JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה שגרתית לשימוש במיקרוסקופ אלקטרונים סריקת פנים טורי (SBF-SEM), טכניקת הדמיה תלת-ממדית רבת עוצמה. יישום מוצלח של צירי SBF-SEM על קיבוע נאות וטכניקות כתמי רקמות, כמו גם שיקול זהיר של הגדרות הדמיה. פרוטוקול זה מכיל שיקולים מעשיים לממותו של תהליך זה.

Abstract

מיקרוסקופ אלקטרונים סריקת פרצוף בלוק סדרתי (SBF-SEM) מאפשר איסוף של מאות עד אלפי תמונות אולטרה-מבניות הרשומות באופן סדרתי, ומציע תצוגה תלת מימדית חסרת תקדים של מיקרואנטומיה של רקמות. בעוד SBF-SEM ראתה עלייה אקספוננציאלית בשימוש בשנים האחרונות, היבטים טכניים כגון הכנת רקמות נכונה ופרמטרים הדמיה הם בעלי חשיבות עליונה להצלחת מודאליות הדמיה זו. מערכת הדמיה זו נהנית מהאופי האוטומטי של המכשיר, ומאפשרת להשאיר את המיקרוסקופ ללא השגחה במהלך תהליך ההדמיה, עם איסוף אוטומטי של מאות תמונות אפשריות ביום אחד. עם זאת, ללא הכנת רקמות מתאימה אולטרה מובנה הסלולר ניתן לשנות באופן כזה מסקנות שגויות או מטעות עשוי להסיק. בנוסף, תמונות נוצרות על ידי סריקת פני הבלוק של מדגם ביולוגי מוטבע שרף וזה לעתים קרובות מציג אתגרים ושיקולים שיש לטפל בהם. הצטברות אלקטרונים בתוך הבלוק במהלך ההדמיה, המכונה "טעינת רקמות", עלולה להוביל לאובדן ניגודיות ולחוסר יכולת להעריך את המבנה התאי. יתר על כן, בעוד הגדלת עוצמת קרן אלקטרונים / מתח או הפחתת מהירות סריקת קרן יכול להגביר את רזולוציית התמונה, זה יכול להיות גם תופעת לוואי מצערת של פגיעה בלוק שרף ועיוות התמונות הבאות בסדרת ההדמיה. כאן אנו מציגים פרוטוקול שגרתי להכנת דגימות רקמה ביולוגית המשמרת את המבנה התאי ומפחיתה את טעינת הרקמות. כמו כן, אנו מספקים שיקולי הדמיה לרכישה מהירה של תמונות סדרתיות באיכות גבוהה עם נזק מינימלי לגוש הרקמות.

Introduction

בלוק סדרתי פנים סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים (SBF-SEM) תואר לראשונה על ידי לייטון בשנת 1981 שבו הוא עיצב מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה בתוספת מיקרוטום מובנה אשר יכול לחתוך תמונה חלקים דקים של רקמה מוטבע שרף. למרבה הצער, מגבלות טכניות הגבילו את השימוש בו לדגימות מוליכות, שכן דגימות לא מוליכות כגון רקמה ביולוגית צברו רמות בלתי קבילות של טעינה (הצטברות אלקטרונים בתוך דגימת הרקמה)1. בעוד ציפוי הפנים בלוק בין חתכים עם פחמן התאדה מופחת טעינת רקמות, זה גדל מאוד זמן רכישת הדמיה ואחסון תמונה נשאר בעיה כמו טכנולוגיית המחשב באותו זמן לא היה מספיק כדי לנהל את גדלי הקבצים הגדולים שנוצרו על ידי המכשיר. מתודולוגיה זו נבחנה מחדש על ידי דנק והורסטמן בשנת 2004 באמצעות SBF-SEM המצויד בתא לחץ משתנה2. זה איפשר הכנסת אדי מים לתא ההדמיה אשר מפחית את הטעינה בתוך המדגם, מה שהופך את ההדמיה של דגימות לא מוליך קיימא אם כי עם אובדן רזולוציית תמונה. שיפורים נוספים בשיטות הכנת רקמות והדמיה מאפשרים כעת הדמיה באמצעות ואקום גבוה, והדמיה SBF-SEM כבר לא מסתמכת על אדי מים כדי לפזר טעינה3,4,5,6,7,8,9. בעוד SBF-SEM ראתה עלייה אקספוננציאלית בשימוש בשנים האחרונות, היבטים טכניים כגון הכנת רקמות נכונה ופרמטרים הדמיה הם בעלי חשיבות עליונה להצלחת מודאליות הדמיה זו.

SBF-SEM מאפשר איסוף אוטומטי של אלפי תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים הרשומות באופן סדרתי, עם רזולוציה מישורית קטנה כמו 3-5 ננומטר10,11. רקמה, ספוגה במתכות כבדות ומוטבעת שרף, ממוקמת בתוך מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה (SEM) המכיל ultramicrotome מצויד בסכין יהלום. משטח שטוח נחתך עם סכין היהלומים, הסכין נסוגה, ומשטח הבלוק נסרק בתבנית רסטר עם קרן אלקטרונים כדי ליצור תמונה של מבנה רקמות. לאחר מכן הבלוק מועלה סכום שצוין (למשל, 100 ננומטר) בציר z, המכונה "z-step", ומשטח חדש נחתך לפני שהתהליך חוזר על עצמו. בדרך זו בלוק תלת מימדי (3D) של תמונות מופק כמו הרקמה נחתכת. מערכת הדמיה זו נהנית עוד יותר מהאופי האוטומטי של המכשיר, ומאפשרת להשאיר את המיקרוסקופ ללא השגחה במהלך תהליך ההדמיה, עם איסוף אוטומטי של מאות תמונות אפשריות ביום אחד.

