생물학적 조직 샘플의 직렬 블록-얼굴 스캐닝 전자 현미경 검사(SBF-SEM)

요약

이 프로토콜은 강력한 3D 이미징 기술인 직렬 블록-페이스 스캐닝 전자 현미경 검사(SBF-SEM)를 사용하는 일상적인 방법을 간략하게 설명합니다. SBF-SEM의 성공적인 적용은 적절한 고정 및 조직 염색 기술뿐만 아니라 이미징 설정을 신중하게 고려합니다. 이 프로토콜에는 이 프로세스 전체에 대한 실용적인 고려 사항이 포함되어 있습니다.

초록

직렬 블록-얼굴 스캐닝 전자 현미경 검사(SBF-SEM)는 수백~수천 개의 연속 등록 초구조 이미지를 수집하여 조직 미세 해부학의 전례 없는 3차원 뷰를 제공합니다. SBF-SEM은 최근 몇 년 동안 사용이 기하급수적으로 증가하는 반면, 적절한 조직 준비 및 이미징 매개 변수와 같은 기술적 측면은 이 이미징 양식의 성공을 위해 가장 중요합니다. 이 이미징 시스템은 장치의 자동화된 특성의 이점을 통해 이미징 프로세스 중에 현미경을 방치하고 하루에 수백 개의 이미지를 자동화하여 수집할 수 있습니다. 그러나, 적절 한 조직 준비 없이 세포 울트라 구조 잘못 되 거나 오해의 소지가 결론 그려질 수 있습니다 같은 방식으로 변경할 수 있습니다. 또한 수지 임베디드 생물학적 샘플의 블록 페이스를 스캔하여 이미지가 생성되며, 이는 종종 해결해야 할 과제와 고려 사항을 제시합니다. "조직 충전"으로 알려진 이미징 중 블록 내의 전자가 축적되면 대비가 상실되고 세포 구조를 감상할 수 없습니다. 더욱이, 전자 빔 강도/전압을 증가하거나 빔 스캐닝 속도가 감소하면 이미지 해상도를 높일 수 있지만, 이는 또한 수지 블록을 손상시키고 이미징 시리즈에서 후속 이미지를 왜곡하는 불행한 부작용을 가질 수 있다. 여기서 우리는 세포 초구조를 보존하고 조직 충전을 감소시키는 생물학적 조직 샘플의 준비를 위한 일상적인 프로토콜을 제시합니다. 또한 티슈 블록에 최소한의 손상을 입히면서 고품질 의 시리얼 이미지를 빠르게 획득하기 위한 이미징 고려 사항을 제공합니다.

서문

직렬 블록 얼굴 스캐닝 전자 현미경 검사 (SBF-SEM)는 1981 년 레이튼에 의해 처음 설명되었으며 수지에 내장 된 조직의 얇은 섹션을 절단하고 이미지 할 수있는 내장 된 마이크로 토메로 보강 된 스캐닝 전자 현미경을 만들었습니다. 불행하게도, 기술적 제한은 생물학적 조직과 같은 비전도성 샘플이 허용 할 수없는 수준의 충전 (조직 샘플 내의 전자 축적)을 축적함에 따라 전도성 샘플에 의한 사용을^{제한하였다.} 증발된 탄소 감소 조직 충전으로 컷 사이에 블록 페이스를 코팅하는 동안, 이 크게 증가된 이미징 수집 시간과 이미지 저장은 당시 컴퓨터 기술이 장치에 의해 생성된 큰 파일 크기를 관리하기에 충분하지 못했기 때문에 문제가 남아 있었다. 이 방법론은 2004년 덴크와 호르스트만이 가변 압력 챔버^2를장착한 SBF-SEM을 사용하여 재검토되었다. 이를 통해 시료 내의 충전을 줄이는 이미징 챔버에 수증기를 도입하여 이미지 해상도의 손실에도 불구하고 비전도성 시료의 이미징을 실현할 수 있었습니다. 조직 제제 및 이미징 방법의 추가 개선은 이제 높은 진공을 사용하여 이미징을 허용하고, SBF-SEM 이미징은 더 이상 충전^{3,4,5,6,7,8,9를}방출하기 위해 수증기에 의존하지 않는다. SBF-SEM은 최근 몇 년 동안 사용이 기하급수적으로 증가하는 반면, 적절한 조직 준비 및 이미징 매개 변수와 같은 기술적 측면은 이 이미징 양식의 성공을 위해 가장 중요합니다.

