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Résumé

Ce protocole décrit une méthode de routine pour l’utilisation de la microscopie électronique à balayage de bloc-face série (SBF-SEM), une technique d’imagerie 3D puissante. L’application réussie de SBF-SEM s’articule sur la fixation appropriée et les techniques de souillure de tissu, aussi bien que l’examen soigneux des arrangements de formation image. Ce protocole contient des considérations pratiques pour l’ensemble de ce processus.

Résumé

La microscopie électronique à balayage de bloc-face série (SBF-SEM) permet la collecte de centaines à des milliers d’images d’ultrastructure série-enregistrées, offrant une vue tridimensionnelle sans précédent de la microanatomie de tissu. Tandis que SBF-SEM a vu une augmentation exponentielle de l’utilisation ces dernières années, les aspects techniques tels que la préparation appropriée de tissu et les paramètres d’imagerie sont primordiaux pour le succès de cette modalité d’imagerie. Ce système d’imagerie bénéficie de la nature automatisée de l’appareil, permettant de laisser le microscope sans surveillance pendant le processus d’imagerie, avec la collecte automatisée de centaines d’images possible en une seule journée. Cependant, sans préparation tissulaire appropriée, l’ultrastructure cellulaire peut être modifiée de telle sorte que des conclusions incorrectes ou trompeuses puissent être tirées. De plus, les images sont générées en scannant la face d’îlot d’un échantillon biologique incorporé dans la résine, ce qui présente souvent des défis et des considérations qui doivent être abordés. L’accumulation d’électrons dans le bloc pendant l’imagerie, connue sous le nom de « charge tissulaire », peut entraîner une perte de contraste et une incapacité à apprécier la structure cellulaire. De plus, bien que l’augmentation de l’intensité/tension du faisceau d’électrons ou la diminution de la vitesse de balayage du faisceau puisse augmenter la résolution de l’image, cela peut également avoir l’effet secondaire malheureux d’endommager le bloc de résine et de déformer les images suivantes dans la série d’imagerie. Ici, nous présentons un protocole de routine pour la préparation d’échantillons de tissus biologiques qui préserve l’ultrastructure cellulaire et diminue la charge tissulaire. Nous fournissons également des considérations d’imagerie pour l’acquisition rapide d’images série de haute qualité avec des dommages minimaux au bloc tissulaire.

Introduction

La microscopie électronique à balayage de face de bloc série (SBF-SEM) a été décrite pour la première fois par Leighton en 1981 où il a façonné un microscope électronique à balayage augmenté d’un microtome intégré qui pourrait couper et imager de fines sections de tissu incorporées dans la résine. Malheureusement, des limitations techniques ont limité son utilisation aux échantillons conducteurs, car les échantillons non conducteurs tels que les tissus biologiques accumulaient des niveaux inacceptables de charge (accumulation d’électrons dans l’échantillon tissulaire)1. Bien que le revêtement de la face de bloc entre les coupures avec une charge tissulaire réduite en carbone évaporé ait considérablement augmenté, cela a considérablement augmenté le temps d’acquisition d’images et le stockage d’images est resté un problème car la technologie informatique à l’époque était insuffisante pour gérer les grandes tailles de fichiers créées par l’appareil. Cette méthodologie a été revisitée par Denk et Horstmann en 2004 à l’aide d’un SBF-SEM équipé d’une chambre à pression variable2. Cela a permis l’introduction de vapeur d’eau dans la chambre d’imagerie, ce qui réduit la charge dans l’échantillon, rendant l’imagerie des échantillons non conducteurs viable, bien qu’avec une perte de résolution d’image. D’autres améliorations dans la préparation des tissus et les méthodes d’imagerie permettent maintenant l’imagerie à l’aide du vide élevé, et l’imagerie SBF-SEM ne repose plus sur la vapeur d’eau pour dissiper la charge3,4,5,6,7,8,9. Tandis que SBF-SEM a vu une augmentation exponentielle de l’utilisation ces dernières années, les aspects techniques tels que la préparation appropriée de tissu et les paramètres d’imagerie sont primordiaux pour le succès de cette modalité d’imagerie.