בעוד הדמיית SBF-SEM משתמשת בעיקר אלקטרונים backscattered כדי ליצור תמונה של פני הבלוק, אלקטרונים משניים נוצרים במהלך תהליך ההדמיה12. אלקטרונים משניים יכולים להצטבר, לצד אלקטרונים עם קורות אחוריות ופני קרן ראשונית שאינם נמלטים מהחסימה, ומייצרים "טעינת רקמות", מה שעלול להוביל לשדה אלקטרוסטטי מקומי בפני הבלוק. הצטברות אלקטרונים זו יכולה לעוות את התמונה או לגרום אלקטרונים להיפלט מהבלוק ולתרום לאות שנאסף על ידי גלאי backscatter, הפחתת יחס אות לרעש13. בעוד שניתן להפחית את רמת טעינת הרקמות על ידי הפחתת המתח או העוצמה של קרן האלקטרונים, או הפחתת זמן השתהות בקרן, התוצאה היא יחס אות לרעש מופחת14. כאשר נעשה שימוש בקרן אלקטרונים במתח נמוך יותר או בעוצמה נמוכה יותר, או כאשר הקרן רשאית להתעכב בתוך כל מרחב פיקסלים רק לפרק זמן קצר יותר, אלקטרונים פחות מכווצים לאחור נפלטים מהרקמה ונלכדים על ידי גלאי האלקטרונים וכתוצאה מכך אות חלש יותר. דנק והורסטמן התמודדו עם בעיה זו על ידי החדרת אדי מים לתא, ובכך להפחית את המטען בתא ועל פני הבלוק במחיר של רזולוציית תמונה. עם לחץ תא של 10-100 Pa, חלק מקרן האלקטרונים מפוזר תורם רעש תמונה ואובדן רזולוציה, אולם זה גם מייצר יונים בתא הדגימה אשר מנטרל תשלום בתוך בלוק מדגם2. שיטות עדכניות יותר לנטרול מטען בתוך בלוק המדגם להשתמש הזרקת גז מוקדי של חנקן על פני הבלוק במהלך ההדמיה, או החדרת מתח שלילי לשלב SBF-SEM כדי להקטין את האנרגיה מטען קרן בדיקה ולהגדיל את האות שנאסף6,7,15. במקום להציג הטיית במה, לחץ תאי או הזרקת חנקן מקומית כדי להפחית את הצטברות הטעינה על משטח הבלוק, ניתן גם להגדיל את המוליכות של השרף על ידי החדרת פחמן לתערובת השרף המאפשרת הגדרות הדמיה אגרסיביות יותר16. הפרוטוקול הכללי הבא הוא התאמה של פרוטוקול Deerinck et al. שפורסם בשנת 2010 ומכסה שינויים במתודולוגיות הכנת רקמות והדמיה שמצאנו שימושי למזעור טעינת רקמות תוך שמירה על רכישת תמונה ברזולוציה גבוהה3,17,18,19. בעוד שהפרוטוקול שהוזכר לעיל התמקד בעיבוד רקמות ובהסתמעת מתכות כבדות, פרוטוקול זה מספק תובנות לגבי זרימת העבודה של ההדמיה, ניתוח הנתונים והשחזור הטבועה במחקרי SBF-SEM. במעבדה שלנו, פרוטוקול זה הוחל בהצלחה ובאופן שכפול על מגוון רחב של רקמות כולל קרנית ומבני קטעים לפני השימוש, עפעפיים, בלוטות קריליות וקשות יותר, רשתית ועצב הראייה, לב, ריאות ודרכי הנשימה, כליות, כבד, שריר קרמאסטר וקליפת המוח /medulla, ובמגוון מינים כולל עכבר, חולדה, ארנב, שרקן, דגים, מונולאייר ותרביות תאים מרובדות, חזיר, פרימטים לא אנושיים, כמו גם בניאדם 20,21,22,23. בעוד שינויים קטנים עשויים להיות כדאי עבור רקמות ויישומים ספציפיים, פרוטוקול כללי זה הוכיח מאוד לשחזור ושימושי בהקשר של מתקן ההדמיה הליבה שלנו.

Protocol

כל בעלי החיים טופלו על פי ההנחיות המתוארות בהצהרת האגודה לחקר הראייה ורפואת העיניים לשימוש בבעלי חיים בראייה ומחקר עיניים ובהנחיות הטיפול בבעלי חיים של מכללת יוסטון לאופטומטריה. כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי המוסדות שבהם הם טופלו: עכבר, חולדה, ארנב, שרקן, נהלי פרימטים שאינם אנושיים אושרו על ידי אוניברסיטת יוסטון טיפול בבעלי חיים ושימוש הוועדה, נהלי זברה אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים באוניברסיטת DePauw, נהלי חזיר אושרו על ידי ביילור המכללה לרפואה טיפול בבעלי חיים ושימוש הוועדה. כל הרקמות האנושיות טופלו בהתאם להצהרת הלסינקי בנוגע למחקר על רקמות אנושיות והתקבל אישור ועדת בדיקה מוסדית מתאימה.