SBF-SEM은 3-5 nm^10,11의작은 평면 해상도로 수천 개의 연속 등록 전자 현미경 이미지의 자동화 된 컬렉션을 허용합니다. 중금속으로 함침되고 수지에 내장된 조직은 다이아몬드 나이프가 장착된 초미세토메를 함유한 주사 전자 현미경(SEM) 내에 배치됩니다. 평평한 표면은 다이아몬드 칼로 절단되고, 칼은 후퇴하고, 블록의 표면은 조직 울트라 구조의 이미지를 만들기 위해 전자 빔이있는 래스터 패턴으로 스캔됩니다. 그런 다음 블록은 z축에서 지정된 양(예: 100 nm)을 제기하고"z-step"이라고 하며 프로세스가 반복되기 전에 새 표면이 절단됩니다. 이러한 방식으로 조직의 절단으로 3차원(3D) 이미지 블록이 생성된다. 이 이미징 시스템은 장치의 자동화된 특성으로부터 더 많은 이점을 누릴 수 있으므로 이미징 프로세스 중에 현미경을 방치하고 하루 만에 수백 개의 이미지를 자동화하여 수집할 수 있습니다.

SBF-SEM 이미징은 주로 백산전자를 사용하여 블록 페이스의 이미지를 형성하지만, 이차 전자는 이미징^{프로세스(12)}중에 생성된다. 이차 전자는 블록을 탈출하지 않는 백산및 1차 빔 전자와 함께 축적될 수 있으며 블록 페이스에서 국소화된 정전기장으로 이어질 수 있는 "조직 충전"을 생성할 수 있습니다. 이러한 전자 축적은 영상을 왜곡하거나 전자가 블록으로부터 배출되는 원인이 되며 백스캐터 검출기에 의해 수집된 신호에 기여하여 신호 대 잡음^비(13)를감소시킬 수 있다. 조직 충전의 수준은 전자 빔 전압 또는 강도를 감소시켜 감소 할 수 있지만, 빔 거주 시간을 감소, 이 감소 신호 대 잡음 비율⁽¹⁴⁾발생. 저전압 또는 강도의 전자 빔이 사용되거나, 빔이 짧은 시간 동안 각 픽셀 공간 내에만 거주할 수 있는 경우, 백산전자가 조직에서 배출되어 전자 검출기에 의해 포획되어 신호가 약해진다. 덴크와 호르스트만은 챔버에 수증기를 도입하여 이 문제를 처리하여 심실과 블록 페이스의 전하를 이미지 해상도로 줄였습니다. 10-100 Pa의 챔버 압력으로, 전자 빔의 일부가 이미지 잡음 및 해상도 의 손실에 기여하는 산란되지만, 이것은 또한 샘플 블록²내의 전하를 중화시 챔버에서 이온을 생성한다. 시료 블록 내에서 전하를 중화하는 방법은 이미징 중에 블록 페이스에 질소의 초점 가스 주입을 사용하거나, SBF-SEM 단계에 음수 전압을 도입하여 프로브 빔-라딩 에너지를 감소시키고 수집된 신호^{수집 6,7,15를}증가시킵니다. 블록 표면에 전하 축적을 감소시키기 위해 단계 바이어스, 챔버 압력 또는 국소화질소 주입을 도입하는 대신, 수지 믹스에 탄소를 도입하여 수지의 전도도를 높일 수 있어 더욱 공격적인 이미징^{설정(16)이}가능하다. 다음 일반적인 프로토콜은 2010년에 발표된 Deerinck 외 프로토콜의 적응이며, 고해상도 이미지 수집^3,17,18,19를 유지하면서 조직 충전을 최소화하는 데 유용하다고 판단한 조직 제제 및 이미징 방법론에 대한^수정을다룹니다. 이전에 언급된 프로토콜은 조직 처리 및 중금속 함침에 초점을 맞추고 있지만, 이 프로토콜은 SBF-SEM 연구에 내재된 이미징, 데이터 분석 및 재구성 워크플로우에 대한 통찰력을 제공합니다. 우리의 실험실에서, 이 프로토콜은 성공적으로 및 각막 및 전방 세그먼트 구조를 포함하여 조직의 다양한에 성공적으로 재현적으로 적용되었습니다, 눈꺼풀, 홍엽 및 하심자 동맥, 망막 및 시신경, 심장, 폐 및 기도, 신장, 간, 크레마스터 근육, 대뇌 피질/수질, 마우스, 쥐, 토끼, 기니 피그, 물고기, 단층 및 계층화된 세포 배양, 돼지, 비인간 영장류, 인간^20,21,23^,23. 사소한 변화는 특정 조직 및 응용 프로그램에 가치가있을 수 있지만,이 일반적인 프로토콜은 우리의 핵심 이미징 시설의 맥락에서 매우 재현하고 유용 입증했다.

