Microscopy Sciences	RT 10000	Used to dilute silver paint.
Aspartic Acid	Sigma-Aldrich	A8949
Calcium Chloride	FisherScientific	C79-500
Conductive Silver Paint	Ted Pella	16062
Denton Desk-II Vacuum Sputtering Device equipped with standard gold foil target	Denton Vacuum	N/A	This is the gold-sputtering device used by the authors, alternates are acceptable.
Double-edged Razors	Fisher Scientific	50-949-411
Embed 812	Electron Microscopy Sciences	14120
Gatan 3View2 mounted in a Tescan Mira3 Field emission SEM	Gatan & Tescan	N/A	This is the SBF-SEM device used by the authors, alternates are acceptable.
Glass Shell Vials, 0.5 DRAM (1.8 ml)	Electron Microscopy Sciences	72630-05
Gluteraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16320
Gorilla Super Glue - Impact Tough	NA	NA	Refered to as cyanoacrylate glue in text.
Ketjen Black	HM Royal	EC-600JD	Refered to as carbon black in text.
KOH	FisherScientific	18-605-593
Lead Nitrate	Fisher Scientific	L62-100
Microwave	Pelco	BioWave Pro	This is the microwave used by the authors, alternates are acceptable.
Osmium Tetroxide	Sigma-Aldrich	201030
Potassium Ferrocyanide	Sigma-Aldrich	P9387
Silicone Embedding Mold	Ted Pella	10504
Sodium Cacodylate Trihydrate	Electron Microscopy Sciences	12300
Samco Transfer Pipette	ThermoFisher Scientific	202	Used to make specimen pin storage tubes.
Swiss Pattern Needle Files	Electron Microscopy Sciences	62115
Thiocarbohydrazide	Sigma-Aldrich	223220
Uranyl Acetate	Polysciences, Inc.	21447-25
Reconstruction Software
Amira Software	Thermo Scientific	N/A	Used to create the reconstructions found in figures 5-7 and 9.
Fiji (Fiji is Just ImageJ)	ImageJ.net	N/A	TrakEM2 can be added to Fiji to asist in manual segmentation.
Microscopy Image Browser (MIB)	University of Helsinki, Institute of Biotechnology	N/A
Reconstuct Software	Neural Systems Lab	N/A
SuRVoS Workbench	Diamond Light Source & The University of Nottingham	N/A
SyGlass	IstoVisio, Inc.	N/A	Allows for reconstruction in virtual reality and histogram-based reconstruction methods.