1. עיבוד רקמות

  1. הכינו פתרון מלאי של חיץ 0.4 M נתרן cacodylate על ידי ערבוב אבקת cacodylate נתרן ב ddH2O. ביסודיות לערבב חוצץ ו- pH להתאים את הפתרון 7.3. מאגר זה משמש כדי להפוך את התיקון (הרכב המתואר להלן בשלב 1.3), חוצץ כביסה, כמו גם אוסמיום ופתרונות אשלגן ferrocyanide.
    הערה: קיבעון זלוף הוא לעתים קרובות השיטה הטובה ביותר של קיבעון עבור מחקרי SBF-SEM, כמו קיבעון מתרחשת במהירות בכל הגוף. אם קיבוע זלוף אינו אפשרי בתכנון המחקר שלך, דלג לשלב 1.3.
  2. בצע קיבוע זלוף עם הלחץ הפיזיולוגי המתאים עבור מודל החיה24,25,26. זה נעשה באמצעות זלוף רציף transcardial עם מלוחים הפריני ואחריו קיבוע, כל ממוקם בגובה מסוים (למשל, 100 ס"מ) מעל האורגניזם (מתאים ללחץ הפיזיולוגי של מערכת כלי הדם במודל החיה), עם קיבוע זורם לתוך החדר השמאלי, ויציאה מתוך חתך שנעשה באטריום הימני. רקמה של עניין יהפוך חיוור כמו הדם מוחלף קיבוע, אם כל או חלק של הרקמה שלך לא בלאנש אז הרקמה לא יכול להיות קבוע כראוי ultrastructure לא יכול להישמר.
  3. השתמש סכין גילוח או אזמל חד לקצץ דגימות רקמה לתוך בלוקים לא יותר מ 2 מ"מ x 2 מ"מ x 2 מ"מ. אם דילגו על שלב 1.2, עשו זאת במהירות כדי שניתן יהיה לתקן את הרקמה במהירות האפשרית.
    1. לחלופין, לנתח רקמה תחת קיבוע ולהעביר לתיקון טרי כדי להשלים את תהליך הטבילה. ההרכב הסופי של הקיבעון מורכב 0.1 M נתרן cacodylate מאגר המכיל 2.5% glutaraldehyde ו 2 מ"מ סידן כלורי. אפשר קיבעון להמשיך לפחות 2 שעות בטמפרטורת החדר ומקסימום של לילה ב 4 מעלות צלזיוס. במידת האפשר, השתמשו בצלחת נדנדה/הטיה כדי להתסיס דגימות בעדינות בזמן התיקון.
    2. לחלופין, אם מיקרוגל מהפך זמין, לתקן רקמה בתיקון הנ"ל תחת ואקום ב 150 וואט במשך 4 מחזורים של 1 דקה על, 1 דקה את. קיבוע מיקרוגל היא השיטה המועדפת עבור שלב 1.3 כפי שהוא מתקן במהירות רקמה ושומר על רקמות ultrastructure27.
      הערה: אין לאפשר לרקמות להתייבש במהלך פרוטוקול זה, יש להקפיד להעביר רקמות במהירות מתמיסה אחת לאחרת.
  4. לשטוף רקמה קבועה 5x במשך 3 דקות כל אחד (15 דקות בסך הכל) בטמפרטורת החדר ב 0.1 M נתרן cacodylate מאגר המכיל 2 מ"מ סידן כלורי.
  5. הפוך את פתרון osmium ferrocyanide הבא טרי, רצוי במהלך שלבי הכביסה הקודמים. שלבו תמיסת אוסמיום טטרוקסידים 4% (מוכנה ב-ddH2O) עם נפח שווה של 3% אשלגן פרוציאניד ב-0.2 מ' קמודילאט עם 4 מ"מ סידן כלוריד. לאחר שלב הכביסה הקודם, מניחים את הרקמה בתמיסה זו במשך שעה על קרח בחושך, ובמכסה המנוע האדים.
    הערה: אוסמיום טטרוסיד הוא חומר גבישי צהוב שמגיע באמפולה. כדי ליצור את פתרון אוסמיום טטרוקסיד, לפצח לפתוח את האמפולה, להוסיף ddH2O, sonicate במשך 3-4 שעות בחושך עד הגבישים מומסים לחלוטין. פתרון Osmium tetroxide הוא פתרון צהוב ברור, אם הפתרון הוא שחור אוסמיום הופחת ואין עוד להשתמש בו.
  6. בעוד הרקמה היא דגירה בתמיסת אוסמיום ferrocyanide, להתחיל להכין את פתרון thiocarbohydrazide (TCH). הכן פתרון זה טרי ויש לו זמין בקלות בסוף 1 שעה osmium ferrocyanide תקופת קיבוע. ערבבו 0.1 גרם של תיוקרבוהידראזיד עם 10 מ"ל של ddH2O והניחו פתרון זה בתנור של 60 מעלות צלזיוס למשך שעה. כדי להבטיח שהפתרון מומס, מערבבים בעדינות כל 10 דקות. לפני השימוש, לסנן פתרון זה באמצעות מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר.
  7. לפני הדגירה ב- TCH, לשטוף את הרקמה עם טמפרטורת החדר ddH2O 5x במשך 3 דקות כל אחד (15 דקות בסך הכל).
  8. הנח את הרקמה בתמיסת TCH המסוננת למשך 20 דקות בסך הכל בטמפרטורת החדר (איור 1A-C).
  9. לאחר הדגירה ב- TCH, לשטוף את הרקמה 5x במשך 3 דקות כל אחד (15 דקות בסך הכל) בטמפרטורת החדר ddH2O.
