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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo protocollo delinea un metodo di routine per l'utilizzo della microscopia elettronica seriale a scansione block-face (SBF-SEM), una potente tecnica di imaging 3D. L'applicazione di successo di SBF-SEM dipende da corrette tecniche di fissazione e colorazione dei tessuti, nonché da un'attenta considerazione delle impostazioni di imaging. Questo protocollo contiene considerazioni pratiche per l'intero processo.

Abstract

La microscopia elettronica seriale a scansione a blocchi (SBF-SEM) consente la raccolta da centinaia a migliaia di immagini ultrastrutturali registrate in serie, offrendo una visione tridimensionale senza precedenti della microanatomia tissutale. Mentre SBF-SEM ha visto un aumento esponenziale dell'uso negli ultimi anni, aspetti tecnici come una corretta preparazione dei tessuti e parametri di imaging sono fondamentali per il successo di questa modalità di imaging. Questo sistema di imaging beneficia della natura automatizzata del dispositivo, consentendo di lasciare il microscopio incustodito durante il processo di imaging, con la raccolta automatizzata di centinaia di immagini possibili in un solo giorno. Tuttavia, senza un'adeguata preparazione dei tessuti, l'ultrastruttura cellulare può essere modificata in modo tale da poter trarre conclusioni errate o fuorvianti. Inoltre, le immagini vengono generate scansionando la faccia a blocchi di un campione biologico incorporato nella resina e questo spesso presenta sfide e considerazioni che devono essere affrontate. L'accumulo di elettroni all'interno del blocco durante l'imaging, noto come "carica tissutale", può portare a una perdita di contrasto e all'incapacità di apprezzare la struttura cellulare. Inoltre, mentre l'aumento dell'intensità/tensione del fascio di elettroni o la diminuzione della velocità di scansione del fascio possono aumentare la risoluzione dell'immagine, questo può anche avere lo sfortunato effetto collaterale di danneggiare il blocco di resina e distorcere le immagini successive nella serie di imaging. Qui presentiamo un protocollo di routine per la preparazione di campioni di tessuto biologico che preserva l'ultrastruttura cellulare e diminuisce la carica tissutale. Forniamo anche considerazioni di imaging per la rapida acquisizione di immagini seriali di alta qualità con danni minimi al blocco tissutale.

Introduzione

La microscopia elettronica a scansione facciale a blocchi seriali (SBF-SEM) è stata descritta per la prima volta da Leighton nel 1981, dove ha modellato un microscopio elettronico a scansione potenziato con un microtomo incorporato in grado di tagliare e tagliare sottili sezioni di tessuto incorporate nella resina. Sfortunatamente, le limitazioni tecniche ne limitavano l'uso a campioni conduttivi, poiché campioni non conduttivi come il tessuto biologico accumulavano livelli inaccettabili di carica (accumulo di elettroni all'interno del campione di tessuto)1. Mentre rivesteva il blocco-faccia tra i tagli con la ricarica dei tessuti ridotta al carbonio evaporato, questo aumentò notevolmente il tempo di acquisizione dell'imaging e la memorizzazione delle immagini rimase un problema poiché la tecnologia informatica all'epoca era insufficiente per gestire le grandi dimensioni dei file create dal dispositivo. Questa metodologia è stata rivisitata da Denk e Horstmann nel 2004 utilizzando uno SBF-SEM dotato di una camera a pressionevariabile 2. Ciò ha permesso l'introduzione del vapore acqueo nella camera di imaging che riduce la carica all'interno del campione, rendendo praticabile l'imaging di campioni non conduttivi anche se con una perdita di risoluzione dell'immagine. Ulteriori miglioramenti nella preparazione dei tessuti e nei metodi di imaging ora consentono l'imaging utilizzando un alto vuoto e l'imaging SBF-SEM non si basa più sul vapore acqueo per dissiparela carica 3,4,5,6,7,8,9. Mentre SBF-SEM ha visto un aumento esponenziale dell'uso negli ultimi anni, aspetti tecnici come una corretta preparazione dei tessuti e parametri di imaging sono fondamentali per il successo di questa modalità di imaging.