SBF-SEM permet la collecte automatisée de milliers d’images de microscopie électronique enregistrées en série, avec une résolution plane aussi petite que 3-5 nm10,11. Les tissus, imprégnés de métaux lourds et incorporés dans de la résine, sont placés dans un microscope électronique à balayage (MEB) contenant un ultramicrotome muni d’un couteau à diamant. Une surface plane est coupée avec le couteau diamant, le couteau est rétracté et la surface du bloc est scannée dans un motif raster avec un faisceau d’électrons pour créer une image de l’ultrastructure tissulaire. Le bloc est ensuite soulevé une quantité spécifiée (par exemple, 100 nm) dans l’axe z, connu sous le nom de « z-step », et une nouvelle surface est coupée avant que le processus ne soit répété. De cette façon, un bloc d’images en 3 dimensions (3D) est produit lorsque le tissu est coupé. Ce système d’imagerie bénéficie en outre de la nature automatisée de l’appareil, permettant de laisser le microscope sans surveillance pendant le processus d’imagerie, avec la collecte automatisée de centaines d’images possible en une seule journée.

Alors que l’imagerie SBF-SEM utilise principalement des électrons rétrodiffusés pour former une image de la face de bloc, des électrons secondaires sont générés au cours du processus d’imagerie12. Les électrons secondaires peuvent s’accumuler, aux côtés des électrons rétrodiffusés et à faisceau primaire qui ne s’échappent pas du bloc, et produire une « charge tissulaire », ce qui peut conduire à un champ électrostatique localisé au niveau de la face du bloc. Cette accumulation d’électrons peut déformer l’image ou provoquer l’éjection d’électrons du bloc et contribuer au signal collecté par le détecteur de rétrodiffusion, diminuant ainsi le rapport signal/bruit13. Alors que le niveau de charge tissulaire peut être diminué en réduisant la tension ou l’intensité du faisceau d’électrons, ou en réduisant le temps d’arrêt du faisceau, il en résulte une diminution du rapport signal sur bruitde 14. Lorsqu’un faisceau d’électrons de tension ou d’intensité inférieure est utilisé, ou que le faisceau n’est autorisé à demeurer dans chaque espace de pixel que pendant une période plus courte, moins d’électrons rétrodiffusés sont éjectés du tissu et capturés par le détecteur d’électrons, ce qui entraîne un signal plus faible. Denk et Horstmann ont résolu ce problème en introduisant de la vapeur d’eau dans la chambre, réduisant ainsi la charge dans la chambre et sur la face de bloc au détriment de la résolution d’image. Avec une pression de chambre de 10-100 Pa, une partie du faisceau d’électrons est diffusée contribuant au bruit de l’image et à une perte de résolution, mais cela produit également des ions dans la chambre d’éprouvette qui neutralise la charge à l’intérieur du bloc d’échantillon2. Des méthodes plus récentes pour neutraliser la charge dans le bloc d’échantillon utilisent l’injection focale de gaz d’azote sur la face du bloc lors de l’imagerie, ou l’introduction d’une tension négative à l’étage SBF-SEM pour diminuer l’énergie de la sonde-faisceau-ladage et augmenter le signal collecté6,7,15. Plutôt que d’introduire un biais d’étape, une pression de chambre ou une injection localisée d’azote pour diminuer l’accumulation de charge sur la surface du bloc, il est également possible d’augmenter la conductivité de la résine en introduisant du carbone dans le mélange de résine permettant des réglages d’imagerie plus agressifs16. Le protocole général suivant est une adaptation du protocole de Deerinck et al. publié en 2010 et couvre les modifications apportées aux méthodologies de préparation et d’imagerie des tissus que nous avons trouvées utiles pour minimiser la charge tissulaire tout en maintenant l’acquisition d’images à haute résolution3,17,18,19. Tandis que le protocole mentionné précédemment s’est concentré sur le traitement de tissu et l’imprégnation de métaux lourds, ce protocole fournit un aperçu dans l’imagerie, l’analyse de données, et le flux de travail de reconstruction inhérent aux études de SBF-SEM. Dans notre laboratoire, ce protocole a été appliqué avec succès et reproductiblement à une grande variété de tissus, y compris la cornée et les structures du segment antérieur, la paupière, la glande lacrymale et plus dure, la rétine et le nerf optique, le cœur, le poumon et les voies respiratoires, les reins, le foie, le muscle crémaster et le cortex cérébral / médulle, et dans une variété d’espèces, y compris la souris, le rat, le lapin, le cobaye, le poisson, la monocouche et les cultures cellulaires stratifiées, le porc, le primate non humain, ainsi que l’homme20,21,22,23. Bien que de petits changements puissent être utiles pour des tissus et des applications spécifiques, ce protocole général s’est avéré hautement reproductible et utile dans le contexte de notre installation d’imagerie de base.