프로토콜

모든 동물은 비전과 안과 연구에서 동물의 사용을위한 비전 및 안과 성명서와 휴스턴 대학 의 안과 동물 취급 지침에 따라 연구 협회에 설명 된 지침에 따라 처리되었습니다. 모든 동물 절차는 처리된 기관에 의해 승인되었습니다: 마우스, 쥐, 토끼, 기니 피그 및 비인간 영장류 절차는 휴스턴 동물 관리 및 사용 위원회의 대학에 의해 승인되었습니다, 제브라피시 절차는 DePauw 대학 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되고, 돼지 절차는 의학 동물 관리 및 사용위원회의 베일러 대학에 의해 승인되었습니다. 모든 인간 조직은 인간 조직에 대한 연구에 관한 헬싱키 선언에 따라 처리되었으며 적절한 제도적 검토 보드 승인을 획득하였다.

1. 조직 처리

1. ddH₂O.에 나트륨 코코디레이트 분말을 혼합하여 0.4M 나트륨 코코디레이트 버퍼의 스톡 용액을 준비하였으며, pH는 용액을 7.3으로 조절한다. 이 버퍼는 고정(1.3단계에서 아래에 설명된 조성), 세척 완충제, 오스뮴 및 페로시아니드 용액을 만드는 데 사용됩니다.
   참고: 관류 고정은 종종 SBF-SEM 연구에 대 한 고정의 가장 좋은 방법, 고정 신속 하 게 발생 하 고 몸 전체에. 학습 설계 내에서 관류 고정이 불가능한 경우 1.3단계로 건너뜁니다.
2. 동물^{모델(24,25,26)에}적합한 생리적 압력으로 관류 고정을 수행한다. 이는 경전 순차적 관류를 통해 처리된 식염수, 각각 유기체(예를 들어, 100cm) 위에 배치된 특정 높이(예: 동물 모델의 혈관 시스템의 생리적 압력에 적합), 좌심실로 고정이 흐르고 오른쪽 에서 이루어진 절개에서 빠져나옵니다. 혈액이 고정으로 대체되기 때문에 관심의 조직은 창백해질 것입니다, 조직의 전부 또는 일부가 희미하지 않는 경우에 그 때 조직은 적당하게 고정되지 않을 수 있고 초구조는 보존되지 않을 수 있습니다.
3. 면도날이나 날카로운 메스를 사용하여 조직 샘플을 2mm x 2mm x 2mm 이하블록으로 다듬습니다. 1.2단계를 건너뛰면 조직이 가능한 한 빨리 고정될 수 있도록 신속하게 이 작업을 수행하십시오.
   1. 또는, 고정 하에 조직을 해부하고 침지 과정을 완료하기 위해 신선한 고정으로 전달. 고정제의 최종 조성물은 2.5% 글루타랄데히드 및 2mM 칼슘 염화물을 함유한 0.1M 나트륨 코코디레이트 버퍼로 구성된다. 실온에서 최소 2시간, 최대 4°C에서 고정을 진행할 수 있습니다. 가능하면 로커/틸트 플레이트를 사용하여 수정하는 동안 샘플을 부드럽게 교반합니다.
   2. 또는 인버터 전자레인지를 사용할 수 있는 경우 1분 동안 1분 동안 150와트의 진공 상태에서 전술한 고정 상태에서 조직을 수정합니다. 전자레인지 고정은 조직을 빠르게 고정하고 조직^{초구조(27)를}보존하기 때문에 1.3단계에 바람직한 방법이다.
      참고 : 조직은이 프로토콜 동안 건조 할 수 없습니다, 다음 하나의 솔루션에서 신속하게 조직을 전송하기 위해주의해야한다.
4. 고정 조직을 실온에서 각각 3분(총 15분)씩 세척하여 2mM 칼슘 염화칼슘을 함유한 0.1M 나트륨 카코딜레이트 버퍼로 세척합니다.
5. 다음 osmium 페로시아니드 용액을 신선하게 만드십시오. 4mm 의 아스트란화물 용액(ddH_2O로제조)을 0.2M 카코딜레이트 버퍼에 3% 칼륨 페로시니드의 동일한 부피와 4mM 칼슘 염화칼슘을 결합합니다. 이전 세척 단계 후, 어둠 속에서 얼음에 1 시간 동안이 용액에 조직을 배치하고, 연기 후드에.
   참고: 오스뮴 테트리옥사이드는 앰프에 나오는 노란색 결정성 물질입니다. 오스뮴 테트산화물 용액을 만들려면 앰필을 열고 ddH₂O를 추가하고 결정이 완전히 용해 될 때까지 어둠 속에서 3-4 시간 동안 초음파 처리하십시오. 오스뮴 테트산화물 용액은 명확한 노란색 용액으로, 용액이 검은색이라면 osmium이 감소되어 더 이상 사용되지 않아야 합니다.
6. 조직이 오스뮴 페로시니드 용액에서 배양하는 동안 티오카르보히드라지드(TCH) 용액을 준비하기 시작합니다. 이 솔루션을 신선하게 준비하고 1시간 의 오시움 페로시아니드 고정 기간이 끝날 때 쉽게 사용할 수 있습니다. 티오카르보히드라지드 0.1g과 ddH_2O10mL를 결합하여 이 용액을 60°C 오븐에 1시간 동안 넣습니다. 용액이 용해되도록 10분마다 부드럽게 소용돌이치기. 사용하기 전에 0.22 μm 주사기 필터를 통해 이 솔루션을 필터링합니다.