SBF-SEM consente la raccolta automatizzata di migliaia di immagini di microscopia elettronica registrate in serie, con risoluzione planare fino a 3-5 nm10,11. Il tessuto, impregnato di metalli pesanti e incorporato nella resina, è posto all'interno di un microscopio elettronico a scansione (SEM) contenente un ultramicrotoma dotato di coltello a diamante. Una superficie piana viene tagliata con il coltello a diamante, il coltello viene retratti e la superficie del blocco viene scansionata in un motivo raster con un fascio di elettroni per creare un'immagine di ultrastruttura tissutale. Il blocco viene quindi sollevato una quantità specificata (ad esempio, 100 nm) nell'asse Z, noto come "passo z", e una nuova superficie viene tagliata prima che il processo si ripeta. In questo modo viene prodotto un blocco di immagini tridimensionale (3D) man mano che il tessuto viene tagliato. Questo sistema di imaging beneficia ulteriormente della natura automatizzata del dispositivo, consentendo di lasciare il microscopio incustodito durante il processo di imaging, con la raccolta automatizzata di centinaia di immagini possibili in un solo giorno.

Mentre l'imaging SBF-SEM utilizza principalmente elettroni retroscatterati per formare un'immagine della faccia del blocco, gli elettroni secondari vengono generati durante il processo di imaging12. Gli elettroni secondari possono accumularsi, insieme agli elettroni retroscatterati e a fascio primario che non sfuggono al blocco, e produrre "carica tissutale", che può portare a un campo elettrostatico localizzato nella faccia del blocco. Questo accumulo di elettroni può distorcere l'immagine o causare l'espulsa di elettroni dal blocco e contribuire al segnale raccolto dal rivelatore backscatter, diminuendo il rapporto segnale-rumore13. Mentre il livello di carica tissutale può essere diminuito riducendo la tensione o l'intensità del fascio di elettroni o riducendo il tempo di divaggio del fascio, ciò si traduce in un rapporto segnale-rumoreridotto 14. Quando si utilizza un fascio di elettroni di tensione o intensità inferiore, o il fascio può abitare all'interno di ogni spazio di pixel solo per un periodo di tempo più breve, meno elettroni retroscatterati vengono espulsi dal tessuto e catturati dal rivelatore di elettroni con conseguente segnale più debole. Denk e Horstmann affrontavano questo problema introducendo vapore acqueo nella camera, riducendo così la carica nella camera e sulla faccia del blocco a costo della risoluzione dell'immagine. Con una pressione della camera di 10-100 Pa, una porzione del fascio di elettroni è sparsa contribuendo al rumore dell'immagine e alla perdita di risoluzione, tuttavia questo produce anche ioni nella camera del campione che neutralizza la carica all'interno del bloccocampione 2. Metodi più recenti per neutralizzare la carica all'interno del blocco campione utilizzano l'iniezione focale di gas di azoto sulla faccia del blocco durante l'imaging, o introducendo tensione negativa allo stadio SBF-SEM per ridurre l'energia di carico sonda-fascio e aumentare ilsegnale raccolto 6,7,15. Piuttosto che introdurre distorsioni dello stadio, pressione della camera o iniezione di azoto localizzata per ridurre l'accumulo di carica sulla superficie del blocco, è anche possibile aumentare la conducibilità della resina introducendo carbonio nella miscela di resina consentendo impostazioni di imaging più aggressive16. Il seguente protocollo generale è un adattamento del protocollo Deerinck et al. Mentre il protocollo precedentemente menzionato si concentrava sull'elaborazione dei tessuti e sull'impregnazione di metalli pesanti, questo protocollo fornisce informazioni sul flusso di lavoro di imaging, analisi dei dati e ricostruzione inerente agli studi SBF-SEM. Nel nostro laboratorio, questo protocollo è stato applicato con successo e riproducibile a un'ampia varietà di tessuti tra cui cornea e strutture del segmento anteriore, palpebra, ghiandola lacrimale e harderiana, retina e nervo ottico, cuore, polmone e vie aeree, rene, fegato, muscolo cremastere e corteccia cerebrale / midollo, e in una varietà di specie tra cui topo, ratto, coniglio, porcellino d'India, pesce, monostrato e colture cellulari stratificate, maiale, primate non umano,nonché umano 20,21,22,23. Sebbene piccoli cambiamenti possano essere utili per tessuti e applicazioni specifici, questo protocollo generale si è dimostrato altamente riproducibile e utile nel contesto della nostra struttura di imaging di base.

Protocollo

Tutti gli animali sono stati trattati secondo le linee guida descritte nella Dichiarazione dell'Association for Research in Vision and Ofthalmology per l'uso degli animali nella ricerca sulla vista e sugli oftalmici e nelle linee guida per la manipolazione animale dell'University of Houston College of Optometry. Tutte le procedure per gli animali sono state approvate dalle istituzioni in cui sono state gestite: le procedure per topi, ratti, conigli, cavie e primati non umani sono state approvate dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Houston, le procedure zebrafish sono state approvate dal Comitato per la cura e l'uso degli animali della DePauw University e le procedure suino sono state approvate dal Baylor College of Medicine Animal Care and Use Committee. Tutto il tessuto umano è stato trattato in conformità con la dichiarazione di Helsinki in merito alla ricerca sui tessuti umani ed è stata ottenuta un'adeguata approvazione del comitato di revisione istituzionale.