Protocole

Tous les animaux ont été manipulés conformément aux lignes directrices décrites dans la Déclaration d’utilisation d’animaux dans la recherche sur la vision et l’ophtalmologie de l’Association for Research in Vision and Ophthalmic Research et dans les lignes directrices sur la manipulation des animaux du College of Optometry de l’Université de Houston. Toutes les procédures relatives aux animaux ont été approuvées par les établissements dans lesquels elles ont été manipulées : les procédures relatives aux animaux de souris, de rat, de lapin, de cobaye et de primate non humain ont été approuvées par le Comité de protection et d’utilisation des animaux de l’Université de Houston, les procédures relatives aux poissons zèbres ont été approuvées par le Comité de protection et d’utilisation des animaux de l’Université DePauw et les procédures relatives aux porcs ont été approuvées par le Baylor College of Medicine Animal Care and Use Committee. Tous les tissus humains ont été manipulés conformément à la Déclaration d’Helsinki concernant la recherche sur les tissus humains et l’approbation appropriée du comité d’examen institutionnel a été obtenue.

1. Traitement des tissus

  1. Préparer une solution mère de tampon de cacodylate de sodium 0,4M en mélangeant de la poudre de cacodylate de sodium dans du ddH2O. Bien mélanger le tampon et le pH ajuster la solution à 7,3. Ce tampon est utilisé pour fabriquer des solutions fixatives (composition décrite ci-dessous à l’étape 1.3), des tampons de lavage, ainsi que des solutions d’osmium et de ferrocyanure de potassium.
    REMARQUE: La fixation de perfusion est souvent la meilleure méthode de fixation pour les études SBF-SEM, car la fixation se produit rapidement et dans tout le corps. Si la fixation de perfusion n’est pas possible dans votre plan d’étude, passez à l’étape 1.3.
  2. Effectuer la fixation de perfusion avec la pression physiologique appropriée pour le modèle animal24,25,26. Cela se fait par perfusion séquentielle transcardiaque avec une solution saline héparinisée suivie d’une solution fixative, chacune placée à une hauteur spécifique (par exemple, 100 cm) au-dessus de l’organisme (appropriée à la pression physiologique du système vasculaire dans le modèle animal), avec un fixateur s’écoulant dans le ventricule gauche et sortant d’une incision faite dans l’oreillette droite. Le tissu d’intérêt deviendra pâle à mesure que le sang sera remplacé par un tissu fixateur, si tout ou partie de votre tissu ne blanchit pas, il se peut que le tissu ne soit pas fixé de manière appropriée et que l’ultrastructure ne soit pas préservée.
  3. Utilisez une lame de rasoir ou un scalpel tranchant pour couper les échantillons de tissus en blocs ne dépassant pas 2 mm x 2 mm x 2 mm. Si l’étape 1.2 a été ignorée, faites-le rapidement afin que le tissu puisse être fixé en immersion le plus rapidement possible.
    1. Alternativement, disséquer le tissu sous fixateur et le transférer à fixateur frais pour compléter le processus d’immersion. La composition finale du fixateur est constituée de tampon de cacodylate de sodium 0,1 M contenant 2,5 % de glutaraldéhyde et 2 mM de chlorure de calcium. Laisser la fixation se dérouler pendant au moins 2 heures à température ambiante et au maximum pendant la nuit à 4 °C. Si possible, utilisez une plaque bascule/inclinable pour agiter doucement les échantillons pendant la fixation.
    2. Alternativement, si un micro-ondes d’onduleur est disponible, fixer le tissu dans le fixateur susmentionné sous vide à 150 watts pendant 4 cycles de 1 minute allumée, 1 minute éteinte. La fixation micro-ondes est la méthode préférée pour l’étape 1.3 car elle fixe rapidement les tissus et préserve l’ultrastructuretissulaire 27.
      REMARQUE: Les tissus ne doivent jamais être autorisés à sécher pendant ce protocole, des précautions doivent être prises pour transférer rapidement les tissus d’une solution à l’autre.
  4. Laver les tissus fixes 5x pendant 3 minutes chacun (15 minutes au total) à température ambiante dans un tampon de cacodylate de sodium 0,1 M contenant 2 mM de chlorure de calcium.
  5. Rendre fraîche la solution de ferrocyanure d’osmium suivante, de préférence lors des étapes de lavage précédentes. Combiner une solution de tétroxyde d’osmiumà 4 % (préparée dans du ddH2O) avec un volume égal de ferrocyanure de potassium à 3 % dans un tampon de cacodylate 0,2 M avec du chlorure de calcium 4 mM. Après l’étape de lavage précédente, placez le tissu dans cette solution pendant 1 heure sur de la glace dans l’obscurité et dans la hotte.
    REMARQUE: Le tétroxyde d’osmium est une substance cristalline jaune qui vient dans une ampoule. Pour créer la solution de tétroxyde d’osmium, couvrez l’ampoule, ajoutez ddH2Oet soniquez pendant 3-4 heures dans l’obscurité jusqu’à ce que les cristaux soient complètement dissous. La solution de tétroxyde d’osmium est une solution jaune clair, si la solution est noire, l’osmium a été réduit et ne doit plus être utilisé.
  6. Pendant que le tissu est en incubation dans la solution de ferrocyanure d’osmium, commencez à préparer la solution de thiocarbohydrazide (TCH). Préparez cette solution fraîche et ez-la facilement disponible à la fin de la période de fixation du ferrocyanure d’osmium de 1 heure. Mélanger 0,1 g de thiocarbohydrazide avec 10 mL deddH2Oet placer cette solution dans une étuve à 60 °C pendant 1 heure. Pour vous assurer que la solution est dissoute, tourbillonnez doucement toutes les 10 minutes. Avant utilisation, filtrer cette solution à l’intermédiaire d’un filtre à seringue de 0,22 μm.