7. TCH에서 인큐베이팅하기 전에 실온 ddH₂O 5x로 티슈를 3분(총 15분)씩 세척합니다.
8. 차분을 여과된 TCH 용액에 실온(그림1A-C)에서총 20분간 배치한다.
9. TCH에서 배양후, 실온 ddH₂O에서 각 (총 15분)에 대해 조직 5배(총 15분)를 세척한다.
10. 실온에서 30분 동안 2% 오스뮴 테트산화물(칼륨 페로시니데로 감소되지 않음)를 함유한 조직을 ddH₂O에 배치합니다. 이것은 연기 후드와 어둠 속에서 osmium을 빛으로 줄일 수 있습니다 (예를 들어, 알루미늄 호일 아래)(그림 1D-F)에서수행해야합니다.
11. 오스뮴 테트산화물 인큐베이션에 이어, 실온 ddH_2O에서각 3분(총 15분)에 5배씩 세척한다.
12. 4°C의 냉장고에 1% 수성 우라일 아세테이트(ddH_2O로혼합된 우라일 아세테이트 파우더)에 티슈를 배치합니다.
13. 냉장고에서 티슈를 제거하기 직전에 신선한 월튼의 납 인산 용액을 준비하십시오. 0.03M 산용액(증류수 10mL의 0.04 g 인산산)의 10mL에서 납 질산0.066 g를 용해하고 pH를 1N KOH(증류수 10mL에서 0.5611g)로 조정한다.
    주의: pH를 조정할 때 침전제가 형성될 수 있습니다. 이것은 허용되지 않습니다.
    1. 교반바를 사용하여 pH를 모니터링하는 동안 1 N KOH 드롭와이즈를 천천히 추가합니다. 완성 된 클리어 리드 아스파트에 용액을 60 °C 오븐에서 30 분 동안 예열하십시오. 침전물 형태로 솔루션을 사용할 수 없으며 다른 솔루션을 준비해야 합니다.
14. 냉장고에서 티슈를 제거하고 실온 ddH₂O에서 각 (총 15 분)에 대해 5 배 (총 15 분)를 세척하십시오.
15. 세척 후, 60 °C에서 온도를 유지하면서 30 분 동안 따뜻하게 된 월튼의 납 인산 용액에 조직을 놓습니다.
16. 월튼의 납 아파르트에 인큐베이션 후, 실온 ddH₂O(그림 1G-I)에서각 3 분 (총 15 분)에 대해 조직5x를세척하십시오.
17. 얼음 차가운 아세톤 시리즈(30%, 50%, 70%, 95%, 95%, 100%, 100%, 100%, 아세톤100% 아세톤)를 통해 조직을 탈수하여 시리즈의 각 단계에 대해 10분 동안 허용합니다.
18. 얼음 차가운 탈수 계열에 따라 티슈를 실온 아세톤에 10분간 배치합니다.
    1. 이 기간 동안 812 ACM 수지를 공식화합니다. 빔 손상에 더 저항하기 때문에 "하드 믹스"레시피를 사용합니다. 수지를 철저히 섞고, 조직을 포함 812:아세톤(1:3 믹스)에 4시간 동안 넣고 8시간 동안 812:아세톤(1:1 믹스)을 포함하고, 마침내 하룻밤 사이에 812:아세톤(3:1 믹스)을 포함시한다. 실온에서 이러한 수지 침투 단계를 수행합니다.
19. 다음 날, 4-8 시간 동안 100 % 포함 812에 조직을 배치 한 다음 신선한 100 % 포함 812 하룻밤, 마지막으로 신선한에 812 4 시간 동안 포함. 실온에서 이러한 수지 침투 단계를 수행합니다.
    1. 포함 직전에 소량의 수지를 혼합 용기에 넣고 수지가 분말로 포화 될 때까지 카본 블랙 파우더에 천천히 혼합 (나무 막대기를 교반하는 데 사용할 수 있음)을 천천히 혼합하지만 여전히 유체이며 거칠지 않습니다. 그것은 두꺼운 잉크를 닮은 눈에 보이는 덩어리없이 나무 막대기에서 천천히 물방울 수 있어야합니다.
20. 실리콘 고무 금형에 조직 샘플을 방향을 지정하고 수지 블록 내의 샘플 방향이 기록되고 참조할 수 있도록 사진을 찍습니다. 실리콘 몰드 의 끝에 탄소 검은 색 포화 수지에서 샘플을 덮고 65 °C에서 ~ 1 시간 동안 오븐에 금형을 놓습니다.
    1. 금형을 조직 샘플을 덮는 금형 끝에 수지를 포함하는 경사에 금형을 놓습니다. 수지의 반대쪽 끝에 금형에 실험/조직 샘플 식별자를 가진 라벨을 놓습니다(도2A).
21. 오븐에서 실리콘 금형을 제거하고 라벨이 보이는 상태로 유지되도록 투명 수지 (카본 블랙 없음)로 금형의 나머지 부분을 채웁니다. 투명 수지와 쉽게 섞이지 않을 정도로 카본 블랙이 주입된 수지를 치료합니다.
    1. 조직을 포함하지 않는 금형 내에서 추가 우물을 준비하십시오. 여분의 우물로 시작하여 금형의 나머지 부분을 투명 수지로 채웁니다.
    2. 탄소 블랙 주입 된 수지는 투명 수지로 출혈하기 시작하면 실리콘 몰드를 추가 시간 (예 : 15 분)에 오븐에 다시 넣습니다.
    3. 모든 조직 샘플이 투명한 수지로 토핑되면 실리콘 몰드을 65°C에서 65°C로 다시 오븐에 넣고 경화 공정을 완료합니다.

2. 블록 준비

참고: 메서드는 샘플이 블록의 방향과 단면이 어떻게 수행되는지에 따라 달라집니다. 그러나, 가장 일반적인 조직 배향은 수지 블록의 끝에 중심을 두는 조직을 발견하며, 수지 블록의 긴 끝에 수직으로 수직이다.

1. 대부분의 경우, 먼저 블록의 끝을 트림하여 척에서 약 5-6mm를 고집하는 테이퍼 엔드와 함께 미세토메 척에 표본 블록을 배치하여 조직을 찾습니다. 세트 나사로 제자리에 고정하고 열 램프 아래에 놓습니다.
2. 몇 분 후 블록은 가단하고 손질하기 쉽습니다. 척을 스테레오현미경 홀더에 놓고 새로운 양면 면도날을 사용하여 조직이 보일 때까지 블록 페이스와 평행하게 얇은 섹션을 만듭니다. 이것은 블록 얼굴을 가로 질러 빛을 앵글링에 의해 가장 잘 볼 수 있으며, 조직 샘플은 조직이없는 수지의 그 부분에 비해 반사가 적고 세립적 일 것입니다. 조직이 어디에 있는지를 생각하려면 탄소 흑색 포화 수지의 도입 전에 조직 샘플촬영 사진을 참조하십시오.
3. 트리밍 을 위해 시편 핀 홀더 1 개를 따로 둡니다. 이 핀 홀더는 SEM 챔버에 배치되지 않으므로 장갑없이 처리 할 수 있으므로 트리밍 핀 홀더라고합니다. 이미징 챔버에 배치 될 운명 모든 표본 홀더는 장갑없이 만져서는 안됩니다. 이것은 현미경 챔버에 그리스와 기름을 소개하는 것을 피합니다.
4. 알루미늄 시편 핀을 트리밍 핀 홀더에 놓고 핀 홀더 위에 3-4mm 를 고정한 핀의 면(평평한 표면)으로 세트 나사를 약간 조입니다.
5. 핀 의 얼굴에 여러 가지 깊은, 십자가 스크래치를 확인하여 장소에 표본을 유지하는 데 사용되는 접착제에 대한 더 큰 표면적을 제공합니다. 알루미늄 핀을 사용하는 경우 이 단계에서는 소형 강철 플랫헤드 스크루드라이버를 권장합니다(그림2B).
6. 수지가 부드럽고 가단이 될 때까지 조직 샘플을 다시 열 램프 아래에 놓고 스테레오 현미경 아래 척 리셉터클에 놓습니다.
7. 양날 면도날을 사용하여 조직 샘플을 포함하는 수지 블록의 부분에서 과도한 수지를 다듬습니다. 궁극적으로 핀에 부착 된 티슈 블록의 크기는 직경약 3mm와 높이 2-3mm입니다.
   1. 면도기를 약 1-2mm 정도의 수지 블록으로 조심스럽게 밀어 넣은 다음 면도기를 이전 절단과 동일한 깊이로 수지 블록에 수평으로 밀어 넣습니다. 조직 샘플을 포함하는 블록의 일부를 손상시키거나 잘라 낼 수 있으므로 천천히 세심한 주의를 기울여 이 작업을 수행하십시오. 두 컷이 만날 때, 초과 수지는 블록에서 분리됩니다. 3mm x 3mm 제기 영역이 남아있을 때까지 수지 제거를 계속합니다.
8. 이 초기 트리밍 후 블록(여전히 척)을 몇 분 동안 열램프 아래에 놓습니다.
9. 수지가 부드럽고 가단성이 되면 블록을 스테레오 현미경 아래에 다시 놓습니다. 새로운 더블 엣지 면도날을 사용하여 수지 블록의 상단을 잘라, 약 1mm 트림 부분 아래, 하나의 부드러운 절단. 평평한 표면은 시편 핀에 접착되기 때문에 바람직하다. 이 단계에서는 블록의 제거된 부분으로 옮겨 서 날아가버릴 수 있는 힘이 필요하기 때문에 샘플이 손실되는 것을 허용하지 않도록 주의하십시오. 잘라낸 샘플을 따로 놓습니다.
10. 스테레오현미경 리셉터클에 절단 알루미늄 핀이 들어 있는 트리밍 핀 홀더를 배치합니다. 눈에 보이는 반월 상 연골을 형성하지 않고 완전히 핀을 덮을 수 있도록 핀 면에 시아노아크라일트 접착제의 얇은 층을 적용합니다. 집게로 티슈 블록의 손질된 조각을 집어 들고 핀 얼굴에 놓습니다. 시편 핀에 조직 샘플을 중심으로 합니다. 그것을 아래로 밀어 몇 초 동안 누군다. 접착제를 몇 분 동안 설정하도록 허용합니다.
11. 접착제가 완전히 건조하면 트리밍 핀 홀더를 스테레오 현미경 아래에 다시 놓습니다. 미세 파일을 사용하여 수지가 핀을 돌출하지 않도록 과도한 수지를 파일로 제출합니다. 수지 모양은 원형 핀 헤드와 유사해야 합니다.
12. 수지 블록의 제기 부분에 조직을 찾아, 경사 조명이 유용하다. 이중 면도기를 사용하여, 조직 샘플을 포함하는 수지의 제기 부분은 1mm²이하의 영역으로 손질되어야 한다. 가능하면 블록 페이스를 더 작게 다듬을 수 있으며 다이아몬드 나이프의 스트레스를 줄이고 장수를 향상시킵니다.
    1. 가능한 한 많은 초과 수지를 제거하여 블록을 한 차원으로 약간 더 길게 둡깁니다. 이것은 너무 많은 힘이 적용되는 경우에 떨어져 탈옥하는 조직 견본을 포함하는 수지에 대 한 가능 하기 때문에 천천히 하 고 주의 하 게 수행 됩니다. 면도기는 권장되지만 이 단계에는 미세 금속 파일을 사용할 수 있습니다.
13. 미세 금속 파일 각도로 과잉 수지를 사용하여, 조직 샘플을 포함하는 제기 된 부분 외부 의 영역에서, 핀의 가장자리를 향해 아래로(도 2C).
14. 실버 페인트를 바르고 금 스퍼터링을 적용하기 전에 준비된 시료에서 수지 입자와 먼지를 제거합니다. 은을 아세톤과 혼합하여 쉽게 퍼질 수 있는 액체로, 매니큐어(너무 얇지 않아 어플리케이터에서 떨어지지 않음)를 전체 샘플 블록 표면에 가늘게 발라줍니다. 아세톤은 빠르게 증발하므로 실버 페인트가 두꺼워지기 시작하면 아세톤을 추가해야 할 수도 있습니다.
    1. 은페인트가 현미경으로 적재하기 전에 밤새 건조되도록 합니다.
       참고: 이 실버 레이어는 블록 페이스를 1mm x 1mm 이상으로 확장하지 않도록 얇아야 하며, 실버 페인트가 다이아몬드 나이프를 손상시키지 는 않았지만 다이아몬드 나이프의 수명을 보존하는 것이 좋습니다. 은과 혼합 된 아세톤은 이미징 챔버에 아세톤 증기를 도입하지 않도록 금 스퍼터링 또는 현미경으로 샘플을로드하기 전에 완전히 증발해야합니다.
    2. 실버 페인트를 적용한 후 샘플 블록에 얇은 금층을 적용합니다. 표준 금 호일 대상을 갖춘 표준 진공 스퍼터링 장치를 사용하여 200 밀리토리(아르곤 가스)의 챔버 압력과 2분 동안 40밀리암페어를 달리면 20nm 두께의 금 코팅이 발생합니다.
15. 코팅 후 적절한 실험 라벨이 부착된 튜브에 장착 및 트리밍 블록을 배치합니다. 일회용 전송 파이펫을 사용하여 사용자 지정 튜브를 만듭니다.
    1. 전구 바로 아래에 전달 파이펫을 잘라 구근 끝 아래에 부착된 이송 파이펫 튜브의 짧은 부분을 남깁니다. 잘라낸 관 부분을 단축하고 파이펫 팁을 충분히 잘라 알루미늄 시편 핀을 안쪽으로 밀수 있게 합니다.
    2. 알루미늄 시편 핀을 포함하는 끝을 변형된 이송 파이펫의 구근 끝 내에 놓습니다.
16. 준비된 티슈 블록을 적재하기 전에 블록 면 표면에서 과도한 실버 페인트를 조심스럽게 다듬습니다.

3. 블록 페이스 이미징을 위한 SEM 설정

참고: 다음 이미징 설정은 제공된 자료 표에 나열된 작성자가 사용하는 장치에서 생성되었습니다. 이 장치는 가변 압력 이미징을 할 수 있지만, 최상의 결과는 높은 진공 상태에서 캡처되었습니다.

1. 거주 시간: 직렬 단면 중에 12 μs/px를 사용합니다. 관심 영역이 확인되면 32 μs/px에서 더 높은 해상도의 이미지를 얻을 수 있습니다.
2. 진공 설정: 9e-008 Pa의 총 압력, 1.1e-004 Pa의 기둥 압력, 9.5e-002 Pa의 챔버 압력을 사용합니다.
3. 캡처 시간: 위의 설정을 사용하면 이미지당 50초의 속도로 2048x2048 px 이미지 스택을 캡처합니다. 관심 지역의 고해상도 이미지는 이미지당 9분 이내에 4096x4096 px로 캡처할 수 있습니다.
4. 단면 두께: 100-200 nm를 사용합니다. 적은 수 있지만, 낮은 빔 전압, 강도 또는 거주 시간이 필요할 수 있습니다.
5. 고전압(HV): 7-12 kV를 사용합니다. 전압을 늘리면 스팟 크기가 줄어들고 해상도가 증가하지만 빔 손상 가능성이 높아집니다. kV가 높을수록 빔 침투가 증가하여 세부 정보가 손실됩니다. 그러나 kV를 낮추면 신호대 잡음비(도3)^14가저하된다.
6. 빔 강도(BI): 저자의 SBF-SEM 장치는 1-20에 이르는 빔 강도 척도를 제공합니다. 이 규모에서 5-7의 값은 과도한 충전 및 빔 손상없이 고품질의 이미지를 제공합니다. 그러나 BI가 높을수록 해상도가 클수록 충전 및 빔^{손상(14)이}더 많아진다.
7. 스팟 크기 및 이미지 확대: 빔 강도 및 전압 레벨별로 스팟 크기를 결정합니다. 이상적으로, 스팟 크기는 사용되는 픽셀 크기보다 크지 않아야합니다. 픽셀 크기는 뷰 필드(FOV)를 픽셀 수로 나누어 결정됩니다. 예를 들어 이미지 크기가 2048x2048 px인 25 μm FOV는 픽셀당 12.2nm를 제공합니다. 따라서 스팟 크기는 12.2 nm보다 크지 않아야 합니다. 그림 4는 HV, BI 및 스팟 크기와 어떻게 관련되어 있는지 를 보여줍니다.
8. 작업 거리(WD) - 블록 페이스 이미징을 사용하면 작업 거리를 조정할 수 없습니다. 그것은 단순히 초점의 요인입니다. 이미지된 모든 블록에 대해 거의 동일합니다. 작업 거리를 조정할 수는 없지만 캡처된 이미지의 해상도에 중요한 역할을 합니다. 작업 거리가 감소하면 캡처된 이미지에 대한 해상도 제한이 증가합니다. 어떤 경우에는 이미징 챔버 내에서 수정하여 작업 거리를 줄일 수 있지만 이러한 수정은 사용자의 재량에 따라 이루어져야합니다. 작업 거리를 줄이고 이미지 해상도를 높이기 위해 도어 마운트 마이크로토메 나사를 느슨하게 하고 미세토메를 재배치하여 나사를 다시 조인한 후 빔 검출기에 2mm 가까이 휴식을 취했습니다.
9. 해상도 - 위의 설정을 사용하여 3.8 nm의 높은 x 및 y 해상도가 가능합니다. 해상도는 빔 스팟 크기와 이미지 캡처의 픽셀 해상도에 의해 제한된다는 점에 유의하는 것이 중요합니다(예: 2048x2048 픽셀 이미지에서 캡처된 20 μm 시야는 3.8nm 스팟 크기가 사용되더라도 9.8nm의 픽셀 해상도를 갖는다). z-평면의 이미지 해상도는 단면 두께에 따라 달라지며, 100-200 nm가 이 프로토콜과 잘 어울린다는 것을 알 수 있습니다.

결과

마우스 각막
이 프로토콜은 마우스 각막에 광범위하게 적용되었습니다. SBF-SEM 이미징을 사용하여 엘라스틴이 없는 마이크로피브릴 번들(EFMBs)의 네트워크를 사용하여 성인용 마우스 각막 내에 존재하는 것으로 나타났다. 이전에는 이 네트워크가 배아와 조기 산후 발달 중에만 존재한다고 믿었습니다. SBF-SEM은 각막 전체에 걸쳐 광범위한 EFMB 네트워크를 공개했으며, 개별 섬유는 단?...

토론

이 방법 논문의 목적은 우리의 실험실이 안정적으로 고해상도 직렬 전자 현미경 이미지를 캡처 할 수 있도록 조직 준비 및 이미징 방법론을 강조하고, SBF-SEM 이미징을 수행 할 때 발생할 수있는 잠재적 인 함정뿐만 아니라이 결과로 이어지는 중요한 단계를 지적하는 것입니다. 이 프로토콜을 사용하여 성공하려면 조직의 적절한 고정, 시료에 중금속의 함침, 충전을 줄이기 위한 포함 수지수정, 이?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1/16 x 3/8 Aluminum Rivets	Industrial Rivet & Fastener Co.	6N37RFLAP/1100	Used as specimen pins.
2.5mm Flathead Screwdriver	Wiha Quality Tools	27225
Acetone	Electron Microscopy Sciences	RT 10000	Used to dilute silver paint.
Aspartic Acid	Sigma-Aldrich	A8949
Calcium Chloride	FisherScientific	C79-500
Conductive Silver Paint	Ted Pella	16062
Denton Desk-II Vacuum Sputtering Device equipped with standard gold foil target	Denton Vacuum	N/A	This is the gold-sputtering device used by the authors, alternates are acceptable.
Double-edged Razors	Fisher Scientific	50-949-411
Embed 812	Electron Microscopy Sciences	14120
Gatan 3View2 mounted in a Tescan Mira3 Field emission SEM	Gatan & Tescan	N/A	This is the SBF-SEM device used by the authors, alternates are acceptable.
Glass Shell Vials, 0.5 DRAM (1.8 ml)	Electron Microscopy Sciences	72630-05
Gluteraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16320
Gorilla Super Glue - Impact Tough	NA	NA	Refered to as cyanoacrylate glue in text.
Ketjen Black	HM Royal	EC-600JD	Refered to as carbon black in text.
KOH	FisherScientific	18-605-593
Lead Nitrate	Fisher Scientific	L62-100
Microwave	Pelco	BioWave Pro	This is the microwave used by the authors, alternates are acceptable.
Osmium Tetroxide	Sigma-Aldrich	201030
Potassium Ferrocyanide	Sigma-Aldrich	P9387
Silicone Embedding Mold	Ted Pella	10504
Sodium Cacodylate Trihydrate	Electron Microscopy Sciences	12300
Samco Transfer Pipette	ThermoFisher Scientific	202	Used to make specimen pin storage tubes.
Swiss Pattern Needle Files	Electron Microscopy Sciences	62115
Thiocarbohydrazide	Sigma-Aldrich	223220
Uranyl Acetate	Polysciences, Inc.	21447-25
Reconstruction Software
Amira Software	Thermo Scientific	N/A	Used to create the reconstructions found in figures 5-7 and 9.
Fiji (Fiji is Just ImageJ)	ImageJ.net	N/A	TrakEM2 can be added to Fiji to asist in manual segmentation.
Microscopy Image Browser (MIB)	University of Helsinki, Institute of Biotechnology	N/A
Reconstuct Software	Neural Systems Lab	N/A
SuRVoS Workbench	Diamond Light Source & The University of Nottingham	N/A
SyGlass	IstoVisio, Inc.	N/A	Allows for reconstruction in virtual reality and histogram-based reconstruction methods.