  10. מניחים רקמה ב- ddH2O המכילה 2% אוסמיום טטרוקסיד (לא אוסמיום מופחת עם אשלגן ferrocyanide) במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. זה צריך להיעשות במכסה המנוע אדים בחושך כמו אוסמיום ניתן להפחית על ידי אור (למשל, תחת רדיד אלומיניום) (איור 1D-F).
  11. בעקבות דגירה osmium tetroxide, לשטוף רקמה 5x במשך 3 דקות כל (15 דקות בסך הכל) בטמפרטורת החדר ddH2O.
  12. מניחים את הרקמה ב 1% אצטט אורניל מימית (אבקת אצטט אורניל מעורבב ddH2O) לילה במקרר ב 4 מעלות צלזיוס.
  13. רגע לפני הסרת הרקמה מהמקרר, הכינו את תמיסת אספרטט העופרת הטרייה של וולטון. התחל על ידי המסת 0.066 גרם של חנקת עופרת ב 10 מ"ל של 0.03 M פתרון חומצה אספרטית (0.04 גרם חומצה אספרטית ב 10 מ"ל של מים מזוקקים) ולהתאים pH ל 5.5 עם 1 N KOH (0.5611 גרם ב 10 מ"ל של מים מזוקקים).
    התראה: משקע יכול להיווצר בעת התאמת ה- pH. זה לא מקובל.
    1. באמצעות מוט ערבוב, מוסיפים לאט את 1 N KOH dropwise תוך ניטור pH. מחממים מראש את תמיסת אספרטט עופרת ברורה סיים בתנור 60 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. אם נוצר משקעים לא ניתן להשתמש בפתרון ויש להכין פתרון אחר.
  14. הסר את הרקמה מהמקרר ולשטוף 5x במשך 3 דקות כל (15 דקות בסך הכל) בטמפרטורת החדר ddH2O.
  15. לאחר הכביסה, מניחים את הרקמה בתמיסת אספרטט עופרת מחוממת של וולטון במשך 30 דקות תוך שמירה על הטמפרטורה ב 60 מעלות צלזיוס.
  16. לאחר הדגירה אספרטט להוביל של וולטון, לשטוף את הרקמה 5x במשך 3 דקות כל (15 דקות בסך הכל) בטמפרטורת החדר ddH2O (איור 1G-I).
  17. לייבש את הרקמה באמצעות סדרת אצטון קר כקרח (30%, 50%, 70%, 95%, 95%, 100%, 100%, ו 100% אצטון (ב ddH2O היכן שרלוונטי) המאפשר 10 דקות עבור כל שלב בסדרה.
  18. לאחר סדרת התייבשות קר כקרח, מניחים רקמה בטמפרטורת החדר אצטון במשך 10 דקות.
    1. במהלך תקופה זו, לנסח להטביע 812 ACM שף. השתמש במתכון "תערובת קשה" כפי שהוא עמיד יותר לנזק קרן. מערבבים את שרף ביסודיות, ומניחים את הרקמה לתוך Embed 812:acetone (1:3 לערבב) במשך 4 שעות, ואחריו Embed 812:acetone (1:1 לערבב) במשך 8 שעות או לילה, ולבסוף להטביע 812:acetone (3:1 לערבב) לילה. בצעו את שלבי חדירת השחלות האלה בטמפרטורת החדר.
  19. למחרת, למקם את הרקמה ב 100% Embed 812 במשך 4-8 שעות, אז טרי 100% Embed 812 לילה, ולבסוף לתוך טרי 100% Embed 812 במשך 4 שעות. בצעו את שלבי חדירת השחלות האלה בטמפרטורת החדר.
    1. רגע לפני ההטבעה, מניחים כמות קטנה של שרף לתוך מיכל ערבוב ולאט לאט לערבב (מקל עץ יכול לשמש ערבוב) באבקה שחורה פחמן עד שרף רווי עם האבקה אבל הוא עדיין נוזל ולא הופך מגורען. זה צריך להידמות דיו עבה ולהיות מסוגל לאט לטפטף ממקל העץ ללא גושים גלויים.
  20. כוון את דגימות הרקמה בתבנית גומי סיליקון וצלם תמונה כך שכיוון הדגימה בתוך בלוק הרשף יירשם וניתן יהיה להפנות אליו. מכסים את הדגימות שרף רווי שחור פחמן בקצה עובש סיליקון ומניחים את התבנית בתנור במשך ~ 1 שעה ב 65 מעלות צלזיוס.
    1. מניחים את התבנית בשיפוע כדי להכיל את שף בקצה התבנית שבו הוא מכסה את דגימת הרקמה. מקם תווית עם מזהה דגימת ניסוי/רקמה בתבנית בקצה הנגדי של ה-resin (איור 2A).
  21. מוציאים את תבנית הסיליקון מהתנור וממלאים את שארית התבנית בשרף שקוף (ללא פחמן שחור) ומוודאים שהתווית נשארת גלויה. לרפא את שרף חדורים פחמן שחור מספיק כדי לא בקלות לערבב עם שרף ברור.
    1. הכן באר נוספת בתוך התבנית שאינה מכילה רקמה. החל מהבאר הנוספת, מלאו את שארית התבנית עם שף שקוף.
    2. אם שורף חדורים שחור פחמן מתחיל לדמם לתוך שף ברור, מניחים את עובש סיליקון בחזרה לתוך התנור לזמן נוסף (למשל, 15 דקות).
    3. לאחר כל דגימות הרקמה כבר עקף עם שף ברור, מניחים את עובש הסיליקון בחזרה לתוך התנור (שטוח, ללא שיפוע) ב 65 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות כדי להשלים את תהליך הריפוי.