  7. Avant d’incuber dans TCH, laver le tissu avec la température ambiante ddH2O 5x pendant 3 minutes chacun (15 minutes au total).
  8. Placer le tissu dans la solution de TCH filtrée pendant un total de 20 minutes à température ambiante(figure 1A-C).
  9. Après incubation en TCH, laver le tissu 5x pendant 3 minutes chacun (15 minutes au total) à température ambianteddH2O.
  10. Placer les tissus dans duddH2Ocontenant du tétroxyde d’osmium à 2 % (et non de l’osmium réduit avec du ferrocyanure de potassium) pendant 30 minutes à température ambiante. Cela devrait être fait dans la hotte et dans l’obscurité, car l’osmium peut être réduit par la lumière (par exemple, sous feuille d’aluminium)(figure 1D-F).
  11. Après incubation du tétroxyde d’osmium, laver les tissus 5x pendant 3minutes chacun (15 minutes au total) à température ambiante ddH2O.
  12. Placer les tissus dans de l’acétate d’uranyle aqueuxà 1 % (poudre d’acétate d’uranyle mélangée à ddH2O) pendant la nuit au réfrigérateur à 4 °C.
  13. Juste avant de retirer le tissu du réfrigérateur, préparez la solution d’aspartate de plomb de Walton fraîche. Commencez par dissoudre 0,066 g de nitrate de plomb dans 10 mL de solution d’acide aspartique de 0,03 M (0,04 g d’acide aspartique dans 10 mL d’eau distillée) et ajustez le pH à 5,5 avec 1 N KOH (0,5611 g dans 10 mL d’eau distillée).
    ATTENTION : Un précipité peut se former lors du réglage du pH. Ce n’est pas acceptable.
    1. À l’aide d’une barre d’agitation, ajoutez lentement le KOH 1 N goutte à goutte tout en surveillant le pH. Préchauffer la solution d’aspartate de plomb clair fini dans un four à 60 °C pendant 30 minutes. Si un précipité se forme, la solution ne peut pas être utilisée et une autre solution doit être préparée.
  14. Retirer le tissu du réfrigérateur et laver 5x pendant 3 minutes chacun (15 minutes au total) à température ambiante ddH2O.
  15. Après le lavage, placez le tissu dans la solution d’aspartate de plomb de Walton réchauffée pendant 30 minutes tout en maintenant la température à 60 °C.
  16. Après incubation dans l’aspartate de plomb de Walton, laver le tissu 5x pendant 3minutes chacun (15 minutes au total) à température ambiante ddH2 O(figure 1G-I).
  17. Déshydrater le tissu à travers une série d’acétone glacée (30%, 50%, 70%, 95%, 95%, 100%, 100% et 100% d’acétone (en ddH2O le cas échéant) en laissant 10 minutes pour chaque étape de la série.
  18. Après la série de déshydratation glacée, placez les tissus dans de l’acétone à température ambiante pendant 10 minutes.
    1. Pendant ce temps, formulez la résine Embed 812 ACM. Utilisez la recette « hard mix » car elle est plus résistante aux dommages causés par le faisceau. Mélangez soigneusement la résine et placez le tissu dans Embed 812: acétone (mélange 1: 3) pendant 4 heures, suivi de Embed 812: acétone (mélange 1: 1) pendant 8 heures ou pendant la nuit, et enfin incorporez 812: acétone (mélange 3: 1) pendant la nuit. Effectuez ces étapes d’infiltration de résine à température ambiante.
  19. Le lendemain, placez le tissu dans 100% Embed 812 pendant 4-8 heures, puis dans frais 100% Embed 812 nuit, et enfin dans frais 100% Embed 812 pendant 4 heures. Effectuez ces étapes d’infiltration de résine à température ambiante.
    1. Juste avant l’encastrement, placez une petite quantité de résine dans un récipient de mélange et mélangez lentement (un bâton en bois peut être utilisé pour l’agitation) dans de la poudre de noir de carbone jusqu’à ce que la résine soit saturée de poudre mais reste fluide et ne devienne pas granuleuse. Il devrait ressembler à de l’encre épaisse et être capable de s’égoutter lentement du bâton en bois sans touffes visibles.
  20. Orientez les échantillons de tissu dans un moule en caoutchouc de silicone et prenez une photo afin que l’orientation de l’échantillon dans le bloc de résine soit enregistrée et puisse être référencée. Couvrez les échantillons dans de la résine saturée de noir de carbone à l’extrémité du moule en silicone et placez le moule dans un four pendant environ 1 heure à 65 °C.
    1. Placez le moule à une pente pour contenir la résine à l’extrémité du moule où il recouvre l’échantillon de tissu. Placer une étiquette avec un identificateur d’échantillon d’expérience/tissu dans le moule à l’extrémité opposée de la résine(figure 2A).
  21. Retirez le moule en silicone du four et remplissez le reste du moule avec de la résine transparente (pas de noir de carbone) en vous assurant que l’étiquette reste visible. Durcir la résine infusée de noir de carbone suffisamment pour ne pas mélanger facilement avec la résine claire.
    1. Préparez un puits supplémentaire dans le moule qui ne contient pas de tissu. En commençant par le puits supplémentaire, remplissez le reste du moule avec de la résine claire.
    2. Si la résine infusée au noir de carbone commence à saigner dans la résine transparente, replacez le moule en silicone dans le four pendant plus de temps (p. ex. 15 minutes).
    3. Une fois que tous les échantillons de tissus ont été remplis de résine transparente, replacez le moule en silicone dans le four (plat, sans inclinaison) à 65 °C pendant 48 heures pour terminer le processus de durcissement.

2. Préparation des blocs

Remarque : la méthode dépend de la façon dont l’échantillon est orienté dans le bloc et comment le sectionnement doit avoir lieu. Cependant, l’orientation tissulaire la plus courante trouve le tissu centré dans l’extrémité du bloc de résine, perpendiculairement à l’extrémité longue du bloc de résine.

  1. Dans la plupart des cas, coupez d’abord l’extrémité du bloc pour localiser le tissu en plaçant le bloc d’échantillon dans le mandrin de microtome avec l’extrémité conique collant à environ 5-6 mm du mandrin. Verrouillez-le en place avec la vis de réglage et placez-le sous une lampe chauffante.
  2. Après plusieurs minutes, le bloc sera malléable et facile à couper. Placez le mandrin dans le support de stéréomicroscope et utilisez une nouvelle lame de rasoir à double tranchant pour faire de fines sections parallèles à la face du bloc jusqu’à ce que le tissu soit visible. Ceci est mieux vu en pêchant la lumière à travers la face de bloc, l’échantillon de tissu sera moins réfléchissant et granulaire par rapport aux parties de la résine qui sont dépourvues de tissu. Consultez la photographie prise d’échantillons de tissus avant l’introduction de la résine saturée de noir de carbone pour avoir une idée de la façon dont le tissu se trouve et de l’endroit où il se trouve.
  3. Mettez de côté un porte-goupille d’échantillon à des fins de parage. Ce porte-goupille n’est jamais placé dans la chambre SEM et peut donc être manipulé sans gants, cela sera appelé le support de goupille de coupe. Tout porte-échantillon destiné à être placé dans la chambre d’imagerie ne doit jamais être touché sans gants. Cela évite d’introduire de la graisse et de l’huile dans la chambre du microscope.
  4. Placez une goupille d’échantillon en aluminium dans le support de goupille de garniture et serrez légèrement la vis de réglage avec la face (surface plane) de la goupille maintenue 3-4mm au-dessus du support de broche.
  5. Faites plusieurs rayures profondes et entrecroisantes à la face de la goupille pour fournir une plus grande surface pour la colle utilisée pour maintenir l’échantillon en place. Si une goupille en aluminium est utilisée, un petit tournevis à tête plate en acier est recommandé pour cette étape(Figure 2B).
  6. Replacez le mandrin contenant l’échantillon de tissu sous la lampe chauffante jusqu’à ce que la résine devienne molle et malléable, puis placez-le dans le réceptacle de mandrin sous le stéréomicroscope.
  7. Utilisation d’une lame de rasoir à double tranchant pour couper l’excès de résine de la partie du bloc de résine contenant l’échantillon de tissu. En fin de compte, la taille du bloc de tissu attaché à la broche sera d’environ 3 mm de diamètre et 2-3 mm de hauteur.
    1. Poussez soigneusement le rasoir directement dans le bloc de résine d’environ 1-2 mm, puis poussez soigneusement le rasoir horizontalement dans le bloc de résine à une profondeur égale à la coupe précédente. Faites-le lentement et avec beaucoup de soin, car il est possible d’endommager ou de couper la partie du bloc contenant l’échantillon de tissu. Au fur et à mesure que les deux coupes se rencontrent, l’excès de résine se sépare du bloc. Continuer d’enlever la résine jusqu’à ce qu’il ne reste qu’une surface surélevée de 3 mm x 3 mm.
  8. Après cette coupe initiale, placez le bloc (toujours dans le mandrin) sous la lampe chauffante pendant plusieurs minutes.
  9. Une fois que la résine devient molle et malléable, replacez le bloc sous le stéréomicroscope. À l’aide d’une nouvelle lame de rasoir à double tranchant, coupez le dessus du bloc de résine, à environ 1 mm sous la partie coupée, avec une seule coupe lisse. Une surface plane est préférable car elle sera collée à la broche de l’échantillon. Veillez à ne pas laisser l’échantillon se perdre, car cette étape nécessite une certaine force qui peut être transférée à la partie enlevée du bloc et le faire s’envoler. Placez l’échantillon coupé et coupé de côté.