1. Lavorazione dei tessuti

  1. Preparare una soluzione stock di tampone di cacodilato di sodio da 0,4 M mescolando la polvere di cacodilato di sodio in ddH2O. Mescolare accuratamente tampone e pH regolare la soluzione a 7.3. Questo tampone viene utilizzato per rendere fissivo (composizione descritta di seguito nel passaggio 1.3), tampone di lavaggio, nonché soluzioni di osmio e ferrocianuro di potassio.
    NOTA: La fissazione della perfusione è spesso il miglior metodo di fissazione per gli studi SBF-SEM, poiché la fissazione avviene rapidamente e in tutto il corpo. Se la fissazione della perfusione non è possibile all'interno del progetto di studio, passare al passaggio 1.3.
  2. Eseguire la fissazione della perfusione con la pressione fisiologica appropriata perl'animale modello 24,25,26. Questo viene fatto tramite perfusione sequenziale transcardica con salina eparinizzata seguita da fissante, ognuno posto ad un'altezza specifica (ad esempio, 100 cm) sopra l'organismo (appropriato alla pressione fisiologica del sistema vascolare nel modello animale), con un flusso fisso nel ventricolo sinistro e uscendo da un'incisione fatta nell'atrio destro. Il tessuto di interesse diventerà pallido man mano che il sangue viene sostituito con fissativo, se tutto o una parte del tessuto non sbianca, il tessuto potrebbe non essere fissato in modo appropriato e l'ultrastruttura potrebbe non essere preservata.
  3. Utilizzare una lama di rasoio o bisturi affilato per tagliare campioni di tessuto in blocchi non più grandi di 2 mm x 2 mm x 2 mm. Se il passaggio 1.2 è stato saltato, farlo rapidamente in modo che il tessuto possa essere riparato il più rapidamente possibile.
    1. In alternativa, sezionare il tessuto sotto fissante e passare a un fresco fissatore per completare il processo di immersione. La composizione finale del fissatore consiste in 0,1 M di tampone di cacodilato di sodio contenente il 2,5% di glutaraldeide e 2 mM di cloruro di calcio. Lasciare procedere la fissazione per un minimo di 2 ore a temperatura ambiente e un massimo di pernottamento a 4 °C. Se possibile, utilizzare una piastra rocker/tilt per agitare delicatamente i campioni durante il fissaggio.
    2. In alternativa, se è disponibile un forno a microonde inverter, fissare il tessuto nel suddetto fissatore sotto vuoto a 150 watt per 4 cicli di 1 minuto di accensione, 1 minuto di riposo. La fissazione a microonde è il metodo preferito per il passaggio 1.3 in quanto fissa rapidamente i tessuti e preserva l'ultrastrutturatissutale 27.
      NOTA: Il tessuto non deve mai essere lasciato asciugare durante questo protocollo, bisogna fare attenzione a trasferire rapidamente i tessuti da una soluzione all'altra.
  4. Lavare il tessuto fisso 5 volte per 3 minuti ciascuno (15 minuti totali) a temperatura ambiente in tampone di cacodilato di sodio da 0,1 M contenente cloruro di calcio da 2 mM.
  5. Rendere fresca la seguente soluzione di ferrocianuro di osmio, preferibilmente durante le fasi di lavaggio precedenti. Combinare una soluzione di tetrossido di osmio al 4% (preparata in ddH2O) con un volume uguale del 3% di ferrocianuro di potassio in tampone cacodilato da 0,2 M con cloruro di calcio da 4 mM. Dopo la precedente fase di lavaggio, posizionare il tessuto in questa soluzione per 1 ora sul ghiaccio al buio e nel cappuccio dei fumi.
    NOTA: Il tetrossido di osmio è una sostanza cristallina gialla che viene fornita in un'ampola. Per creare la soluzione di tetrossido di osmio, aprire l'ampola, aggiungere ddH2O e sonicare per 3-4 ore al buio fino a quando i cristalli non sono completamente sciolti. La soluzione di tetrossido di osmio è una soluzione giallo chiaro, se la soluzione è nera l'osmio è stato ridotto e non deve più essere utilizzato.
  6. Mentre il tessuto sta incubando nella soluzione di ferrocianuro di osmio, iniziare a preparare la soluzione di tiocarboidrazide (TCH). Preparare questa soluzione fresca e rla prontamente disponibile alla fine del periodo di fissazione dell'osmio ferrocianuro di 1 ora. Unire 0,1 g di tiocarboidrazide con 10 mL di ddH2O e posizionare questa soluzione in un forno a 60 °C per 1 ora. Per assicurarsi che la soluzione sia sciolta, ruotare delicatamente ogni 10 minuti. Prima dell'uso, filtrare questa soluzione attraverso un filtro siringa da 0,22 μm.
  7. Prima di incubare in TCH, lavare il tessuto con temperatura ambiente ddH2O 5x per 3 minuti ciascuno (15 minuti in totale).
  8. Posizionare il tessuto nella soluzione TCH filtrata per un totale di 20 minuti a temperatura ambiente (Figura 1A-C).
  9. Dopo l'incubazione in TCH, lavare il tessuto 5 volte per 3 minuti ciascuno (15 minuti totali) a temperatura ambiente ddH2O.
  10. Mettere il tessuto in ddH2O contenente il 2% di tetrossido di osmio (non osmio ridotto con ferrocianuro di potassio) per 30 minuti a temperatura ambiente. Questo dovrebbe essere fatto nella cappa dei fumi e al buio in quanto l'osmio può essere ridotto dalla luce (ad esempio, sotto un foglio dialluminio) (figura 1D-F).
  11. Dopo l'incubazione di tetrossido di osmio, lavare il tessuto 5 volte per 3 minuti ciascuno (15 minuti totali) a temperatura ambiente ddH2O.
  12. Mettere il tessuto in acetato di uro uro acquoso all'1% (polvere di acetato di uro di uro mescolato in ddH2O) durante la notte in frigorifero a 4 °C.
  13. Poco prima di rimuovere il tessuto dal frigorifero, preparare la soluzione aspartata di piombo di Walton fresca. Iniziare sciogliendo 0,066 g di nitrato di piombo in 10 mL di soluzione di acido aspartico da 0,03 M (0,04 g di acido aspartico in 10 mL di acqua distillata) e regolare il pH a 5,5 con 1 N KOH (0,5611 g in 10 mL di acqua distillata).
    ATTENZIONE: Un precipitato può formarsi quando si regola il pH. Questo non è accettabile.
    1. Utilizzando una barra di agitazione, aggiungere lentamente il dropwise da 1 N KOH durante il monitoraggio del pH. Preriscaldare la soluzione di aspartato di piombo chiaro finita in forno a 60 °C per 30 minuti. Se si forma un precipitato, la soluzione non può essere utilizzata e deve essere preparata un'altra soluzione.
  14. Rimuovere il tessuto dal frigorifero e lavare 5 volte per 3 minuti ciascuno (15 minuti totali) a temperatura ambiente ddH2O.
  15. Dopo il lavaggio, posizionare il tessuto nella soluzione di aspartato di piombo di Walton riscaldata per 30 minuti mantenendo la temperatura a 60 °C.
  16. Dopo l'incubazione nell'aspartato di piombo di Walton, lavare il tessuto 5 volte per 3 minuti ciascuno (15 minuti totali) a temperatura ambiente ddH2O(Figura 1G-I).
  17. Disidratare il tessuto attraverso una serie di acetone ghiacciato (30%, 50%, 70%, 95%, 95%, 100%, 100% e acetone al 100% (in ddH2O se applicabile) consentendo 10 minuti per ogni fase della serie.
  18. Dopo la serie di disidratazione ghiacciata, mettere il tessuto in acetone a temperatura ambiente per 10 minuti.
    1. Durante questo periodo, formulare la resina Embed 812 ACM. Usa la ricetta "hard mix" in quanto è più resistente ai danni al fascio. Mescolare accuratamente la resina e posizionare il tessuto in Embed 812:acetone (1:3 mix) per 4 ore, seguito da Embed 812:acetone (1:1 mix) per 8 ore o durante la notte, e infine Incorporare 812:acetone (3:1 mix) durante la notte. Eseguire questi passaggi di infiltrazione di resina a temperatura ambiente.
  19. Il giorno successivo, posiziona il tessuto in 100% Embed 812 per 4-8 ore, quindi in fresco 100% Embed 812 durante la notte e infine in fresco 100% Embed 812 per 4 ore. Eseguire questi passaggi di infiltrazione di resina a temperatura ambiente.
    1. Poco prima dell'incorporamento, posizionare una piccola quantità di resina in un contenitore di miscelazione e mescolare lentamente (un bastone di legno può essere utilizzato per mescolare) in polvere nera fumo fino a quando la resina non è satura della polvere ma è ancora fluida e non diventa granulosa. Dovrebbe assomigliare all'inchiostro spesso ed essere in grado di gocciolare lentamente dal bastone di legno senza grumi visibili.
  20. Orientare i campioni di tessuto in uno stampo in gomma siliconica e scattare una foto in modo che l'orientamento del campione all'interno del blocco di resina venga registrato e possa essere referenziato. Coprire i campioni in resina satura nera fumo sulla punta dello stampo in silicone e posizionare lo stampo in un forno per ~ 1 ora a 65 °C.
    1. Posizionare lo stampo su una pendenza per contenere la resina sulla punta dello stampo dove copre il campione di tessuto. Posizionare un'etichetta con un identificatore di campione esperimento/tessuto nello stampo all'estremità opposta della resina (Figura 2A).
  21. Rimuovere lo stampo in silicone dal forno e riempire il resto dello stampo con resina trasparente (senza nero fumo) assicurandosi che l'etichetta rimanga visibile. Curare la resina infusa con nero fumo abbastanza da non mescolare facilmente con la resina trasparente.
    1. Preparare un pozzo in più all'interno dello stampo che non contenga tessuto. A partire dal pozzo extra, riempire il resto dello stampo con resina trasparente.
    2. Se la resina infusa nero fumo inizia a sanguinare nella resina trasparente, riposizionare lo stampo in silicone nel forno per un ulteriore tempo (ad esempio, 15 minuti).
    3. Una volta che tutti i campioni di tessuto sono stati completati con resina trasparente, riposizionare lo stampo in silicone nel forno (piatto, senza inclinazione) a 65 °C per 48 ore per completare il processo di polimerizzazione.

2. Preparazione del blocco

NOTA: Il metodo dipenderà da come il campione è orientato nel blocco e da come deve avvenire il sessatura. Tuttavia, l'orientamento tissutale più comune trova il tessuto centrato nella punta del blocco di resina, perpendicolare all'estremità lunga del blocco di resina.

  1. Nella maggior parte dei casi, tagliare prima l'estremità del blocco per localizzare il tessuto posizionando il blocco del campione nel mandrino del microtomo con l'estremità affusolata che sporge circa 5-6 mm dal mandrino. Bloccarlo in posizione con la vite impostata e posizionarlo sotto una lampada termica.
  2. Dopo diversi minuti il blocco sarà malleabile e facile da tagliare. Posizionare il mandrino nel supporto stereomicroscopio e utilizzare una nuova lama di rasoio a doppio bordo per rendere le sezioni sottili parallele alla faccia del blocco fino a quando il tessuto non è visibile. Questo è meglio visto dalla luce di pesca attraverso la faccia del blocco, il campione di tessuto sarà meno riflettente e granulare rispetto a quelle porzioni della resina che sono prive di tessuto. Consultare la fotografia scattata di campioni di tessuto prima dell'introduzione della resina satura nera fumo per un'idea di come e dove si trova il tessuto.
  3. Mettere da parte un portaocca campione per il taglio. Questo portaoci non viene mai inserito nella camera SEM e può quindi essere maneggiato senza guanti, questo sarà indicato come il portaocca perno di rifilatura. Qualsiasi porta campioni destinato ad essere collocato nella camera di imaging non deve mai essere toccato senza guanti. In questo modo si evita di introdurre grasso e olio nella camera del microscopio.
  4. Posizionare un perno del campione di alluminio nel portaocca di rifilatura e stringere leggermente la vite impostata con la faccia (superficie piana) del perno tenuto 3-4 mm sopra il portaocito.
  5. Fai diversi graffi profondi e incrociati nella faccia del perno per fornire una superficie più ampia per la colla utilizzata per tenere il campione in posizione. Se si utilizza un perno in alluminio, per questo passaggio è consigliato un piccolo cacciavite a testa piatta in acciaio (Figura 2B).
  6. Posizionare il mandrino contenente il campione di tessuto sotto la lampada termica fino a quando la resina diventa morbida e malleabile, quindi posizionarlo nel contenitore del mandrino sotto lo stereomicroscopio.
  7. Utilizzo di una lama di rasoio a doppio taglio per tagliare via la resina in eccesso dalla porzione del blocco di resina contenente il campione di tessuto. In definitiva la dimensione del blocco tissutale attaccato al perno sarà di circa 3 mm di diametro e 2-3 mm di altezza.
    1. Spingere con cura il rasoio direttamente nel blocco di resina di circa 1-2 mm, quindi spingere con attenzione il rasoio orizzontalmente nel blocco di resina a una profondità pari al taglio precedente. Fallo lentamente e con grande cura, in quanto è possibile danneggiare o tagliare la porzione del blocco contenente il campione di tessuto. Man mano che i due tagli si incontrano, la resina in eccesso si separerà dal blocco. Continuare a rimuovere la resina fino a quando rimane solo un'area rialzata di 3 mm x 3 mm.
  8. Dopo questo taglio iniziale, posizionare il blocco (ancora nel mandrino) sotto la lampada termica per diversi minuti.
  9. Una volta che la resina diventa morbida e malleabile, riposizionare il blocco sotto lo stereomicroscopio. Utilizzando una nuova lama a doppio bordo, tagliare la parte superiore del blocco di resina, circa 1 mm sotto la porzione rifilata, con un unico taglio liscio. Una superficie piana è preferibile in quanto verrà incollata al perno del campione. Fare attenzione a non permettere che il campione si perdi, poiché questo passaggio richiede una certa forza che può essere trasferito nella parte rimossa del blocco e farlo volare via. Mettere da parte il campione tagliato e tagliato.
  10. Posizionare il portaocito perno di rifilatura contenente il perno di alluminio tagliato nel contenitore stereomicroscopio. Applicare un sottile strato di colla cianoacrilato sulla faccia del perno in modo che copra completamente il perno senza formare un menisco visibile. Raccogliere il pezzo tagliato del blocco di tessuto con pin e posizionarlo sulla faccia del perno. Centrare il campione di tessuto sul perno del campione. Spingilo verso il basso e tienilo premuto per diversi secondi. Lasciare impostare la colla per diversi minuti.
  11. Quando la colla è completamente asciutta, riposizionare il portaocca perno di rifilatura sotto lo stereomicroscopio. Utilizzando un file fine, filettare la resina in eccesso in modo che nessuna resina sia sporgente sul perno. La forma della resina dovrebbe assomigliare alla testa circolare del perno.
  12. Individuare il tessuto sulla parte sollevata del blocco di resina, l'illuminazione obliqua è utile per questo. Utilizzando un rasoio a doppio bordo, la porzione sollevata della resina contenente il campione di tessuto deve essere tagliata in un'area non superiore a 1 mm2. Se possibile, la faccia del blocco può essere tagliata ancora più piccola, questo ridurrà lo stress sul coltello a diamante e migliorerà la sua longevità.
    1. Rimuovere quanta più resina in eccesso possibile, lasciando il blocco leggermente più lungo in una dimensione. Questo viene fatto lentamente e con cura, in quanto è possibile che la resina contenente il campione di tessuto si rompa se viene applicata troppa forza. Mentre si consiglia un rasoio, è possibile utilizzare un file di metallo fine per questo passaggio.
  13. Con un angolo di file metallico fine la resina in eccesso, nell'area esterna alla porzione sollevata contenente il campione di tessuto, verso il bordo del perno (Figura 2C).
  14. Rimuovere le particelle di resina e la polvere dal campione preparato prima di applicare vernice argentata seguita dallo sputtering d'oro. Mescolare l'argento con acetone in modo che sia un liquido facilmente spalmabile, simile allo smalto per unghie (ma non così sottile da gocciolare dall'applicatore) e applicare un rivestimento sottile sull'intera superficie del blocco del campione. L'acetone evapora rapidamente, quindi potrebbe essere necessario aggiungere acetone aggiuntivo man mano che la vernice argentata inizia ad addensarsi.
    1. Lasciare asciugare la vernice argentata durante la notte prima di caricarsi al microscopio.
      NOTA: Questo strato d'argento deve essere sottile per evitare di espandere la faccia del blocco oltre 1 mm x 1 mm e, mentre la vernice argentata non ha mai danneggiato il coltello a diamante, si consigliano ancora facce di blocco più piccole per preservare la longevità del coltello diamanta. L'acetone miscelato con l'argento deve evaporare completamente prima dello sputtering dell'oro o del caricamento del campione al microscopio per evitare di introdurre vapore acetone nella camera di imaging.
    2. Dopo l'applicazione della vernice argentata, applicare un sottile strato di oro sul blocco campione. Utilizzando un dispositivo standard di sputtering sottovuoto dotato di un bersaglio standard in lamina d'oro, una pressione della camera di 200 milliTorr (gas Argon) e 40 milliambi in funzione per 2 minuti si tradurrà in un rivestimento in oro spesso 20 nm.
  15. Dopo il rivestimento, posizionare il blocco montato e tagliato in un tubo con l'etichetta di esperimento appropriata attaccata. Creare tubi personalizzati utilizzando pipette di trasferimento usa e getta.
    1. Tagliare la pipetta di trasferimento appena sotto la lampadina, lasciando una breve porzione del tubo di pipetta di trasferimento attaccato sotto l'estremità bulbosa. Accorciare la porzione tubolare che è stata tagliata e tagliare la punta della pipetta abbastanza indietro in modo che il perno del campione di alluminio possa essere spinto in modo snuggly all'interno di esso.
    2. Posizionare l'estremità contenente il perno del campione di alluminio all'interno dell'estremità bulbosa della pipetta di trasferimento modificata.
  16. Prima di caricare un blocco di tessuto preparato, tagliare con cura la vernice argentata in eccesso dalla superficie della faccia del blocco.

3. Impostazioni SEM per l'imaging della faccia del blocco

NOTA: Le impostazioni di imaging che seguono sono state prodotte sul dispositivo utilizzato dagli autori, che è elencato nella tabella dei materiali fornita. Mentre questo dispositivo è in grado di imaging a pressione variabile, i migliori risultati sono stati catturati sotto alto vuoto.

  1. Tempo di dimora: Utilizzare 12 μs/px durante la sessatura seriale. Quando è stata identificata una regione di interesse, un'immagine a risoluzione più elevata può essere acquisita a 32 μs/px.
  2. Impostazioni vuoto: Utilizzare una pressione del cannone di 9e-008 Pa, una pressione della colonna di 1,1e-004 Pa e una pressione della camera di 9,5e-002 Pa.
  3. Tempo di acquisizione: Con le impostazioni di cui sopra, acquisisci uno stack di immagini px 2048x2048 a una velocità di 50 secondi per immagine. Le immagini a risoluzione più elevata delle regioni di interesse possono essere acquisite a 4096x4096 px a poco meno di 9 minuti per immagine.
  4. Spessore sezione: Utilizzare 100-200 nm. Meno è possibile, ma può richiedere una tensione del fascio inferiore, intensità o tempo di dimora.
  5. Alta tensione (HV): Utilizzare 7-12 kV. Mentre l'aumento della tensione riduce le dimensioni dello spot e aumenta la risoluzione, introduce più possibilità di danni al fascio. KV più alto aumenta la penetrazione del fascio che si traduce in perdita di dettagli. Tuttavia, l'abbassamento del kV degrada il rapporto segnale/rumore (Figura 3)14.
  6. Intensità fascio (BI): Il dispositivo SBF-SEM dell'autore offre una scala di intensità del fascio che va da 1 a 20. Su questa scala, i valori di 5-7 forniscono immagini di qualità senza carica eccessiva e danni al fascio. Maggiore è la BI maggiore è la risoluzione, tuttavia, ci sono maggiori possibilità di caricare e danneggiare il fascio14.
  7. Dimensioni spot e ingrandimento immagine: Determinare la dimensione del punto in base all'intensità del fascio e al livello di tensione. Idealmente, la dimensione del punto non dovrebbe essere maggiore della dimensione dei pixel utilizzata. La dimensione dei pixel è determinata dividendo il campo visivo (FOV) per il numero di pixel. Ad esempio, un FOV da 25 μm con una dimensione dell'immagine di 2048x2048 px darebbe 12,2 nm per pixel. Pertanto la dimensione dello spot non deve essere superiore a 12,2 nm. La figura 4 mostra come sono correlate HV, BI e dimensioni spot.
  8. Distanza di lavoro (WD) - Con l'imaging della faccia a blocchi la distanza di lavoro non è regolabile. È semplicemente un fattore di attenzione. Sarà quasi identico per tutti i blocchi di immagine. Sebbene la distanza di lavoro non sia regolabile, svolge un ruolo fondamentale nella risoluzione dell'immagine acquisita. Con la diminuzione della distanza di lavoro, aumenta il limite di risoluzione per le immagini acquisite. In alcuni casi può essere possibile ridurre la distanza di lavoro apportando modifiche all'interno della camera di imaging, tuttavia queste modifiche devono essere apportate a discrezione dell'utente. Al fine di ridurre la distanza di lavoro e aumentare la risoluzione dell'immagine, abbiamo allentato le viti del microtomo di montaggio della porta e riposizionato il microtomo in modo che riposava ~ 2 mm più vicino al rilevatore di travi dopo aver ritrasposizione le viti.
  9. Risoluzione - Utilizzando le impostazioni di cui sopra, è possibile una risoluzione x & y fino a 3,8 nm. È importante notare che la risoluzione è limitata dalle dimensioni del punto del fascio e la risoluzione in pixel delle acquisizioni di immagini (ad esempio, un campo visivo di 20 μm catturato in un'immagine pixel 2048x2048 ha una risoluzione in pixel di 9,8 nm, anche se è stata utilizzata una dimensione del punto di 3,8 nm). La risoluzione dell'immagine nel piano Z dipende dallo spessore della sezione, scopriamo che 100-200 nm funziona bene con questo protocollo.

Risultati

Cornea di topo
Questo protocollo è stato ampiamente applicato alla cornea di topo. Utilizzando l'imaging SBF-SEM, è stata dimostrata la soddisfazione di una rete di fasci di microfibrille senza elastina (EF PCB) all'interno della cornea di topo adulta. In precedenza si credeva che questa rete fosse presente solo durante lo sviluppo embrionale e postnatale precoce. SBF-SEM ha rivelato una vasta rete EFMB in tutta la cornea, con fibre individuali che hanno un diametro di 100-200 nm se misurate in sezi...

Discussione

Lo scopo di questo documento sui metodi è quello di evidenziare la metodologia di preparazione e imaging dei tessuti che ha permesso al nostro laboratorio di catturare in modo affidabile immagini di microscopia elettronica seriale ad alta risoluzione e di evidenziare i passaggi critici che portano a questo risultato e potenziali insidie che possono verificarsi durante la conduzione dell'imaging SBF-SEM. Il successo nell'utilizzo di questo protocollo richiede una corretta fissazione dei tessuti, l'impregnazione di metall...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Vorremmo ringraziare il Dr. Sam Hanlon, Evelyn Brown e Margaret Gondo per la loro eccellente assistenza tecnica. Questa ricerca è stata sostenuta in parte dai National Institutes of Health (NIH) R01 EY-018239 e P30 EY007551 (National Eye Institute), in parte dalla Lion's Foundation for Sight, e in parte da NIH 1R15 HD084262-01 (National Institute of Child Health & Human Development).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
1/16 x 3/8 Aluminum RivetsIndustrial Rivet & Fastener Co.6N37RFLAP/1100Used as specimen pins.
2.5mm Flathead ScrewdriverWiha Quality Tools27225
AcetoneElectron Microscopy SciencesRT 10000Used to dilute silver paint.
Aspartic AcidSigma-AldrichA8949
Calcium ChlorideFisherScientificC79-500
Conductive Silver PaintTed Pella16062
Denton Desk-II Vacuum Sputtering Device equipped with standard gold foil targetDenton VacuumN/AThis is the gold-sputtering device used by the authors, alternates are acceptable.
Double-edged RazorsFisher Scientific50-949-411
Embed 812Electron Microscopy Sciences14120
Gatan 3View2 mounted in a Tescan Mira3 Field emission SEMGatan & TescanN/AThis is the SBF-SEM device used by the authors, alternates are acceptable.
Glass Shell Vials, 0.5 DRAM (1.8 ml)Electron Microscopy Sciences72630-05
GluteraldehydeElectron Microscopy Sciences16320
Gorilla Super Glue - Impact ToughNANARefered to as cyanoacrylate glue in text.
Ketjen BlackHM RoyalEC-600JDRefered to as carbon black in text.
KOHFisherScientific18-605-593
Lead NitrateFisher ScientificL62-100
MicrowavePelcoBioWave ProThis is the microwave used by the authors, alternates are acceptable.
Osmium TetroxideSigma-Aldrich201030
Potassium FerrocyanideSigma-AldrichP9387
Silicone Embedding MoldTed Pella10504
Sodium Cacodylate TrihydrateElectron Microscopy Sciences12300
Samco Transfer PipetteThermoFisher Scientific202Used to make specimen pin storage tubes.
Swiss Pattern Needle FilesElectron Microscopy Sciences62115
ThiocarbohydrazideSigma-Aldrich223220
Uranyl AcetatePolysciences, Inc.21447-25
Reconstruction Software
Amira SoftwareThermo ScientificN/AUsed to create the reconstructions found in figures 5-7 and 9.
Fiji (Fiji is Just ImageJ)ImageJ.netN/ATrakEM2 can be added to Fiji to asist in manual segmentation.
Microscopy Image Browser (MIB)University of Helsinki, Institute of BiotechnologyN/A
Reconstuct SoftwareNeural Systems LabN/A
SuRVoS WorkbenchDiamond Light Source & The University of NottinghamN/A
SyGlassIstoVisio, Inc.N/AAllows for reconstruction in virtual reality and histogram-based reconstruction methods.

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