2. חסום הכנה

הערה: השיטה תהיה תלויה באופן הכיוון של הדגימה בבלוק ובאופן שבו יש לבצע את החיתוך. עם זאת, אוריינטציה הרקמה הנפוצה ביותר מוצאת את הרקמה מרוכזת בקצה של בלוק שף, בניצב לקצה הארוך של בלוק שף.

  1. ברוב המקרים, הראשון לקצץ את קצה הבלוק כדי לאתר את הרקמה על ידי הצבת בלוק הדגימה בצ'אק microtome עם קצה מחודד תקוע כ 5-6 מ"מ מתוך הצ'אק. לנעול אותו במקום עם בורג להגדיר ומניחים אותו תחת מנורת חום.
  2. לאחר מספר דקות הבלוק יהיה חמרן וקל לקצץ. הנח את הצ'אק במחזיק הסטריאומיקרוסקופ והשתמש בסכין גילוח דו-קצה חדש כדי ליצור חלקים דקים במקביל לפני הבלוק עד שהרקמה נראית לעין. זה נראה בצורה הטובה ביותר על ידי angling אור על פני הבלוק, מדגם הרקמה יהיה פחות רפלקטיבי פרטני בהשוואה לאותם חלקים של שרף כי הם נטולי רקמה. התייעץ עם התמונה שצולמה של דגימות רקמה לפני כניסתה של שרף רווי שחור פחמן לרעיון של איך ואיפה הרקמה ממוקמת.
  3. הניחו מחזיק סיכה אחד בצד למטרות זמירה. מחזיק סיכה זה לעולם לא ממוקם בתא SEM ולכן ניתן לטפל ללא כפפות, זה ייקרא מחזיק סיכה גיזום. כל מחזיק דגימה שנועד להיות ממוקם בתא ההדמיה לא צריך להיות נגע ללא כפפות. זה מונע החדרת שומן ושמן לתוך תא מיקרוסקופ.
  4. מניחים סיכת דגימת אלומיניום במחזיק סיכת החיתוך ומהדקים מעט את הבורג עם הפנים (משטח שטוח) של הסיכה המוחזקת 3-4 מ"מ מעל מחזיק הסיכה.
  5. הפוך כמה עמוק, שריטות חוצה מול הסיכה כדי לספק שטח פנים גדול יותר עבור הדבק המשמש להחזיק את הדגימה במקום. אם נעשה שימוש בפינת אלומיניום, מומלץ מברג פלדה שטוח קטן לשלב זה (איור 2B).
  6. מניחים את הצ'אק המכיל את דגימת הרקמה בחזרה מתחת למנורה החום עד שרף הופך רך חמרן, ולאחר מכן למקם אותו לתוך כלי קיבול צ'אק מתחת סטריאומיקרוסקופ.
  7. שימוש בסכין גילוח בעל קצוות כפולים כדי לחתוך עודף שרסן מחלק בלוק השלם המכיל את דגימת הרקמה. בסופו של דבר גודל בלוק הרקמה המחובר לסיכה יהיה בקוטר של כ -3 מ"מ וגובהו 2-3 מ"מ.
    1. בזהירות לדחוף את סכין הגילוח ישר לתוך בלוק שרף בערך 1-2 מ"מ, ולאחר מכן בזהירות לדחוף את סכין הגילוח אופקית לתוך בלוק שרף בעומק שווה לחתוך הקודם. לעשות את זה לאט ובזהירות רבה, כפי שניתן נזק או לחתוך את החלק של הבלוק המכיל את דגימת הרקמה. כששני החתכים ייפגשו, עודפי החלף ייפרדו מהבלוק. המשך להסיר את השרף עד שנשאר רק שטח מוגבה של 3 מ"מ x 3 מ"מ.
  8. לאחר זמירה ראשונית זו, מניחים את הבלוק (עדיין בצ'אק) מתחת למנורת החום במשך מספר דקות.
  9. ברגע שהצבר הופך רך וחכם, הנח את הבלוק בחזרה מתחת לסטריאומיקרוסקופ. בעזרת סכין גילוח דו-קצה חדש, חותכים את החלק העליון של בלוק השלכה, בערך 1 מ"מ מתחת לחלק הגזום, עם חתך חלק אחד. משטח שטוח עדיף כמו זה יהיה מודבק סיכת הדגימה. היזהר לא לאפשר את המדגם ללכת לאיבוד, כמו שלב זה דורש כוח כלשהו אשר יכול להעביר לחלק הוסר של הבלוק ולגרום לו לעוף משם. מניחים את הדגימה החתוכה והחצוצה בצד.
  10. הנח את מחזיק סיכת החיתוך המכיל את סיכת האלומיניום החתוכה בכלי הקיבול סטריאומיקרוסקופ. החל שכבה דקה של דבק ציאנואקרילאט על פני הסיכה כך שהוא מכסה לחלוטין את הסיכה מבלי ליצור מניסקוס גלוי. להרים את החתיכה הגזוזה של בלוק הרקמה עם מלקחיים ומניחים על פני הסיכה. מרכז את דגימת הרקמה על סיכת הדגימה. לדחוף אותו למטה ולהחזיק אותו במשך כמה שניות. אפשר להגדיר את הדבק למשך מספר דקות.
  11. כאשר הדבק יבש לחלוטין, הנח את מחזיק סיכת החיתוך בחזרה מתחת לסטריאומיקרוסקופ. באמצעות קובץ בסדר, קובץ משם עודף שף כך שאין שף הוא overhanging הסיכה. צורת אשר אמורה להידמות לראש הסיכה העגול.
  12. אתר את הרקמה בחלק המוגבה של בלוק שף שלך, תאורה אלכסונית שימושית לכך. באמצעות סכין גילוח פיפיות, יש לקצץ את החלק המוגבה של השפם המכיל את דגימת הרקמה לאזור שאינו עולה על 1 מ"מ2. במידת האפשר, ניתן לקצץ את פני הבלוק אפילו קטן יותר, זה יפחית את הלחץ על סכין היהלום ולשפר את תוחלת החיים שלה.
    1. הסר כמו עודפי שף ככל האפשר, משאיר את הבלוק קצת יותר בממד אחד. זה נעשה לאט ובזהירות, כפי שהוא אפשרי עבור שף המכיל את דגימת הרקמה להתנתק אם יותר מדי כוח מוחל. בעוד סכין גילוח מומלץ, קובץ מתכת בסדר יכול לשמש לשלב זה.
  13. עם זווית קובץ מתכת עדינה את עודף החלף, באזור שמחוץ לחלק המוגבה המכיל את דגימת הרקמה, כלפי מטה לכיוון קצה הסיכה (איור 2C).
  14. הסר חלקיקי שף ואבק מהמדגם המוכן לפני החלת צבע כסף ואחריו sputtering זהב. מערבבים כסף עם אצטון כך שהוא נוזל הניתן להפצה בקלות, בדומה ללק ציפורניים (אך לא כל כך דק שהוא מטפטף מהמוליך) ומחילים מעיל דק על כל משטח הבלוק לדוגמה. אצטון מתאדה במהירות, ולכן ייתכן שיהיה צורך להוסיף אצטון נוסף כמו צבע כסף מתחיל להתעבות.
    1. אפשר לצבע הכסף להתייבש בן לילה לפני העמסה למיקרוסקופ.
      הערה: שכבת כסף זו חייבת להיות דקה כדי להימנע מהרחבת פני הבלוק מעבר ל- 1 מ"מ x 1 מ"מ, ובעוד שצבע הכסף מעולם לא פגע בסכין היהלום, עדיין מומלץ לשמור על תוחלת החיים של סכין היהלום. האצטון מעורבב עם הכסף חייב להתאדות לחלוטין לפני זהב sputtering או טעינת המדגם לתוך המיקרוסקופ, כדי למנוע החדרת אדי אצטון לתוך תא ההדמיה.
    2. לאחר יישום של צבע כסף, להחיל שכבה דקה של זהב על בלוק המדגם. באמצעות מכשיר sputtering ואקום סטנדרטי מצויד יעד רדיד זהב סטנדרטי, לחץ תא של 200 מיליטור (גז ארגון) ו 40 מיליאמפר פועל במשך 2 דקות יגרום ציפוי זהב 20 ננומטר עבה.
  15. לאחר הציפוי, מניחים את הבלוק רכוב וקצוץ בצינור עם תווית הניסוי המתאימה המצורפת. צור צינורות מותאמים אישית באמצעות פיפטות העברה חד פעמיות.
    1. חותכים את פיפטה העברה ממש מתחת הנורה, משאיר חלק קצר של צינור פיפטה העברה מחובר מתחת לקצה בולבוסי. לקצר את החלק הצינורי שנחתך משם, ולחתוך את קצה פיפטה בחזרה מספיק, כך סיכת דגימת אלומיניום ניתן לדחוף מתכרבל בתוכו.
    2. מניחים את הקצה המכיל את סיכת דגימת האלומיניום בתוך הקצה בולבוסי של פיפטה העברה שונה.
  16. לפני טעינת בלוק רקמה מוכן, בזהירות לקצץ צבע כסף עודף מפני השטח של פני הבלוק.

3. הגדרות SEM להדמיית פני הבלוק

הערה: הגדרות ההדמיה הבאות יוצרו במכשיר המשמש את המחברים, המופיע בטבלת החומרים שסופקה. בעוד מכשיר זה מסוגל הדמיית לחץ משתנה, התוצאות הטובות ביותר נלכדו תחת ואקום גבוה.