  10. Placez le support de goupille de rognage contenant la goupille en aluminium découpée dans le réceptacle de stéréomicroscope. Appliquez une fine couche de colle cyanoacrylate sur la face de la goupille de sorte qu’elle recouvre complètement la broche sans former de ménisque visible. Ramassez la pièce parée du bloc de tissu avec une pince et placez-la sur la face de la goupille. Centrer l’échantillon de tissu sur la goupille de l’échantillon. Poussez-le vers le bas et maintenez-le enfoncé pendant plusieurs secondes. Laissez la colle se régler pendant plusieurs minutes.
  11. Lorsque la colle est bien sèche, replacez le support de goupille de coupe sous le stéréomicroscope. À l’aide d’une lime fine, rangez l’excès de résine afin qu’aucune résine ne surplombe la broche. La forme de la résine doit ressembler à la tête d’épingle circulaire.
  12. Localisez le tissu sur la partie surélevée de votre bloc de résine, l’éclairage oblique est utile pour cela. À l’aide d’un rasoir à double tranchant, la partie surélevée de la résine contenant l’échantillon de tissu doit être taillée sur une surface ne dépassant pas 1mm2. Si possible, la face de bloc peut être coupée encore plus petite, cela réduira le stress sur le couteau en diamant et améliorera sa longévité.
    1. Retirez autant que possible l’excès de résine, en laissant le bloc légèrement plus long dans une dimension. Cela se fait lentement et avec soin, car il est possible que la résine contenant l’échantillon de tissu se détache si trop de force est appliquée. Bien qu’un rasoir soit recommandé, un fichier en métal fin peut être utilisé pour cette étape.
  13. Avec un angle de lime métallique fine, l’excès de résine, dans la zone située à l’extérieur de la partie surélevée contenant l’échantillon de tissu, vers le bas vers le bord de la goupille(figure 2C).
  14. Retirez les particules de résine et la poussière de l’échantillon préparé avant d’appliquer de la peinture argentée suivie d’une pulvérisation d’or. Mélangez l’argent avec de l’acétone afin qu’il s’agit d’un liquide facilement tartinable, semblable au vernis à ongles (mais pas si mince qu’il s’égoutte de l’applicateur) et appliquez une couche mince sur toute la surface du bloc d’échantillon. L’acétone s’évapore rapidement, il peut donc être nécessaire d’ajouter de l’acétone supplémentaire lorsque la peinture argentée commence à s’épaissir.
    1. Laissez la peinture argentée sécher pendant la nuit avant de la charger dans le microscope.
      REMARQUE: Cette couche d’argent doit être mince afin d’éviter d’élargir la face de bloc au-delà de 1 mm x 1 mm, et bien que la peinture argentée n’ait jamais endommagé le couteau de diamant, des faces de bloc plus petites sont toujours recommandées pour préserver la longévité du couteau de diamant. L’acétone mélangée à l’argent doit s’évaporer complètement avant la pulvérisation d’or ou le chargement de l’échantillon dans le microscope pour éviter d’introduire de la vapeur d’acétone dans la chambre d’imagerie.
    2. Après l’application de peinture argentée, appliquez une fine couche d’or sur le bloc d’échantillon. En utilisant un dispositif de pulvérisation sous vide standard équipé d’une cible de feuille d’or standard, une pression de chambre de 200 milliTorr (gaz Argon) et 40 milliampères fonctionnant pendant 2 minutes se traduira par un revêtement d’or de 20 nm d’épaisseur.
  15. Après le revêtement, placez le bloc monté et paré dans un tube avec l’étiquette d’expérience appropriée attachée. Créez des tubes personnalisés à l’aide de pipettes de transfert jetables.
    1. Couper la pipette de transfert juste en dessous de l’ampoule, en laissant une courte partie du tube de pipette de transfert attaché sous l’extrémité bulbeuse. Raccourcissez la partie tubulaire qui a été coupée et coupez suffisamment la pointe de la pipette pour que la goupille d’échantillon en aluminium puisse être poussée à l’intérieur de celle-ci.
    2. Placer l’extrémité contenant la goupille d’échantillon en aluminium dans l’extrémité bulbeuse de la pipette de transfert modifiée.
  16. Avant de charger un bloc de tissu préparé, coupez soigneusement l’excès de peinture argentée de la surface de la face du bloc.

