生物组织样本的串行块面扫描电子显微镜 （SBF-SEM）

摘要

该协议概述了使用串行块面扫描电子显微镜 （SBF-SEM） 的常规方法，这是一种强大的 3D 成像技术。SBF-SEM 的成功应用取决于适当的固定和组织染色技术，以及仔细考虑成像设置。本协议包含整个过程的实际考虑。

摘要

串行块面扫描电子显微镜 （SBF-SEM） 可收集数百到数千张连续注册的超结构图像，为组织显微解剖提供前所未有的三维视图。虽然 SBF-SEM 近年来的使用呈指数级增长，但适当的组织制备和成像参数等技术方面对于这种成像模式的成功至关重要。此成像系统受益于设备的自动化性质，允许显微镜在成像过程中无人看管，并在一天内自动收集数百张图像。然而，如果没有适当的组织制备，细胞超结构可能会被改变，以得出不正确或误导性的结论。此外，图像是通过扫描树脂嵌入生物样本的块面生成的，这通常会带来必须解决的挑战和考虑。成像过程中块内电子的积累，称为"组织充电"，可导致对比度损失和无法欣赏细胞结构。此外，虽然增加电子束强度/电压或降低光束扫描速度可以增加图像分辨率，但这也可能产生破坏树脂块和扭曲成像系列中后续图像的不幸副作用。在这里，我们提出了一个常规协议，准备生物组织样本，以保持细胞超结构和减少组织充电。我们还为快速获取高质量的序列图像提供成像考虑，对组织块的损害最小。

引言

1981年，莱顿首次描述了串行块面扫描电子显微镜（SBF-SEM），他设计了一个扫描电子显微镜，该显微镜由内置的显微原子增强，可以切割和成像嵌入树脂中的组织薄部分。不幸的是，技术限制限制其使用导电样品，因为非导电样品，如生物组织积累不可接受的充电水平（电子积累在组织样本^）1。虽然用蒸发的碳减少组织充电在切割之间涂上块面，但这大大增加了成像采集时间和图像存储仍然是一个问题，因为当时的计算机技术不足以管理设备创建的大文件大小。2004年，登克和霍斯特曼使用装有可变压力室²的SBF-SEM重新审视了这一方法。这允许将水蒸气引入成像室，从而减少样品内部的充电，使非导电样品的成像可行，尽管图像分辨率会丢失。组织制备和成像方法的进一步改进现在允许使用高真空成像，SBF-SEM成像不再依赖水蒸气来消散充电^{3，4，5，6，7，8，9。}虽然 SBF-SEM 近年来的使用呈指数级增长，但适当的组织制备和成像参数等技术方面对于这种成像模式的成功至关重要。

SBF-SEM 允许自动收集数千个串行注册的电子显微镜图像，平面分辨率小至 3-5 nm^10，11。组织，浸渍重金属和嵌入树脂，被放置在扫描电子显微镜（SEM）内，其中含有装有钻石刀的超微观。平坦的表面用钻石刀切割，刀被收回，块的表面被扫描在一个带电子束的刺刀图案中，以创建组织超结构的图像。然后，该块在 z 轴中提升指定量（例如 100 nm），称为"z 步"，在重复过程之前切割新表面。这样，当组织被切断时，会产生一个三维（3D）图像块。此成像系统进一步受益于设备的自动化性质，使显微镜在成像过程中无人看管，一天内可以自动收集数百张图像。

虽然SBF-SEM成像主要使用背散射电子形成块面图像，但二次电子是在成像过程中产生的^。次要电子可以积累，与背散射和原光束电子一起，无法逃离方块，并产生"组织充电"，这可能导致块面的局部静电场。这种电子积累可以扭曲图像或导致电子从方块中弹出，并有助于后散射探测器收集的信号，降低信号与噪声的比例^13。虽然通过降低电子束电压或强度或减少光束停留时间可以降低组织充电水平，但这会导致信号与噪声比^{减少 14}。当使用低电压或强度的电子束，或者光束只允许在每个像素空间内停留较短的时间时，从组织中弹出的背散电子较少，并被电子探测器捕获，导致信号较弱。Denk 和 Horstmann 通过将水蒸气引入室内来解决这个问题，从而以图像分辨率为代价降低了房间和块面的电荷。由于腔室压力为10-100 Pa，电子束的一部分是分散的，导致图像噪声和分辨率的丧失，然而，这也产生离子在标本室中和电荷在样品块^2。在成像过程中，样品块内的中和电荷使用焦气喷射到块面上，或将负电压引入SBF-SEM阶段，以降低探针束拉升能量，增加收集^{的信号6、7、15。}与其引入阶段偏置、腔室压力或局部氮注入来减少块表面的电荷积聚，还可以通过将碳引入树脂混合物来增加树脂的导电性，从而允许更积极的成像设置^16。以下一般协议是2010年发布的Deerinck等人协议的改编，涵盖了对组织制备和成像方法的修改，我们发现在保持高分辨率图像采集^{3、17、18、19}的同时，最大限度地减少组织充电是有用的。虽然前面提到的协议侧重于组织处理和重金属浸渍，但该协议提供了对 SBF-SEM 研究固有的成像、数据分析和重建工作流程的洞察。在我们的实验室中，此协议已成功并可重复应用于各种组织，包括角膜和前段结构， 眼睑，胆小和硬质腺，视网膜和视神经，心脏，肺和气道，肾脏，肝脏，肌骨质，和大脑皮层/梅杜拉，并在各种物种，包括老鼠，大鼠，兔子，豚鼠，鱼，单层和分层细胞培养，猪，非人类灵长类动物，以及人类20，21，22，23。虽然对于特定的组织和应用来说，小的变化可能是值得的，但事实证明，在我们核心成像设施的背景下，此通用协议具有高度可复制性和有用性。

研究方案

所有动物均按照视觉和眼科研究协会《视觉和眼科研究声明》和休斯顿大学光学学院动物处理指南中描述的指南处理。所有动物程序均由处理机构批准:鼠、鼠、兔、豚鼠和非人类灵长类动物程序均由休斯顿大学动物护理和使用委员会批准，斑马鱼程序由德保大学动物护理和使用委员会批准，猪程序由贝勒医学院动物护理和使用委员会批准。所有人体组织均按照《赫尔辛基关于人体组织研究的宣言》处理，并获得了适当的机构审查委员会批准。

1. 组织处理

1. 通过在ddH₂O中混合可可酸钠粉，准备0.4 M可可酸钠缓冲液的库存溶液。 彻底混合缓冲区，并将溶液调整到7.3。此缓冲区用于制造固定性（下面第 1.3 步中描述的成分）、洗涤缓冲以及渗透和铁氰化钾溶液。
   注意:灌注固定通常是 SBF-SEM 研究的最佳固定方法，因为固定会迅速和在整个身体发生。如果在学习设计中无法进行灌注固定，请跳到步骤 1.3。
2. 对动物模型^24、25、26进行适当的生理压力的灌注固定。这是通过心肌连续灌注与肝盐水，然后固定，每个放置在一个特定的高度（例如，100厘米）以上的生物体（适合在动物模型的血管系统的生理压力），固定性流入左心室，并退出在右中庭的切口。兴趣组织将变得苍白，因为血液被固定性取代，如果你的组织的所有或部分不漂白，那么组织可能无法适当固定，超结构可能无法保存。
3. 使用剃须刀刀片或锋利的手术刀将组织样本修剪成不超过 2 mm x 2 mm x 2 mm 的方块。如果跳过步骤 1.2，则快速这样做，以便组织能够尽快固定。
   1. 或者，在固定下解剖组织，并转移到新鲜固定物，以完成浸入过程。固定剂的最终成分包括0.1M可可酸钠缓冲液，其中含有2.5%的谷氨酸和2m氯化钙。允许在室温下进行至少 2 小时，最多在 4 °C 下过夜。 如果可能，使用摇动器/倾斜板在固定时轻轻搅拌样品。
   2. 或者，如果有逆变微波炉，在真空下将组织固定在真空下 150 瓦，4 个周期 1 分钟开，1 分钟休息。微波固定是第1.3步的首选方法，因为它可以快速修复组织并保存组织超结构^27。
      注意:在本协议期间，不应允许组织干燥，应注意将组织快速从一个溶液转移到下一个解决方案。
4. 在室温下，在含有2mM氯化钙的0.1 M可可酸钠缓冲器中，将固定组织洗5次，每次3分钟（共15分钟）。
5. 使以下硫酸钠溶液新鲜，最好在以前的洗涤步骤。将 4% 的二氧化硫钠溶液（在 ddH₂O 中制备）与 0.2 M 可可酸酸钾缓冲液中等量的 3% 铁酸钾与 4 m 氯化钙混合。在上一步洗涤后，将组织放在此溶液中 1 小时，在黑暗中的冰上和烟罩中放置。
   注:二氧化钠是一种黄色晶体物质，在安培中。要创建二氧化硅溶液，打开安培，加入ddH₂O，并在黑暗中声波3-4小时，直到晶体完全溶解。氧化钠溶液是一种透明黄色溶液，如果溶液为黑色，则渗透量已减少，不应再使用。
6. 当组织在铁氰化钠溶液中孵化时，开始准备硫化氢化物 （TCH） 溶液。新鲜准备此解决方案，并在 1 小时铁氰化钠固定期结束时随时可用。将 0.1 克硫化氢化物与 10 毫升 ddH₂O 混合，并将此溶液放入 60 °C 烤箱中 1 小时。为确保溶解溶解，每 10 分钟轻轻旋转一次。在使用之前，通过 0.22μm 注射器过滤器过滤此解决方案。
7. 在TCH孵育之前，用室温ddH₂O 5x清洗组织，每次3分钟（共15分钟）。
8. 在室温下将组织置于过滤的TCH溶液中共20分钟（图1A-C）。
9. 在TCH中孵化后，在室温下每洗5次（共15分钟_）3分钟。
10. 在室温下将含有2%二氧化钠（不含二氧化硅钾的渗透物）放在ddH₂O中放置30分钟。这应该在烟罩和黑暗中完成，因为渗透可以通过光（例如，在铝箔下）（图1D-F）减少。
11. 在二氧化钠孵育后，在室温下将组织洗5次，每次3分钟（共15分钟_{）ddH 2}O。
12. 将组织置于1%的醋酸尿素（尿乙酸酯粉末混合在ddH₂O）过夜，在冰箱中4°C。
13. 就在从冰箱中取出组织之前，准备新鲜的沃尔顿铅分离溶液。首先在 10 mL 的 0.03 M 阿斯粒子酸溶液（蒸馏水中 0.04 g 阿斯巴酸）中溶解 0.066 克硝酸铅，并将 pH 调整为 5.5，采用 1 N KOH（蒸馏水中 0.5611 克，蒸馏水 10mL）。
    注意:调整pH时会形成沉淀物。这是不能接受的。
    1. 使用搅拌棒，在监控pH时缓慢地添加1 N KOH滴水。在 60 °C 烤箱中预热完成的透明铅分开溶液 30 分钟。如果沉淀形成解决方案，则无法使用解决方案，并且必须准备另一个解决方案。
14. 从冰箱中取出组织，在室温下每洗 3 分钟（共 15 分钟_{）ddH 2}O。
15. 洗涤后，将组织放在加热的沃尔顿铅分方溶液中30分钟，同时将温度保持在60°C。
16. 在沃尔顿的铅分立中孵育后，在室温下每洗组织 5 次 3 分钟（共 15 分钟_{）ddH 2}O （图 1G-I）。
17. 通过冰冷的乙酮系列（30%，50%，70%，95%，95%，100%，100%，100%和100%的乙酮（在ddH₂O，如果适用）去水，允许10分钟的每个步骤系列。
18. 在冰冷脱水系列之后，将组织置于室温乙酮中10分钟。
    1. 在此期间，制定嵌入812 ACM树脂。使用"硬混合"配方，因为它更耐光束损坏。将树脂彻底混合，将组织放入嵌入 812:acetone （1:3 混合） 4 小时，然后嵌入 812:acetone （1:1 混合）8 小时或过夜，最后嵌入 812:acetone （3:1 混合） 过夜。在室温下执行这些树脂渗透步骤。
19. 第二天，将组织放入100%嵌入8124-8小时，然后在新鲜100%嵌入812过夜，最后进入新鲜100%嵌入8124小时。在室温下执行这些树脂渗透步骤。
    1. 在嵌入之前，将少量树脂放入混合容器中，然后慢慢混合（木棍可用于搅拌）碳黑粉末，直到树脂与粉末饱和，但仍是液体，不会变粒状。它应该像厚厚的墨水，能够慢慢从木棍上滴下来，没有可见的团块。
20. 将组织样品定位于硅橡胶模具中，并拍照，以便记录树脂块内的样品方向，并可参考。将样品盖在硅胶模具尖端的炭黑饱和树脂中，并将模具放入烤箱中，在 65 °C 下放置 1 小时。
    1. 将模具放在斜坡上，以包含覆盖组织样本的模具尖端的树脂。在树脂的另一端的模具上放置一个带有实验/组织样本标识符的标签（图2A）。
21. 从烤箱中取出硅胶模具，用透明树脂（无碳黑）填充模具的剩余部分，确保标签保持可见。用碳黑处理注入的树脂，使之不易与透明树脂混合。
    1. 在不包含组织的模具中准备额外的井。从额外的油井开始，用透明树脂填充模具的剩余部分。
    2. 如果注入的碳黑树脂开始向透明树脂中出血，请将硅胶模具放回烤箱中多长时间（例如，15 分钟）。
    3. 一旦所有的组织样本都加了透明树脂，将硅胶模具放回烤箱（平，无倾斜），在65°C下48小时完成固化过程。

2. 块准备

注:该方法将取决于样本在块中的定位方式以及如何进行分区。然而，最常见的组织方向发现组织集中在树脂块的尖端，垂直于树脂块的长端。

1. 在大多数情况下，首先修剪块的末端，通过将标本块放在微托姆夹头中，锥形末端从夹头中伸出约 5-6 毫米来定位组织。用螺丝将其锁定到位，并将其置于热灯下。
2. 几分钟后，该块将是可塑的，易于修剪。将夹头放在立体显微镜支架中，使用新的双刃剃须刀刀片使细块与块面平行，直到组织可见为止。这最好通过在块面上旋转光来观察，与没有组织的树脂部分相比，组织样本的反射和粒度会降低。在引入炭黑饱和树脂之前，请查阅组织样本的照片，了解组织的位置和位置。
3. 将一个标本销支架放在一边进行修剪。此销架永远不会放入 SEM 腔室，因此无需手套即可处理，这称为修剪销支架。 任何准备放入成像室的标本持有人，都不得在没有手套的情况下被触摸。这避免了将油脂和油引入显微镜室。
4. 将铝制标本销放在修剪销架中，并稍微拧紧固定的螺钉，将销的面（平面）固定在销架上方 3-4mm。
5. 在针脚表面制作几个深而纵横交错的划痕，为用于固定标本的胶水提供更大的表面积。如果使用铝针，建议在此步骤中使用小型钢平头螺丝刀（图 2B）。
6. 将含有组织样品的夹头放回热灯下，直到树脂变软且可塑，然后放入立体显微镜下的夹头容器中。
7. 使用双刃剃须刀刀片从含有组织样本的树脂块部分修剪出多余的树脂。最终，固定在针脚上的组织块大小约为直径为 3 mm，高度约为 2-3 mm。
   1. 小心地将剃须刀直接推入大约 1-2 毫米的树脂块中，然后小心地将剃须刀水平推入树脂块，深度与之前的切割相同。这样做缓慢和非常小心，因为有可能损坏或切断包含组织样本的块的一部分。当两个切口相遇时，多余的树脂将与块分离。继续去除树脂，直到只剩下3毫米×3毫米的凸起面积。
8. 进行初始修剪后，将方块（仍放在夹头中）放在热灯下几分钟。
9. 一旦树脂变得柔软和可塑性，将方块放回立体显微镜下。使用新的双刃剃须刀刀片，切断树脂块的顶部，比修剪的部分低约1毫米，单次平滑切割。平坦的表面是可取的，因为这将粘在标本针。小心不要让样品丢失，因为这一步骤需要一些力，可以转移到块的去除部分，并导致它飞走。将切割和修剪的样品放在一边。
10. 将包含切割铝销的修剪销架放在立体显微镜插座中。将薄薄的氰丙烯酸胶层涂在针面上，使其完全覆盖销，而不会形成可见的半月板。用钳子拾起组织块的修剪部分，放在针面上。将组织样本放在标本销上。向下推并按住几秒钟。让胶水设置几分钟。
11. 当胶水完全干燥时，将修剪销支架放回立体显微镜下。使用精细的文件，文件远离多余的树脂，使没有树脂悬垂针。树脂形状应类似于圆形针头。
12. 将组织定位在树脂块的凸起部分，斜光对此很有用。使用双刃剃须刀，含有组织样本的树脂的凸起部分必须修剪到不超过1毫米²的区域。如果可能，块面可以修剪更小，这将减少钻石刀的压力，并改善其寿命。
    1. 尽可能多地去除多余的树脂，使方块在一个维度上稍长一些。这是缓慢和谨慎地完成的，因为如果施加过多的力，含有组织样本的树脂可能会分解。虽然建议使用剃须刀，但可用于此步骤的精细金属文件。
13. 用细金属文件角度多余的树脂，在包含组织样本的凸起部分外的区域，向针的边缘（图2C）。
14. 在涂上银漆，然后涂上金溅，从准备好的样品中取出树脂颗粒和灰尘。将银与酸酮混合，使其成为一种易于扩散的液体，类似于指甲油（但不会太薄，从施用器上滴下来），并将薄外套涂抹在整个样品块表面。Acetone 蒸发迅速，因此当银漆开始变厚时，可能需要添加额外的 Acetone。
    1. 让银漆在装进显微镜前干燥过夜。
       注意:此银层必须较薄，以避免将块面扩展到 1 mm x 1 mm 以上，虽然银漆从未损坏过钻石刀，但仍建议使用较小的块面来保持钻石刀的寿命。与银混合的王牌必须完全蒸发，然后才能将样品溅入显微镜，以避免将心电图蒸汽引入成像室。
    2. 应用银漆后，在样品块上涂上一层薄薄的金。使用配备标准金箔目标的标准真空溅射装置，200毫Torr（砷气）和40毫安的室压运行2分钟将导致20纳米厚的金涂层。
15. 涂层后，将安装和修剪的方块放在带有相应实验标签的管子中。使用一次性传输移液器创建自定义管。
    1. 切断灯泡正下方的转移移液管，将转移移液管的一小部分固定在球状末端以下。缩短被切断的管状部分，并切回足够的移液器尖端，以便铝标本销可以紧贴在它里面。
    2. 将包含铝标本销的末端放在改装转移移液器的球状末端。
16. 在加载准备好的组织块之前，小心地修剪块面表面多余的银漆。

3. 用于成像块面的 SEM 设置

注:以下成像设置是在作者使用的设备上生成的，该设备列在所提供的 材料表 中。虽然该设备能够进行可变压力成像，但最佳结果是在高真空下捕获的。

1. 居住时间: 在串行分区期间使用 12 μs/px。确定感兴趣的区域后，可以 32 μs/px 获得更高的分辨率图像。
2. 真空设置: 使用 9e-008 Pa 的枪压、1.1e-004 Pa 的柱压和 9.5e-002 Pa 的腔室压力。
3. 捕获时间: 通过上述设置，以每张图像 50 秒的速度捕获 2048x2048 px 图像堆栈。以每张图像不到 9 分钟的速度，可以 4096x4096 px 的速度拍摄感兴趣区域的高分辨率图像。
4. 部分厚度: 使用 100-200 纳米。可能更少，但可能需要较低的光束电压、强度或停留时间。
5. 高压（高压）:使用7-12千伏。虽然增加电压可降低点大小并增加分辨率，但它会引入更多发生光束损坏的可能性。较高的 kV 可增加光束穿透率，从而导致细节丢失。然而，降低kV会降低信号与噪音的比例（图3）14。
6. 光束强度 （BI）:作者的SBF-SEM设备提供1-20光束强度尺度。在这个尺度上，5-7值提供高质量的图像，而不会造成过多的充电和光束损坏。BI越高，分辨率越大，充电和光束损坏的可能性就越大^。
7. 斑点大小和图像放大: 根据光束强度和电压水平确定点大小。理想情况下，现货尺寸不应大于所使用的像素大小。像素大小通过将视场 （FOV） 除以像素数来确定。例如，图像大小为 2048x2048 px 的 25μm FOV 将为每像素提供 12.2 nm。因此，现货尺寸不应大于 12.2 nm。 图4 显示了HV、BI和斑点大小的相关性。
8. 工作距离 （WD） - 使用块面成像，工作距离不可调。这只是焦点的一个因素。对于所有映像的块，它将几乎完全相同。虽然工作距离不可调，但它在捕获的图像的分辨率中起着至关重要的作用。随着工作距离的缩短，捕获的图像的分辨率限制增加。在某些情况下，通过在成像室内进行修改，可以缩短工作距离，但这些修改必须由用户自行决定。为了缩短工作距离并提高图像分辨率，我们松开门架微原子螺丝，重新定位微原子，使其在重新拧紧螺丝后离光束探测器更近 2 毫米。
9. 分辨率 -使用上述设置，x&y分辨率高达3.8纳米是可能的。需要注意的是，分辨率受光束点大小以及图像捕获的像素分辨率的限制（例如，在 2048x2048 像素图像中捕获的 20μm 视场的像素分辨率为 9.8 nm，即使使用了 3.8 nm 的点大小）。z 平面中的图像分辨率取决于分割厚度，我们发现 100-200 nm 与此协议配合得很好。

结果

鼠标科内亚
此协议已广泛应用于小鼠角膜。使用 SBF-SEM 成像，显示成人小鼠角膜内存在无弹性蛋白微纤维束 （EFMB） 网络。以前认为，该网络仅在胚胎和产后早期发育期间存在。SBF-SEM 揭示了整个角膜中广泛的 EFMB 网络，在横截面测量时，发现单个纤维的直径为 100-200 nm。还发现，这个EFMB网络是组织在不同的层，纤维与角细胞紧密相连，甚至躺在角细胞表面的浅入侵（

讨论

本文的目的是突出组织制备和成像方法，使我们的实验室能够可靠地捕获高分辨率串行电子显微镜图像，并指出导致这一结果的关键步骤以及进行 SBF-SEM 成像时可能发生的潜在陷阱。使用此协议的成功需要正确固定组织、将重金属浸渍到样品中、修改嵌入树脂以减少充电，以及了解用于收集图像的显微镜和成像设置。格言，"质量在，质量出"是SBF-SEM成像的合适公理。由于 SBF-SEM 的目标通常是对超?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1/16 x 3/8 Aluminum Rivets	Industrial Rivet & Fastener Co.	6N37RFLAP/1100	Used as specimen pins.
2.5mm Flathead Screwdriver	Wiha Quality Tools	27225
Acetone	Electron Microscopy Sciences	RT 10000	Used to dilute silver paint.
Aspartic Acid	Sigma-Aldrich	A8949
Calcium Chloride	FisherScientific	C79-500
Conductive Silver Paint	Ted Pella	16062
Denton Desk-II Vacuum Sputtering Device equipped with standard gold foil target	Denton Vacuum	N/A	This is the gold-sputtering device used by the authors, alternates are acceptable.
Double-edged Razors	Fisher Scientific	50-949-411
Embed 812	Electron Microscopy Sciences	14120
Gatan 3View2 mounted in a Tescan Mira3 Field emission SEM	Gatan & Tescan	N/A	This is the SBF-SEM device used by the authors, alternates are acceptable.
Glass Shell Vials, 0.5 DRAM (1.8 ml)	Electron Microscopy Sciences	72630-05
Gluteraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16320
Gorilla Super Glue - Impact Tough	NA	NA	Refered to as cyanoacrylate glue in text.
Ketjen Black	HM Royal	EC-600JD	Refered to as carbon black in text.
KOH	FisherScientific	18-605-593
Lead Nitrate	Fisher Scientific	L62-100
Microwave	Pelco	BioWave Pro	This is the microwave used by the authors, alternates are acceptable.
Osmium Tetroxide	Sigma-Aldrich	201030
Potassium Ferrocyanide	Sigma-Aldrich	P9387
Silicone Embedding Mold	Ted Pella	10504
Sodium Cacodylate Trihydrate	Electron Microscopy Sciences	12300
Samco Transfer Pipette	ThermoFisher Scientific	202	Used to make specimen pin storage tubes.
Swiss Pattern Needle Files	Electron Microscopy Sciences	62115
Thiocarbohydrazide	Sigma-Aldrich	223220
Uranyl Acetate	Polysciences, Inc.	21447-25
Reconstruction Software
Amira Software	Thermo Scientific	N/A	Used to create the reconstructions found in figures 5-7 and 9.
Fiji (Fiji is Just ImageJ)	ImageJ.net	N/A	TrakEM2 can be added to Fiji to asist in manual segmentation.
Microscopy Image Browser (MIB)	University of Helsinki, Institute of Biotechnology	N/A
Reconstuct Software	Neural Systems Lab	N/A
SuRVoS Workbench	Diamond Light Source & The University of Nottingham	N/A
SyGlass	IstoVisio, Inc.	N/A	Allows for reconstruction in virtual reality and histogram-based reconstruction methods.