  1. זמן השתהות: השתמש 12 μs / px במהלך חתך טורי. כאשר אזור מעניין זוהה, ניתן לרכוש תמונה ברזולוציה גבוהה יותר ב- 32 μs/px.
  2. הגדרות ואקום: השתמש בלחץ אקדח של 9e-008 Pa, לחץ עמודה של 1.1e-004 Pa, ולחץ תא של 9.5e-002 Pa.
  3. זמן לכידה: עם ההגדרות לעיל, לכוד מחסנית תמונות px 2048x2048 בקצב של 50 שניות לתמונה. תמונות ברזולוציה גבוהה יותר של אזורי עניין ניתן ללכוד ב 4096x4096 px בפחות מ 9 דקות לתמונה.
  4. עובי מקטע: השתמש 100-200 ננומטר. פחות אפשרי, אך עשוי לדרוש מתח קרן נמוך יותר, עוצמה או זמן שההתעכבות.
  5. מתח גבוה (HV): השתמש 7-12 kV. בעוד הגדלת המתח מפחיתה את גודל הספוט ומגבירה את הרזולוציה, היא מציגה אפשרות נוספת לנזק לקרן. kV גבוה יותר מגביר את חדירת הקרן שתוצאתה אובדן פרטים. עם זאת, הורדת ה-kV פוגעת ביחס האות לרעש (איור 3)14.
  6. עוצמת קרן (BI): התקן SBF-SEM של המחבר מציע סולם עוצמת קרן הנע בין 1-20. בסולם זה, ערכים של 5-7 מעניקים תמונות איכותיות ללא טעינה מוגזמת ונזק לקרן. ככל שה-BI גבוה יותר ככל שהרזולוציה גדולה יותר, יש סיכוי גדול יותר לטעינה ולנזק לקרן14.
  7. גודל ספוט והגדלת תמונה: קבע את גודל הספוט לפי עוצמת הקרן ורמת המתח. באופן אידיאלי, גודל הספוט לא צריך להיות גדול יותר מגודל הפיקסלים שבו נעשה שימוש. גודל הפיקסל נקבע על-ידי חלוקת שדה הראייה (FOV) במספר הפיקסלים. לדוגמה, FOV של 25 מיקרומטר עם גודל תמונה של 2048x2048 px ייתן 12.2 ננומטר לפיקסל. לכן גודל הספוט צריך להיות לא יותר מ 12.2 ננומטר. איור 4 מראה כיצד HV, BI וגודל ספוט קשורים זה לזה.
  8. מרחק עבודה (WD) - עם הדמיית פני בלוק, מרחק העבודה אינו מתכוונן. זה פשוט גורם של מיקוד. זה יהיה כמעט זהה לכל הבלוקים בתמונה. בעוד מרחק העבודה אינו מתכוונן, הוא ממלא תפקיד קריטי ברזולוציה של התמונה שנלכדה. ככל שמרחק העבודה פוחת, מגבלת הרזולוציה על תמונות שנלכדו גדלה. במקרים מסוימים ניתן יהיה להקטין את מרחק העבודה על ידי ביצוע שינויים בתוך תא ההדמיה, אולם שינויים אלה חייבים להתבצע על פי שיקול דעתו של המשתמש. על מנת להקטין את מרחק העבודה ולהגדיל את רזולוציית התמונה, שחררנו את ברגי המיקרוטום להרכבה על הדלת ומיקמנו מחדש את המיקרוטום כך שהוא נח ~ 2 מ"מ קרוב יותר לגלאי הקרן לאחר שהורט מחדש את הברגים.
  9. רזולוציה - באמצעות ההגדרות לעיל, x & y רזולוציה גבוהה ככל 3.8 ננומטר אפשרי. חשוב לציין כי הרזולוציה מוגבלת על ידי גודל ספוט קרן, כמו גם את רזולוציית הפיקסל של לכידת התמונה (למשל, שדה 20 מיקרומטר של תצוגה שנתפסו בתמונה 2048x2048 פיקסל יש רזולוציה פיקסל של 9.8 ננומטר, גם אם נעשה שימוש בגודל ספוט 3.8 ננומטר). רזולוציית התמונה במישור z תלויה בעובי החתך, אנו מוצאים כי 100-200 ננומטר עובד היטב עם פרוטוקול זה.

תוצאות

עכבר קרנית
פרוטוקול זה הוחל בהרחבה על הקרנית של העכבר. באמצעות SBF-SEM הדמיה רשת של חבילות microfibril נטול אלסטין (EFMBs) הוצגו להיות נוכח בתוך הקרנית העכבר הבוגר. בעבר האמינו כי רשת זו הייתה נוכחת רק במהלך התפתחות עוברית ותחילת הלידה. SBF-SEM חשף רשת EFMB נרחבת ברחבי הקרנית, עם סיבים בודדים שנמצ...

Discussion

מטרת נייר שיטות זה היא להדגיש את הכנת הרקמות ואת מתודולוגיית ההדמיה שאיפשרה למעבדה שלנו ללכוד באופן אמין תמונות מיקרוסקופיות אלקטרונים סדרתיות ברזולוציה גבוהה, ולהצביע על צעדים קריטיים שמובילים לתוצאה זו, כמו גם מלכודות פוטנציאליות שעלולות להתרחש בעת ביצוע הדמיית SBF-SEM. הצלחה בשימוש בפר?...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

ברצוננו להודות לד"ר סם הנלון, אוולין בראון ומרגרט גונדו על הסיוע הטכני המצוין שלהם. מחקר זה נתמך בחלקו על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) R01 EY-018239 ו P30 EY007551 (המכון הלאומי לבריאות הילד), בין השאר על ידי קרן האריה למראה, ובחלקו על ידי NIH 1R15 HD084262-01 (המכון הלאומי לבריאות הילד והתפתחות האדם).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1/16 x 3/8 Aluminum RivetsIndustrial Rivet & Fastener Co.6N37RFLAP/1100Used as specimen pins.
2.5mm Flathead ScrewdriverWiha Quality Tools27225
AcetoneElectron Microscopy SciencesRT 10000Used to dilute silver paint.
Aspartic AcidSigma-AldrichA8949
Calcium ChlorideFisherScientificC79-500
Conductive Silver PaintTed Pella16062
Denton Desk-II Vacuum Sputtering Device equipped with standard gold foil targetDenton VacuumN/AThis is the gold-sputtering device used by the authors, alternates are acceptable.
Double-edged RazorsFisher Scientific50-949-411
Embed 812Electron Microscopy Sciences14120
Gatan 3View2 mounted in a Tescan Mira3 Field emission SEMGatan & TescanN/AThis is the SBF-SEM device used by the authors, alternates are acceptable.
Glass Shell Vials, 0.5 DRAM (1.8 ml)Electron Microscopy Sciences72630-05
GluteraldehydeElectron Microscopy Sciences16320
Gorilla Super Glue - Impact ToughNANARefered to as cyanoacrylate glue in text.
Ketjen BlackHM RoyalEC-600JDRefered to as carbon black in text.
KOHFisherScientific18-605-593
Lead NitrateFisher ScientificL62-100
MicrowavePelcoBioWave ProThis is the microwave used by the authors, alternates are acceptable.
Osmium TetroxideSigma-Aldrich201030
Potassium FerrocyanideSigma-AldrichP9387
Silicone Embedding MoldTed Pella10504
Sodium Cacodylate TrihydrateElectron Microscopy Sciences12300
Samco Transfer PipetteThermoFisher Scientific202Used to make specimen pin storage tubes.
Swiss Pattern Needle FilesElectron Microscopy Sciences62115
ThiocarbohydrazideSigma-Aldrich223220
Uranyl AcetatePolysciences, Inc.21447-25
Reconstruction Software
Amira SoftwareThermo ScientificN/AUsed to create the reconstructions found in figures 5-7 and 9.
Fiji (Fiji is Just ImageJ)ImageJ.netN/ATrakEM2 can be added to Fiji to asist in manual segmentation.
Microscopy Image Browser (MIB)University of Helsinki, Institute of BiotechnologyN/A
Reconstuct SoftwareNeural Systems LabN/A
SuRVoS WorkbenchDiamond Light Source & The University of NottinghamN/A
SyGlassIstoVisio, Inc.N/AAllows for reconstruction in virtual reality and histogram-based reconstruction methods.