3. Paramètres SEM pour l’imagerie du visage de bloc

REMARQUE : Les paramètres d’imagerie qui suivent ont été produits sur l’appareil utilisé par les auteurs, qui est répertorié dans la table des matériaux fournie. Bien que cet appareil soit capable d’imagerie à pression variable, les meilleurs résultats ont été capturés sous vide élevé.

  1. Temps d’arrêt: Utilisez 12 μs/px pendant le sectionnement série. Lorsqu’une région d’intérêt a été identifiée, une image de résolution plus élevée peut être acquise à 32 μs/px.
  2. Paramètres du vide : Utilisez une pression de canon de 9e-008 Pa, une pression de colonne de 1,1e-004 Pa et une pression de chambre de 9,5e-002 Pa.
  3. Temps de capture : Avec les paramètres ci-dessus, capturez une pile d’images 2048x2048 px à une vitesse de 50 secondes par image. Les images à plus haute résolution des régions d’intérêt peuvent être capturées à 4096x4096 px à un peu moins de 9 minutes par image.
  4. Épaisseur de la section : Utilisez 100-200 nm. Moins est possible, mais peut nécessiter une tension, une intensité ou un temps d’arrêt du faisceau inférieur.
  5. Haute tension (HV): Utilisez 7-12 kV. Tout en augmentant la tension réduit la taille du spot et augmente la résolution, il introduit plus de possibilités pour les dommages de faisceau. Un kV plus élevé augmente la pénétration du faisceau, ce qui entraîne une perte de détails. Cependant, l’abaissement du kV dégrade le rapport signal/bruit (Figure 3)14.
  6. Intensité du faisceau (BI) : Le dispositif SBF-SEM de l’auteur offre une échelle d’intensité de faisceau allant de 1 à 20. Sur cette échelle, des valeurs de 5 à 7 donnent des images de qualité sans charge excessive et sans dommages au faisceau. Plus le BI est élevé, plus la résolution est grande, cependant, il y a plus de risque de charge et de dommages au faisceau14.
  7. Taille du spot et grossissement de l’image : Déterminez la taille du spot en par l’intensité du faisceau et le niveau de tension. Idéalement, la taille du point ne doit pas être supérieure à la taille de pixel utilisée. La taille en pixels est déterminée en divisant le champ de vision (FOV) par le nombre de pixels. Par exemple, un champ de vision de 25 μm avec une taille d’image de 2048 x 2048 px donnerait 12,2 nm par pixel. Par conséquent, la taille du spot ne doit pas être supérieure à 12,2 nm. La figure 4 montre comment HV, BI et la taille des points sont liés.
  8. Distance de travail (WD) - Avec l’imagerie de face de bloc, la distance de travail n’est pas réglable. C’est simplement un facteur de concentration. Il sera presque identique pour tous les blocs entré. Bien que la distance de travail ne soit pas réglable, elle joue un rôle essentiel dans la résolution de l’image capturée. À mesure que la distance de travail diminue, la limite de résolution sur les images capturées augmente. Dans certains cas, il peut être possible de diminuer la distance de travail en apportant des modifications dans la chambre d’imagerie, mais ces modifications doivent être effectuées à la discrétion de l’utilisateur. Afin de diminuer la distance de travail et d’augmenter la résolution de l’image, nous avons desserré les vis de microtome de montage de porte et repositionné le microtome de sorte qu’il repose ~ 2 mm plus près du détecteur de faisceau après avoir ré-embrasé les vis.
  9. Résolution - En utilisant les paramètres ci-dessus, une résolution x &y aussi élevée que 3,8 nm est possible. Il est important de noter que la résolution est limitée par la taille du point de faisceau ainsi que par la résolution en pixels des captures d’image (par exemple, un champ de vision de 20 μm capturé dans une image de 2048 x 2048 pixels a une résolution en pixels de 9,8 nm, même si une taille de point de 3,8 nm a été utilisée). La résolution de l’image dans le plan z dépend de l’épaisseur de sectionnement, nous constatons que 100-200 nm fonctionne bien avec ce protocole.

Résultats

Cornée de souris
Ce protocole a été largement appliqué à la cornée de souris. Utilisant la formation image de SBF-SEM un réseau des paquets sans élastine de microfibrille (EFMBs) se sont avérés présents dans la cornée adulte de souris. On croyait auparavant que ce réseau n’était présent que pendant le développement embryonnaire et postnatal précoce. SBF-SEM a indiqué un réseau étendu d’EFMB dans toute la cornée, avec les différentes fibres avérées pour être 100-200 nanomè...

Discussion

Le but de cet article de méthodes est de mettre en évidence la méthodologie de préparation et d’imagerie des tissus qui a permis à notre laboratoire de capturer de manière fiable des images de microscopie électronique série à haute résolution, et de souligner les étapes critiques qui mènent à ce résultat ainsi que les pièges potentiels qui peuvent survenir lors de la réalisation de l’imagerie SBF-SEM. Le succès de l’utilisation de ce protocole nécessite une fixation appropriée des tissus, l’imp...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous tenons à remercier M. Sam Hanlon, Evelyn Brown et Margaret Gondo pour leur excellente assistance technique. Cette recherche a été soutenue en partie par les National Institutes of Health (NIH) R01 EY-018239 et P30 EY007551 (National Eye Institute), en partie par la Lion’s Foundation for Sight, et en partie par nih 1R15 HD084262-01 (National Institute of Child Health &Human Development).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
1/16 x 3/8 Aluminum RivetsIndustrial Rivet & Fastener Co.6N37RFLAP/1100Used as specimen pins.
2.5mm Flathead ScrewdriverWiha Quality Tools27225
AcetoneElectron Microscopy SciencesRT 10000Used to dilute silver paint.
Aspartic AcidSigma-AldrichA8949
Calcium ChlorideFisherScientificC79-500
Conductive Silver PaintTed Pella16062
Denton Desk-II Vacuum Sputtering Device equipped with standard gold foil targetDenton VacuumN/AThis is the gold-sputtering device used by the authors, alternates are acceptable.
Double-edged RazorsFisher Scientific50-949-411
Embed 812Electron Microscopy Sciences14120
Gatan 3View2 mounted in a Tescan Mira3 Field emission SEMGatan & TescanN/AThis is the SBF-SEM device used by the authors, alternates are acceptable.
Glass Shell Vials, 0.5 DRAM (1.8 ml)Electron Microscopy Sciences72630-05
GluteraldehydeElectron Microscopy Sciences16320
Gorilla Super Glue - Impact ToughNANARefered to as cyanoacrylate glue in text.
Ketjen BlackHM RoyalEC-600JDRefered to as carbon black in text.
KOHFisherScientific18-605-593
Lead NitrateFisher ScientificL62-100
MicrowavePelcoBioWave ProThis is the microwave used by the authors, alternates are acceptable.
Osmium TetroxideSigma-Aldrich201030
Potassium FerrocyanideSigma-AldrichP9387
Silicone Embedding MoldTed Pella10504
Sodium Cacodylate TrihydrateElectron Microscopy Sciences12300
Samco Transfer PipetteThermoFisher Scientific202Used to make specimen pin storage tubes.
Swiss Pattern Needle FilesElectron Microscopy Sciences62115
ThiocarbohydrazideSigma-Aldrich223220
Uranyl AcetatePolysciences, Inc.21447-25
Reconstruction Software
Amira SoftwareThermo ScientificN/AUsed to create the reconstructions found in figures 5-7 and 9.
Fiji (Fiji is Just ImageJ)ImageJ.netN/ATrakEM2 can be added to Fiji to asist in manual segmentation.
Microscopy Image Browser (MIB)University of Helsinki, Institute of BiotechnologyN/A
Reconstuct SoftwareNeural Systems LabN/A
SuRVoS WorkbenchDiamond Light Source & The University of NottinghamN/A
SyGlassIstoVisio, Inc.N/AAllows for reconstruction in virtual reality and histogram-based reconstruction methods.

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