References

  1. Leighton, S. B. SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM - a technical note. Scanning Electron Microscopy. , 73-76 (1981).
  2. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLOS Biology. 2 (11), 329 (2004).
  3. He, Q., Hsueh, M., Zhang, G., Joy, D. C., Leapman, R. D. Biological serial block face scanning electron microscopy at improved z-resolution based on Monte Carlo model. Scientific Reports. 8 (1), 12985 (2018).
  4. Zankel, A., Wagner, J., Poelt, P. Serial sectioning methods for 3D investigations in materials science. Micron. 62, 66-78 (2014).
  5. Titze, B., Genoud, C. Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure. Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).
  6. Ohta, K., et al. Beam deceleration for block-face scanning electron microscopy of embedded biological tissue. Micron. 43 (5), 612-620 (2012).
  7. Bouwer, J. C., et al. Deceleration of probe beam by stage bias potential improves resolution of serial block-face scanning electron microscopic images. Advanced Structural and Chemical Imaging. 2 (1), 11 (2017).
  8. Kizilyaprak, C., Longo, G., Daraspe, J., Humbel, B. M. Investigation of resins suitable for the preparation of biological sample for 3-D electron microscopy. Journal of Structural Biology. 189 (2), 135-146 (2015).
  9. Kittelmann, M., Hawes, C., Hughes, L. Serial block face scanning electron microscopy and the reconstruction of plant cell membrane systems. Journal of Microscopy. 263 (2), 200-211 (2016).
  10. Biazik, J., Vihinen, H., Anwar, T., Jokitalo, E., Eskelinen, E. L. The versatile electron microscope: an ultrastructural overview of autophagy. Methods. 75, 44-53 (2015).
  11. Peddie, C. J., Collinson, L. M. Exploring the third dimension: Volume electron microscopy comes of age. Micron. 61, 9-19 (2014).
  12. Piňos, J., Mikmeková, &. #. 3. 5. 2. ;., Frank, L. About the information depth of backscattered electron imaging. Journal of Microscopy. 266 (3), 335-342 (2017).
  13. Smith, D., Starborg, T. Serial block face scanning electron microscopy in cell biology: Applications and technology. Tissue Cell. 57, 111-122 (2019).
  14. Goggin, P., et al. Development of protocols for the first serial block-face scanning electron microscopy (SBF SEM) studies of bone tissue. Bone. 131, 115107 (2020).
  15. Deerinck, T. J., et al. High-performance serial block-face SEM of nonconductive biological samples enabled by focal gas injection-based charge compensation. Journal of Microscopy. 270 (2), 142-149 (2018).
  16. Nguyen, H. B., et al. Conductive resins improve charging and resolution of acquired images in electron microscopic volume imaging. Scientific Reports. 6, 23721 (2016).
  17. Deerinck, T. J., Bushong, E. A., Thor, A., Ellisman, M. H. NCMIR methods for 3D EM: a new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. National Center for Microscopy and Imaging Research. 6 (8), (2010).
  18. Deerinck, T. J., et al. Enhancing Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy to Enable High Resolution 3-D Nanohistology of Cells and Tissues. Microscopy and Microanalysis. 16, 1138-1139 (2010).
  19. Kubota, Y. New developments in electron microscopy for serial image acquisition of neuronal profiles. Microscopy (Oxf). 64 (1), 27-36 (2015).
  20. Courson, J. A., et al. Serial block-face scanning electron microscopy: A provocative technique to define 3-dimensional ultrastructure of microvascular thrombosis. Thrombosis Research. 196, 519-522 (2020).
  21. Courson, J. A., et al. Serial block-face scanning electron microscopy reveals neuronal-epithelial cell fusion in the mouse cornea. PLoS One. 14 (11), 0224434 (2019).
  22. Lafontant, P. J., et al. Cardiac Myocyte Diversity and a Fibroblast Network in the Junctional Region of the Zebrafish Heart Revealed by Transmission and Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy. PLoS One. 8 (8), 72388 (2013).
  23. Hanlon, S. D., Behzad, A. R., Sakai, L. Y., Burns, A. R. Corneal stroma microfibrils. Experimental Eye Research. 132, 198-207 (2015).
  24. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
  25. Davenport, A. T., Grant, K. A., Szeliga, K. T., Friedman, D. P., Daunais, J. B. Standardized method for the harvest of nonhuman primate tissue optimized for multiple modes of analyses. Cell Tissue Bank. 15 (1), 99-110 (2014).
  26. Schuster, A., et al. An isolated perfused pig heart model for the development, validation and translation of novel cardiovascular magnetic resonance techniques. Journal of Cardiovascular Magnetic Resonance. 12 (1), 53 (2010).
  27. Hanlon, S. D., Patel, N. B., Burns, A. R. Assessment of postnatal corneal development in the C57BL/6 mouse using spectral domain optical coherence tomography and microwave-assisted histology. Experimental Eye Research. 93 (4), 363-370 (2011).
  28. Longiéras, N., Sebban, M., Palmas, P., Rivaton, A., Gardette, J. L. Multiscale approach to investigate the radiochemical degradation of epoxy resins under high-energy electron-beam irradiation. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 44 (2), 865-887 (2006).
  29. Hashimoto, T., Thompson, G. E., Zhou, X., Withers, P. J. 3D imaging by serial block face scanning electron microscopy for materials science using ultramicrotomy. Ultramicroscopy. 163, 6-18 (2016).
  30. Rouquette, J., et al. Revealing the high-resolution three-dimensional network of chromatin and interchromatin space: A novel electron-microscopic approach to reconstructing nuclear architecture. Chromosome Research. 17 (6), 801 (2009).
  31. Briggman, K. L., Helmstaedter, M., Denk, W. Wiring specificity in the direction-selectivity circuit of the retina. Nature. 471 (7337), 183-188 (2011).
  32. Katoh, K. Microwave-Assisted Tissue Preparation for Rapid Fixation, Decalcification, Antigen Retrieval, Cryosectioning, and Immunostaining. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 2016, 7076910 (2016).
  33. Login, G. R., Dvorak, A. M. A review of rapid microwave fixation technology: its expanding niche in morphologic studies. Scanning. 15 (2), 58-66 (1993).
  34. Jamur, M. C., Faraco, C. D., Lunardi, L. O., Siraganian, R. P., Oliver, C. Microwave fixation improves antigenicity of glutaraldehyde-sensitive antigens while preserving ultrastructural detail. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 307-311 (1995).
  35. Leong, A. S., Sormunen, R. T. Microwave procedures for electron microscopy and resin-embedded sections. Micron. 29 (5), 397-409 (1998).
  36. Willingham, M. C., Rutherford, A. V. The use of osmium-thiocarbohydrazide-osmium (OTO) and ferrocyanide-reduced osmium methods to enhance membrane contrast and preservation in cultured cells. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 32 (4), 455-460 (1984).
  37. Khan, A. A., Riemersma, J. C., Booij, H. L. The reactions of osmium tetroxide with lipids and other compounds. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 9, 560-563 (1961).
  38. Belazi, D., Solé-Domènech, S., Johansson, B., Schalling, M., Sjövall, P. Chemical analysis of osmium tetroxide staining in adipose tissue using imaging ToF-SIMS. Histochemistry and Cell Biology. 132 (1), 105-115 (2009).
  39. Rivlin, P. K., Raymond, P. A. Use of osmium tetroxide-potassium ferricyanide in reconstructing cells from serial ultrathin sections. Journal of Neuroscience Methods. 20 (1), 23-33 (1987).
  40. Aguas, A. P. The use of osmium tetroxide-potassium ferrocyanide as an extracellular tracer in electron microscopy. Stain Technology. 57 (2), 69-73 (1982).
  41. Seligman, A. M., Wasserkrug, H. L., Hanker, J. S. A new staining method (OTO) for enhancing contrast of lipid--containing membranes and droplets in osmium tetroxide--fixed tissue with osmiophilic thiocarbohydrazide(TCH). Journal of Cell Biology. 30 (2), 424-432 (1966).
  42. Watson, M. L. Staining of tissue sections for electron microscopy with heavy metals. II. Application of solutions containing lead and barium. Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 4 (6), 727-730 (1958).
  43. Zhou, W., Apkarian, R., Wang, Z., Joy, D. Fundamentals of Scanning Electron Microscopy. Scanning Microscopy in Nanotechnology. , 1-40 (2006).
  44. Tapia, J. C., et al. High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy. Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).
  45. Buchacker, T., et al. Assessment of the Alveolar Capillary Network in the Postnatal Mouse Lung in 3D Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy. Frontiers in Physiology. 10, 1357 (2019).
  46. Keeling, E., et al. 3D-Reconstructed Retinal Pigment Epithelial Cells Provide Insights into the Anatomy of the Outer Retina. International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), (2020).
  47. Shang, P., et al. Chronic Alcohol Exposure Induces Aberrant Mitochondrial Morphology and Inhibits Respiratory Capacity in the Medial Prefrontal Cortex of Mice. Frontiers in Neuroscience. 14, 561173 (2020).
  48. Pfeifer, C. R., et al. Quantitative analysis of mouse pancreatic islet architecture by serial block-face SEM. Journal of Structural Biology. 189 (1), 44-52 (2015).
  49. Wilke, S. A., et al. Deconstructing complexity: serial block-face electron microscopic analysis of the hippocampal mossy fiber synapse. Journal of Neuroscience. 33 (2), 507-522 (2013).
  50. Cocks, E., Taggart, M., Rind, F. C., White, K. A guide to analysis and reconstruction of serial block face scanning electron microscopy data. Journal of Microscopy. 270 (2), 217-234 (2018).
  51. Borrett, S., Hughes, L. Reporting methods for processing and analysis of data from serial block face scanning electron microscopy. Journal of Microscopy. 263 (1), 3-9 (2016).
  52. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  53. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
  54. Fiala, J. C. Reconstruct: a free editor for serial section microscopy. Journal of Microscopy. 218, 52-61 (2005).
  55. Pidhorskyi, S., Morehead, M., Jones, Q., Spirou, G., Doretto, G. syGlass: interactive exploration of multidimensional images using virtual reality Head-mounted displays. arXiv . , (2018).
  56. Cardona, A., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLoS One. 7 (6), 38011 (2012).
  57. Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. Microscopy Image Browser: A Platform for Segmentation and Analysis of Multidimensional Datasets. PLOS Biology. 14 (1), 1002340 (2016).
  58. Luengo, I., et al. SuRVoS: Super-Region Volume Segmentation workbench. Journal of Structural Biology. 198 (1), 43-53 (2017).
  59. Anderson, H. R., Stitt, A. W., Gardiner, T. A., Archer, D. B. Estimation of the surface area and volume of the retinal capillary basement membrane using the stereologic method of vertical sections. Analytical & Quantitative Cytology & Histology. 16 (4), 253-260 (1994).
  60. Gibbons, C. H., Illigens, B. M., Wang, N., Freeman, R. Quantification of sweat gland innervation: a clinical-pathologic correlation. Neurology. 72 (17), 1479-1486 (2009).
  61. Knust, J., Ochs, M., Gundersen, H. J., Nyengaard, J. R. Stereological estimates of alveolar number and size and capillary length and surface area in mice lungs. Anat Rec. 292 (1), 113-122 (2009).
  62. Mahon, G. J., et al. Chloroquine causes lysosomal dysfunction in neural retina and RPE: implications for retinopathy. Current Eye Research. 28 (4), 277-284 (2004).
  63. Michel, R. P., Cruz-Orive, L. M. Application of the Cavalieri principle and vertical sections method to lung: estimation of volume and pleural surface area. Journal of Microscopy. 150, 117-136 (1988).
  64. Weibel, E. R. Stereological methods in cell biology: where are we--where are we going. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 29 (9), 1043-1052 (1981).
  65. Schmitz, C., Hof, P. R. Design-based stereology in neuroscience. Neuroscience. 130 (4), 813-831 (2005).
  66. Kristiansen, S. L., Nyengaard, J. R. Digital stereology in neuropathology. Apmis. 120 (4), 327-340 (2012).
  67. Howard, C. V., Reed, M. G. . Unbiased Stereology. 2nd edn. , (2005).
  68. Reith, A., Mayhew, T. M. . Stereology and Morphometry in Electron Microscopy: Problems and Solutions. , (1988).
  69. Mouton, P. R. . Principles and practices of unbiased stereology: an introduction for bioscientists. , (2002).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

169SBF SEM3D EM3D

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved