Serielle Block-Face-Rasterelektronenmikroskopie (SBF-REM) biologischer Gewebeproben

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine Routinemethode für die Verwendung der seriellen Blockflächen-Rasterelektronenmikroskopie (SBF-SEM), einer leistungsstarken 3D-Bildgebungstechnik. Die erfolgreiche Anwendung von SBF-SEM hängt von der richtigen Fixierung und Gewebefärbung sowie der sorgfältigen Berücksichtigung der Bildgebungseinstellungen ab. Dieses Protokoll enthält praktische Überlegungen für den gesamten Prozess.

Zusammenfassung

Die serielle Blockflächen-Rasterelektronenmikroskopie (SBF-SEM) ermöglicht die Erfassung von Hunderten bis Tausenden von seriell registrierten ultrastrukturellen Bildern und bietet eine beispiellose dreidimensionale Ansicht der Gewebemikroanatomie. Während SBF-SEM in den letzten Jahren einen exponentiellen Anstieg des Einsatzes verzeichnet hat, sind technische Aspekte wie die richtige Gewebevorbereitung und Bildgebungsparameter für den Erfolg dieser Bildgebungsmodalität von größter Bedeutung. Dieses Bildgebungssystem profitiert von der automatisierten Natur des Geräts, so dass man das Mikroskop während des Bildgebungsprozesses unbeaufsichtigt lassen kann, wobei die automatisierte Erfassung von Hunderten von Bildern an einem einzigen Tag möglich ist. Ohne entsprechende Gewebevorbereitung kann die zelluläre Ultrastruktur jedoch so verändert werden, dass falsche oder irreführende Rückschlüsse gezogen werden können. Darüber hinaus werden Bilder durch Scannen der Blockfläche einer in Harz eingebetteten biologischen Probe erzeugt, was oft Herausforderungen und Überlegungen mit sich bringt, die angegangen werden müssen. Die Ansammlung von Elektronen innerhalb des Blocks während der Bildgebung, bekannt als "Gewebeladung", kann zu einem Kontrastverlust und einer Unfähigkeit führen, die Zellstruktur zu schätzen. Während eine Erhöhung der Elektronenstrahlintensität / -spannung oder die Verringerung der Strahlabtastgeschwindigkeit die Bildauflösung erhöhen kann, kann dies auch den unglücklichen Nebeneffekt haben, den Harzblock zu beschädigen und nachfolgende Bilder in der Bildgebungsserie zu verzerren. Hier stellen wir ein Routineprotokoll für die Vorbereitung biologischer Gewebeproben vor, das die zelluläre Ultrastruktur bewahrt und die Gewebeladung verringert. Wir bieten auch bildgebende Überlegungen für die schnelle Aufnahme von qualitativ hochwertigen Serienbildern mit minimaler Schädigung des Gewebeblocks.

Einleitung

Die serielle Block-Face-Rasterelektronenmikroskopie (SBF-SEM) wurde erstmals 1981 von Leighton beschrieben, wo er ein Rasterelektronenmikroskop mit einem eingebauten Mikrotom entwickelte, das dünne Gewebeschnitte schneiden und abbilden konnte, die in Harz eingebettet waren. Leider beschränkten technische Einschränkungen die Verwendung auf leitfähige Proben, da nicht leitende Proben wie biologisches Gewebe inakzeptable Ladungsniveaus (Elektronenaufbau innerhalb der Gewebeprobe) ansammelten¹. Während die Blockfläche zwischen den Schnitten mit verdampfter kohlenstoffreduzierter Gewebeladung beschichtet wurde, blieb diese stark erhöhte Bildgebungsaufnahmezeit und Bildspeicherung ein Problem, da die Computertechnologie zu dieser Zeit nicht ausreichte, um die vom Gerät erzeugten großen Dateigrößen zu verwalten. Diese Methodik wurde 2004 von Denk und Horstmann mit einem SBF-SEM mit variabler Druckkammer²überarbeitet. Dies ermöglichte die Einführung von Wasserdampf in die Bildgebungskammer, was die Aufladung innerhalb der Probe reduziert und die Bildgebung von nichtleitenden Proben möglich macht, wenn auch mit einem Verlust der Bildauflösung. Weitere Verbesserungen in der Gewebevorbereitung und bildgebenden Verfahren ermöglichen nun die Bildgebung mit Hochvakuum, und die SBF-REM-Bildgebung ist nicht mehr auf Wasserdampf angewiesen, um die Ladung^3,4,5, 6^,7,8,9abzuleiten . Während SBF-SEM in den letzten Jahren einen exponentiellen Anstieg des Einsatzes verzeichnet hat, sind technische Aspekte wie die richtige Gewebevorbereitung und Bildgebungsparameter für den Erfolg dieser Bildgebungsmodalität von größter Bedeutung.

SBF-SEM ermöglicht die automatisierte Erfassung von Tausenden von seriell registrierten Elektronenmikroskopiebildern mit einer planaren Auflösung von nur 3-5 nm^10,11. Gewebe, das mit Schwermetallen imprägniert und in Harz eingebettet ist, wird in ein Rasterelektronenmikroskop (REM) gelegt, das ein ultramikrotom mit einem Diamantmesser enthält. Eine ebene Oberfläche wird mit dem Diamantmesser geschnitten, das Messer wird zurückgezogen und die Oberfläche des Blocks wird in einem Rastermuster mit einem Elektronenstrahl gescannt, um ein Bild der Gewebe-Ultrastruktur zu erstellen. Der Block wird dann um eine bestimmte Menge (z. B. 100 nm) in der z-Achse angehoben, die als "z-Schritt" bezeichnet wird, und eine neue Oberfläche wird geschnitten, bevor der Vorgang wiederholt wird. Auf diese Weise wird ein 3-dimensionaler (3D) Bildblock erzeugt, während das Gewebe weggeschnitten wird. Dieses Bildgebungssystem profitiert zusätzlich von der automatisierten Natur des Geräts, so dass das Mikroskop während des Bildgebungsprozesses unbeaufsichtigt gelassen werden kann, wobei die automatisierte Sammlung von Hunderten von Bildern an einem einzigen Tag möglich ist.

Während die SBF-REM-Bildgebung in erster Linie rückgestreute Elektronen verwendet, um ein Bild der Blockfläche zu bilden, werden während des Bildgebungsprozesses Sekundärelektronen erzeugt¹². Sekundärelektronen können sich neben rückgestreuten und Primärstrahlelektronen, die dem Block nicht entkommen, ansammeln und eine "Gewebeladung" erzeugen, die zu einem lokalisierten elektrostatischen Feld an der Blockfläche führen kann. Diese Elektronenakkumulation kann das Bild verzerren oder dazu führen, dass Elektronen aus dem Block ausgestoßen werden und zum vom Rückstreudetektor gesammelten Signal beitragen, wodurch das Signal-Rausch-Verhältnis¹³verringert wird. Während das Niveau der Gewebeladung durch Verringerung der Elektronenstrahlspannung oder -intensität oder durch Verkürzung der Strahlverweilzeit verringert werden kann, führt dies zu einem verringerten Signal-Rausch-Verhältnis¹⁴. Wenn ein Elektronenstrahl mit geringerer Spannung oder Intensität verwendet wird oder der Strahl nur für einen kürzeren Zeitraum in jedem Pixelraum verweilen darf, werden weniger rückgestreute Elektronen aus dem Gewebe ausgestoßen und vom Elektronendetektor eingefangen, was zu einem schwächeren Signal führt. Denk und Horstmann lösten dieses Problem, indem sie Wasserdampf in die Kammer einführten und so die Ladung in der Kammer und auf der Blockfläche auf Kosten der Bildauflösung reduzierten. Bei einem Kammerdruck von 10-100 Pa wird ein Teil des Elektronenstrahls gestreut, was zu Bildrauschen und Auflösungsverlust beiträgt, dies erzeugt jedoch auch Ionen in der Probenkammer, die die Ladung innerhalb des Probenblocks²neutralisieren. Neuere Methoden zur Neutralisierung der Ladung innerhalb des Probenblocks verwenden die fokale Gasinjektion von Stickstoff über die Blockfläche während der Bildgebung oder die Einführung negativer Spannung in die SBF-REM-Stufe, um die Sondenstrahl-Lading-Energie zu verringern und das gesammelte Signal zu erhöhen^6,7,15. Anstatt Stufenvorspannung, Kammerdruck oder lokalisierte Stickstoffinjektion einzuführen, um den Ladungsaufbau auf der Blockoberfläche zu verringern, ist es auch möglich, die Leitfähigkeit des Harzes zu erhöhen, indem Kohlenstoff in die Harzmischung eingeführt wird, was aggressivere Bildgebungseinstellungen ermöglicht¹⁶. Das folgende allgemeine Protokoll ist eine Adaption des 2010 veröffentlichten Deerinck et al.-Protokolls und deckt Modifikationen an Gewebevorbereitungs- und Bildgebungsmethoden ab, die wir für die Minimierung der Gewebeaufladung bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung der hochauflösenden Bilderfassung für nützlich hielten^3,17,18,19. Während sich das zuvor erwähnte Protokoll auf die Gewebeverarbeitung und Schwermetallimprägnierung konzentrierte, bietet dieses Protokoll Einblicke in den Bildgebungs-, Datenanalyse- und Rekonstruktionsworkflow, der SBF-SEM-Studien innewohnt. In unserem Labor wurde dieses Protokoll erfolgreich und reproduzierbar auf eine Vielzahl von Geweben angewendet, darunter Hornhaut- und Vordersegmentstrukturen, Augenlid, Tränen- und Härterdrüse, Netzhaut und Sehnerv, Herz, Lunge und Atemwege, Niere, Leber, Cremaster-Muskel und Großhirnrinde / Medulla sowie in einer Vielzahl von Arten wie Maus, Ratte, Kaninchen, Meerschweinchen, Fisch, Monoschicht- und Stratifizierte Zellkulturen, Schwein, nichtmenschliche Primaten sowie Menschen^20,21,22,23. Während sich kleine Änderungen für bestimmte Gewebe und Anwendungen lohnen können, hat sich dieses allgemeine Protokoll im Kontext unserer Core Imaging Facility als sehr reproduzierbar und nützlich erwiesen.

Protokoll

Alle Tiere wurden gemäß den Richtlinien behandelt, die in der Erklärung der Association for Research in Vision and Ophthalmology for the Use of Animals in Vision and Ophthalmic Research und den Richtlinien des University of Houston College of Optometry für den Umgang mit Tieren beschrieben sind. Alle Tierverfahren wurden von den Institutionen genehmigt, in denen sie behandelt wurden: Maus-, Ratten-, Kaninchen-, Meerschweinchen- und nichtmenschliche Primatenverfahren wurden vom Animal Care and Use Committee der University of Houston genehmigt, Zebrafischverfahren wurden vom DePauw University Animal Care and Use Committee genehmigt und Schweineverfahren wurden vom Baylor College of Medicine Animal Care and Use Committee genehmigt. Das gesamte menschliche Gewebe wurde in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki in Bezug auf die Forschung an menschlichem Gewebe behandelt und eine entsprechende Genehmigung des institutionellen Prüfungsausschusses eingeholt.

1. Gewebeverarbeitung

1. Bereiten Sie eine Stammlösung von 0,4 M Natriumcodylatpuffer vor, indem Sie Natriumcodylatpulver in ddH₂O mischen. Dieser Puffer wird verwendet, um Fixiermittel (Zusammensetzung in Schritt 1.3 beschrieben), Waschpuffer sowie Osmium- und Kaliumferrocyanidlösungen herzustellen.
   HINWEIS: Die Perfusionsfixierung ist oft die beste Fixierungsmethode für SBF-REM-Studien, da die Fixierung schnell und im ganzen Körper auftritt. Wenn eine Perfusionsfixierung in Ihrem Studiendesign nicht möglich ist, fahren Sie mit Schritt 1.3 fort.
2. Führen Sie eine Perfusionsfixierung mit dem entsprechenden physiologischen Druck für das Tiermodell^{24,25,26 durch.} Dies geschieht durch transkardiale sequentielle Perfusion mit heparinisierter Kochsalzlösung, gefolgt von Fixiermitteln, die jeweils in einer bestimmten Höhe (z. B. 100 cm) über dem Organismus platziert werden (entsprechend dem physiologischen Druck des Gefäßsystems im Tiermodell), wobei das Fixativum in den linken Ventrikel fließt und aus einem Einschnitt im rechten Vorhof austritt. Gewebe von Interesse wird blass, wenn Blut durch Fixiermittel ersetzt wird, wenn das gesamte oder ein Teil Ihres Gewebes nicht blanchiert, dann kann Gewebe nicht angemessen fixiert werden und Ultrastruktur kann nicht erhalten bleiben.
3. Verwenden Sie eine Rasierklinge oder ein scharfes Skalpell, um Gewebeproben zu Blöcken zu schneiden, die nicht größer als 2 mm x 2 mm x 2 mm sind. Wenn Schritt 1.2 übersprungen wurde, tun Sie dies schnell, damit das Gewebe so schnell wie möglich repariert werden kann.
   1. Alternativ sezieren Sie Gewebe unter Fixiermittel und übertragen es auf frische Fixiermittel, um den Immersionsprozess abzuschließen. Die endgültige Zusammensetzung des Fixiermittels besteht aus 0,1 M Natriumcodylatpuffer, der 2,5% Glutaraldehyd und 2 mM Calciumchlorid enthält. Lassen Sie die Fixierung mindestens 2 Stunden bei Raumtemperatur und maximal über Nacht bei 4 °C erfolgen. Verwenden Sie nach Möglichkeit eine Wipp-/Kippplatte, um proben während der Fixierung vorsichtig zu rühren.
   2. Alternativ, wenn eine Inverter-Mikrowelle verfügbar ist, fixieren Sie Gewebe in oben genannten Fixiermitteln unter Vakuum bei 150 Watt für 4 Zyklen von 1 Minute an, 1 Minute aus. Die Mikrowellenfixierung ist die bevorzugte Methode für Schritt 1.3, da sie das Gewebe schnell fixiert und die Gewebe ultrastrukturiert²⁷.
      HINWEIS: Gewebe sollte während dieses Protokolls niemals trocknen dürfen, es sollte darauf geachtet werden, Gewebe schnell von einer Lösung zur nächsten zu übertragen.
4. Festes Gewebe 5x für jeweils 3 Minuten (insgesamt 15 Minuten) bei Raumtemperatur in 0,1 M Natriumcodylatpuffer mit 2 mM Calciumchlorid waschen.
5. Machen Sie die folgende Osmiumferrocyanidlösung frisch, vorzugsweise während der vorherigen Waschschritte. Eine 4% ige Osmiumtetroxidlösung (hergestellt in ddH2O) mit_einemgleichen Volumen von 3% Kaliumferrocyanid in 0,2 M Cacodylatpuffer mit 4 mM Calciumchlorid kombinieren. Nach dem vorherigen Waschschritt legen Sie das Gewebe in diese Lösung für 1 Stunde auf Eis im Dunkeln und in den Abzug.
   HINWEIS: Osmiumtetroxid ist eine gelbe kristalline Substanz, die in einer Ampulle enthalten ist. Um die Osmiumtetroxidlösung herzustellen, öffnen Sie die Ampulle, fügen Sie ddH₂O hinzu und beschallen Sie sie für 3-4 Stunden im Dunkeln, bis die Kristalle vollständig aufgelöst sind. Osmiumtetroxidlösung ist eine klare gelbe Lösung, wenn die Lösung schwarz ist, wurde das Osmium reduziert und sollte nicht mehr verwendet werden.
6. Während das Gewebe in der Osmiumferrocyanidlösung inkubiert, beginnen Sie mit der Herstellung der Thiocarbohydrazid (TCH) -Lösung. Bereiten Sie diese Lösung frisch vor und halten Sie sie am Ende der 1-stündigen Osmiumferrocyanid-Fixierungszeit bereit. Kombinieren Sie 0,1 g Thiocarbohydrazid mit 10 mL ddH₂O und legen Sie diese Lösung für 1 Stunde in einen 60 °C-Ofen. Um sicherzustellen, dass die Lösung gelöst ist, alle 10 Minuten vorsichtig schwenken. Filtern Sie diese Lösung vor dem Gebrauch durch einen 0,22 μm Spritzenfilter.
7. Vor der Inkubation in TCH das Tuch mit Raumtemperatur ddH₂O 5x für jeweils 3 Minuten (insgesamt 15 Minuten) waschen.
8. Legen Sie das Gewebe für insgesamt 20 Minuten bei Raumtemperatur in die gefilterteTCH-Lösung(Abbildung 1A-C ).
9. Nach der Inkubation in TCH das Gewebe 5x für jeweils 3 Minuten (insgesamt 15 Minuten) bei Raumtemperatur ddH 2 O_waschen.
10. Gewebe in ddH₂O mit 2% Osmiumtetroxid (nicht mit Kaliumferrocyanid reduziert) für 30 Minuten bei Raumtemperatur legen. Dies sollte im Abzug und im Dunkeln erfolgen, da Osmium durch Licht (z.B. unter Aluminiumfolie) reduziert werden kann (Abbildung 1D-F).
11. Nach Osmiumtetroxid-Inkubation 5x für je 3 Minuten (insgesamt 15 Minuten) bei Raumtemperatur ddH₂O waschen.
12. Gewebe in 1% wässrigem Uranylacetat (Uranylacetatpulver in ddH₂O gemischt) über Nacht in einen Kühlschrank bei 4 °C geben.
13. Kurz bevor Sie das Gewebe aus dem Kühlschrank entfernen, bereiten Sie frische Walton-Bleiaspartatlösung zu. Beginnen Sie mit dem Auflösen von 0,066 g Bleinitrat in 10 ml 0,03 M Asparaginsäurelösung (0,04 g Asparaginsäure in 10 ml destilliertem Wasser) und stellen Sie den pH-Wert mit 1 N KOH (0,5611 g in 10 ml destilliertem Wasser) auf 5,5 ein.
    ACHTUNG: Bei der Einstellung des pH-Werts kann sich ein Niederschlag bilden. Das ist nicht akzeptabel.
    1. Mit einem Rührstab langsam den 1 N KOH tropfenweise hinzufügen, während der pH-Wert überwacht wird. Die fertige klare Bleiaspartatlösung in einem 60 °C-Ofen 30 Minuten vorheizen. Wenn sich ein Niederschlag bildet, kann die Lösung nicht verwendet werden und eine andere Lösung muss vorbereitet werden.
14. Das Taschentuch aus dem Kühlschrank nehmen und 5x für jeweils 3 Minuten (insgesamt 15 Minuten) bei Raumtemperatur ddH₂O waschen.
15. Nach dem Waschen das Gewebe für 30 Minuten in die erwärmte Walton-Bleiaspartatlösung geben, während die Temperatur bei 60 ° C bleibt.
16. Nach der Inkubation in Waltons Bleiaspartat waschen Sie das Gewebe 5x für jeweils 3 Minuten (insgesamt 15 Minuten) bei Raumtemperatur ddH₂O(Abbildung 1G-I).
17. Dehydrieren Sie das Gewebe durch eine eiskalte Acetonreihe (30%, 50%, 70%, 95%, 95%, 100%, 100% und 100% Aceton (gegebenenfalls in ddH₂O), wobei 10 Minuten für jeden Schritt in der Serie eingeläßt werden.
18. Nach der eiskalten Dehydratationsserie das Gewebe für 10 Minuten in Aceton bei Raumtemperatur legen.
    1. Formulieren Sie während dieser Zeit Embed 812 ACM Harz. Verwenden Sie das Rezept "harte Mischung", da es widerstandsfähiger gegen Strahlschäden ist. Mischen Sie das Harz gründlich und legen Sie das Gewebe für 4 Stunden in Embed 812: Aceton (1: 3-Mix), gefolgt von Embed 812: Aceton (1: 1-Mix) für 8 Stunden oder über Nacht und schließlich Embed 812: Aceton (3: 1-Mix) über Nacht. Führen Sie diese Harzinfiltrationsschritte bei Raumtemperatur durch.
19. Am nächsten Tag legen Sie das Gewebe in 100% Embed 812 für 4-8 Stunden, dann in frisches 100% Embed 812 über Nacht und schließlich in frisches 100% Embed 812 für 4 Stunden. Führen Sie diese Harzinfiltrationsschritte bei Raumtemperatur durch.
    1. Kurz vor dem Einbetten eine kleine Menge Harz in einen Mischbehälter geben und langsam (ein Holzstab kann zum Rühren verwendet werden) in Rußpulver mischen, bis das Harz mit dem Pulver gesättigt ist, aber noch flüssig ist und nicht körnig wird. Es sollte dicker Tinte ähneln und in der Lage sein, langsam vom Holzstab ohne sichtbare Klumpen zu tropfen.
20. Richten Sie die Gewebeproben in einer Silikonkautschukform aus und machen Sie ein Bild, so dass die Probenorientierung innerhalb des Harzblocks aufgezeichnet wird und referenziert werden kann. Decken Sie die Proben an der Spitze der Silikonform mit Ruß gesättigtem Harz ab und stellen Sie die Form für ~ 1 Stunde bei 65 ° C in einen Ofen.
    1. Legen Sie die Form an eine Steigung, um das Harz an der Spitze der Form zu enthalten, wo es die Gewebeprobe bedeckt. Legen Sie ein Etikett mit einem Experiment-/Gewebeprobenbezeichner in die Form am gegenüberliegenden Ende des Harzes (Abbildung 2A).
21. Entfernen Sie die Silikonform aus dem Ofen und füllen Sie den Rest der Form mit klarem Harz (kein Ruß), um sicherzustellen, dass das Etikett sichtbar bleibt. Härten Sie das mit Ruß angereicherte Harz so weit aus, dass es sich nicht leicht mit dem klaren Harz vermischt.
    1. Bereiten Sie einen zusätzlichen Brunnen in der Form vor, der kein Gewebe enthält. Beginnen Sie mit dem zusätzlichen Brunnen, füllen Sie den Rest der Form mit klarem Harz.
    2. Wenn das mit Ruß angereicherte Harz in das klare Harz zu bluten beginnt, legen Sie die Silikonform für zusätzliche Zeit (z. B. 15 Minuten) wieder in den Ofen.
    3. Sobald alle Gewebeproben mit klarem Harz aufgefüllt wurden, legen Sie die Silikonform bei 65 °C für 48 Stunden wieder in den Ofen (flach, keine Steigung), um den Aushärtungsprozess abzuschließen.

2. Blockvorbereitung

HINWEIS: Die Methode hängt davon ab, wie die Probe im Block ausgerichtet ist und wie die Schnitte erfolgen sollen. Die häufigste Gewebeorientierung findet jedoch das Gewebe zentriert in der Spitze des Harzblocks, senkrecht zum langen Ende des Harzblocks.

1. In den meisten Fällen schneiden Sie zuerst das Ende des Blocks, um das Gewebe zu lokalisieren, indem Sie den Probenblock in das Mikrotomfutter legen, wobei das konische Ende etwa 5-6 mm aus dem Futter herausragt. Verriegeln Sie es mit der Stellschraube und legen Sie es unter eine Wärmelampe.
2. Nach einigen Minuten ist der Block formbar und leicht zu trimmen. Legen Sie das Futter in den Stereomikroskophalter und verwenden Sie eine neue zweischneidige Rasierklinge, um dünne Abschnitte parallel zur Blockfläche zu machen, bis das Gewebe sichtbar ist. Dies wird am besten durch Angeln von Licht über die Blockfläche gesehen, die Gewebeprobe wird weniger reflektierend und körnig im Vergleich zu den Teilen des Harzes sein, die ohne Gewebe sind. Konsultieren Sie das Foto von Gewebeproben vor der Einführung von Ruß gesättigtem Harz, um eine Vorstellung davon zu erhalten, wie und wo sich das Gewebe befindet.
3. Stellen Sie einen Probenstifthalter zum Beschneiden beiseite. Dieser Stifthalter wird niemals in die REM-Kammer gelegt und kann daher ohne Handschuhe gehandhabt werden, dies wird als Trimmstifthalter bezeichnet. Probenhalter, die dazu bestimmt sind, in die Bildkammer eingesetzt zu werden, sollten niemals ohne Handschuhe berührt werden. Dadurch wird vermieden, dass Fett und Öl in die Mikroskopkammer einführt werden.
4. Legen Sie einen Aluminiumprobenstift in den Trimmstifthalter und ziehen Sie die Stellschraube leicht fest, wobei die Fläche (flache Oberfläche) des Stifts 3-4 mm über dem Stifthalter gehalten wird.
5. Machen Sie mehrere tiefe, kreuz und quer verlaufende Kratzer in der Vorderseite des Stifts, um eine größere Oberfläche für den Klebstoff zu schaffen, der zum Halten der Probe verwendet wird. Wenn ein Aluminiumstift verwendet wird, wird für diesen Schritt ein kleiner Stahl-Flachkopfschraubendreher empfohlen (Abbildung 2B).
6. Legen Sie das Futter mit der Gewebeprobe wieder unter die Wärmelampe, bis das Harz weich und formbar wird, und legen Sie es dann in die Futterbuchse unter dem Stereomikroskop.
7. Verwenden Sie eine zweischneidige Rasierklinge, um überschüssiges Harz aus dem Teil des Harzblocks, der die Gewebeprobe enthält, abzuschneiden. Letztendlich wird die Größe des am Stift befestigten Gewebeblocks etwa 3 mm Im Durchmesser und 2-3 mm in der Höhe sein.
   1. Drücken Sie den Rasierer vorsichtig gerade in den Harzblock etwa 1-2 mm und drücken Sie den Rasierer dann vorsichtig horizontal in den Harzblock in einer Tiefe, die dem vorherigen Schnitt entspricht. Tun Sie dies langsam und mit großer Sorgfalt, da es möglich ist, den Teil des Blocks, der die Gewebeprobe enthält, zu beschädigen oder wegzuschneiden. Wenn sich die beiden Schnitte treffen, trennt sich das überschüssige Harz vom Block. Entfernen Sie das Harz weiter, bis nur noch eine erhöhte Fläche von 3 mm x 3 mm übrig bleibt.
8. Nach diesem ersten Trimmen legen Sie den Block (noch im Futter) für einige Minuten unter die Wärmelampe.
9. Sobald das Harz weich und formbar ist, legen Sie den Block wieder unter das Stereomikroskop. Schneiden Sie mit einer neuen zweischneidigen Rasierklinge die Oberseite des Harzblocks, etwa 1 mm unter dem beschnittenen Teil, mit einem einzigen glatten Schnitt ab. Eine ebene Oberfläche ist vorzuziehen, da diese auf den Probenstift geklebt wird. Achten Sie darauf, dass die Probe nicht verloren geht, da dieser Schritt eine gewisse Kraft erfordert, die auf den entfernten Teil des Blocks übertragen und dazu führen kann, dass er wegfliegt. Legen Sie den Schnitt und die zugeschnittene Probe beiseite.
10. Setzen Sie den Trimmstifthalter mit dem geschnittenen Aluminiumstift in die Stereomikroskopbuchse ein. Tragen Sie eine dünne Schicht Cyanacrylatkleber auf die Stiftfläche auf, so dass sie den Stift vollständig bedeckt, ohne einen sichtbaren Meniskus zu bilden. Nehmen Sie das getrimmte Stück des Gewebeblocks mit einer Pinzette auf und legen Sie es auf die Stiftfläche. Zentrieren Sie die Gewebeprobe auf dem Probenstift. Drücken Sie es nach unten und halten Sie es für einige Sekunden. Lassen Sie den Kleber einige Minuten einwirken.
11. Wenn der Kleber gründlich trocken ist, legen Sie den Trimmstifthalter wieder unter das Stereomikroskop. Feilen Sie überschüssiges Harz mit einer feinen Datei ab, damit kein Harz über den Stift steigt. Die Harzform sollte dem kreisförmigen Stiftkopf ähneln.
12. Lokalisieren Sie das Gewebe auf dem erhöhten Teil Ihres Harzblocks, schräge Beleuchtung ist dafür nützlich. Bei Verwendung eines zweischneidigen Rasierers muss der erhöhte Teil des Harzes, der die Gewebeprobe enthält, auf eine Fläche von nicht mehr als 1 mm²getrimmt werden. Wenn möglich, kann die Blockfläche noch kleiner beschnitten werden, was die Belastung des Diamantmessers reduziert und seine Langlebigkeit verbessert.
    1. Entfernen Sie so viel überschüssiges Harz wie möglich und lassen Sie den Block in einer Dimension etwas länger. Dies geschieht langsam und mit Sorgfalt, da es möglich ist, dass das Harz, das die Gewebeprobe enthält, abbricht, wenn zu viel Kraft aufgebracht wird. Während ein Rasierer empfohlen wird, kann für diesen Schritt eine feine Metallfeile verwendet werden.
13. Mit einem feinen Metallfeinwinkel wird das überschüssige Harz im Bereich außerhalb des erhöhten Teils, der die Gewebeprobe enthält, nach unten zum Rand des Stiftes hinunter(Abbildung 2C).
14. Entfernen Sie Harzpartikel und Staub von der vorbereiteten Probe, bevor Sie Silberfarbe auftragen, gefolgt von Goldsputtern. Mischen Sie Silber mit Aceton, so dass es eine leicht streichfähige Flüssigkeit ist, ähnlich wie Nagellack (aber nicht so dünn, dass es vom Applikator tropft) und tragen Sie eine dünne Schicht auf die gesamte Probenblockoberfläche auf. Aceton verdunstet schnell, so dass es notwendig sein kann, zusätzliches Aceton hinzuzufügen, wenn die Silberfarbe zu verdicken beginnt.
    1. Lassen Sie die silberne Farbe über Nacht trocknen, bevor Sie sie in das Mikroskop laden.
       HINWEIS: Diese Silberschicht muss dünn sein, um zu vermeiden, dass die Blockfläche über 1 mm x 1 mm hinaus erweitert wird, und obwohl die Silberfarbe das Diamantmesser nie beschädigt hat, werden dennoch kleinere Blockflächen empfohlen, um die Langlebigkeit des Diamantmessers zu erhalten. Das mit dem Silber vermischte Aceton muss vor dem Goldsputtern oder Laden der Probe in das Mikroskop vollständig verdampfen, um zu vermeiden, dass Acetondampf in die Bildgebungskammer einführt.
    2. Tragen Sie nach dem Auftragen der Silberfarbe eine dünne Schicht Gold auf den Probenblock auf. Bei Verwendung eines Standard-Vakuum-Sputtergeräts, das mit einem Standard-Goldfolienziel ausgestattet ist, führt ein Kammerdruck von 200 MilliTorr (Argongas) und 40 Milliampere, die 2 Minuten laufen, zu einer 20 nm dicken Goldbeschichtung.
15. Nach der Beschichtung den montierten und beschnittenen Block in ein Röhrchen mit dem entsprechenden Experimentetikett legen. Erstellen Sie benutzerdefinierte Röhrchen mit Einweg-Transferpipetten.
    1. Schneiden Sie die Transferpipette direkt unter der Glühbirne ab und lassen Sie einen kurzen Teil des Transferpipettenrohrs unter dem bauchigen Ende angebracht. Kürzen Sie den röhrenförmigen Teil, der weggeschnitten wurde, und schneiden Sie die Pipettenspitze so weit zurück, dass der Aluminiumprobenstift eng hineingeschoben werden kann.
    2. Platzieren Sie das Ende mit dem Aluminiumprobenstift innerhalb des bauchigen Endes der modifizierten Transferpipette.
16. Bevor Sie einen vorbereiteten Gewebeblock laden, schneiden Sie überschüssige Silberfarbe vorsichtig von der Oberfläche der Blockfläche ab.

3. SEM-Einstellungen für die Abbildung des Blockgesichts

HINWEIS: Die folgenden Imaging-Einstellungen wurden auf dem von den Autoren verwendeten Gerät erstellt, das in der bereitgestellten Materialtabelle aufgeführt ist. Während dieses Gerät in der Lage ist, einen variablen Druck abbilden zu können, wurden die besten Ergebnisse unter Hochvakuum erzielt.

1. Verweildauer: Verwenden Sie 12 μs/px während des seriellen Schnitts. Wenn ein Bereich von Interesse identifiziert wurde, kann ein Bild mit höherer Auflösung bei 32 μs/px aufgenommen werden.
2. Vakuum-Einstellungen: Verwenden Sie einen Pistolendruck von 9e-008 Pa, einen Säulendruck von 1,1e-004 Pa und einen Kammerdruck von 9,5e-002 Pa.
3. Erfassungszeit: Erfassen Sie mit den oben genannten Einstellungen einen Bildstapel von 2048 x 2048 px mit einer Rate von 50 Sekunden pro Bild. Höher aufgelöste Bilder von Regionen von Interesse können bei 4096x4096 px bei knapp 9 Minuten pro Bild aufgenommen werden.
4. Querschnittsdicke: Verwenden Sie 100-200 nm. Weniger ist möglich, kann aber eine geringere Strahlspannung, Intensität oder Verweilzeit erfordern.
5. Hochspannung (HV): Verwenden Sie 7-12 kV. Während die Erhöhung der Spannung die Spotgröße reduziert und die Auflösung erhöht, führt dies zu mehr Möglichkeiten für Strahlschäden. Höhere kV erhöhen die Strahldurchdringung, was zu Detailverlusten führt. Durch absenken des kV wird jedoch das Signal-Rausch-Verhältnis(Abbildung 3)¹⁴verschlechtert.
6. Strahlintensität (BI): Das SBF-SEM-Gerät des Autors bietet eine Strahlintensitätsskala von 1-20. Auf dieser Skala ergeben Werte von 5-7 qualitativ hochwertige Bilder ohne übermäßige Aufladung und Strahlschäden. Je höher der BI, desto größer die Auflösung, desto größer ist jedoch die Wahrscheinlichkeit, dass geladen und der Strahl beschädigt wird¹⁴.
7. Spotgröße und Bildvergrößerung: Bestimmen Sie die Spotgröße anhand der Strahlintensität und des Spannungsniveaus. Idealerweise sollte die Spotgröße nicht größer als die verwendete Pixelgröße sein. Die Pixelgröße wird bestimmt, indem das Sichtfeld (FOV) durch die Anzahl der Pixel dividiert wird. Beispielsweise würde ein 25 μm FOV mit einer Bildgröße von 2048x2048 px 12,2 nm pro Pixel ergeben. Daher sollte die Spotgröße nicht größer als 12,2 nm sein. Abbildung 4 zeigt, wie HV, BI und Spotgröße zusammenhängen.
8. Arbeitsabstand (WD) - Bei blockseitiger Bildgebung ist der Arbeitsabstand nicht einstellbar. Es ist einfach ein Faktor des Fokus. Es wird für alle abgebildeten Blöcke fast identisch sein. Der Arbeitsabstand ist zwar nicht einstellbar, spielt aber eine entscheidende Rolle bei der Auflösung des aufgenommenen Bildes. Mit abnehmendem Arbeitsabstand steigt die Auflösungsgrenze für aufgenommene Bilder. In einigen Fällen kann es möglich sein, den Arbeitsabstand durch Änderungen innerhalb der Bildgebungskammer zu verringern, diese Änderungen müssen jedoch nach Ermessen des Benutzers vorgenommen werden. Um den Arbeitsabstand zu verringern und die Bildauflösung zu erhöhen, haben wir die Mikrotomschrauben für die Türmontage gelöst und das Mikrotom so neu positioniert, dass es nach dem erneuten Anschrauben der Schrauben ~ 2 mm näher am Strahldetektor liegt.
9. Auflösung - Mit den oben genannten Einstellungen ist eine x& y-Auflösung von bis zu 3,8 nm möglich. Es ist wichtig zu beachten, dass die Auflösung durch die Strahlfleckgröße sowie die Pixelauflösung der Bildaufnahmen begrenzt ist (z. B. hat ein 20 μm-Sichtfeld, das in einem 2048x2048-Pixelbild aufgenommen wurde, eine Pixelauflösung von 9,8 nm, selbst wenn eine 3,8-nm-Spotgröße verwendet wurde). Die Bildauflösung in der z-Ebene hängt von der Schnittdicke ab, wir finden, dass 100-200 nm mit diesem Protokoll gut funktionieren.

Ergebnisse

Maus Hornhaut
Dieses Protokoll wurde ausgiebig auf die Hornhaut der Maus angewendet. Mit Hilfe der SBF-SEM-Bildgebung wurde gezeigt, dass ein Netzwerk von elastinfreien Mikrofibrillenbündeln (EFMBs) in der erwachsenen Maushornhaut vorhanden ist. Bisher glaubte man, dass dieses Netzwerk nur während der embryonalen und frühen postnatalen Entwicklung vorhanden war. SBF-SEM zeigte ein ausgedehntes EFMB-Netzwerk in der gesamten Hornhaut, wobei einzelne Fasern bei Der Messung im Querschnitt einen Durchme...

Diskussion

Der Zweck dieses Methodenpapiers besteht darin, die Gewebevorbereitungs- und Bildgebungsmethodik hervorzuheben, die es unserem Labor ermöglicht hat, hochauflösende serielle Elektronenmikroskopiebilder zuverlässig zu erfassen, und kritische Schritte aufzuzeigen, die zu diesem Ergebnis führen, sowie mögliche Fallstricke, die bei der Durchführung der SBF-REM-Bildgebung auftreten können. Der Erfolg mit diesem Protokoll erfordert die richtige Fixierung des Gewebes, die Imprägnierung von Schwermetallen in die Probe, Mo...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1/16 x 3/8 Aluminum Rivets	Industrial Rivet & Fastener Co.	6N37RFLAP/1100	Used as specimen pins.
2.5mm Flathead Screwdriver	Wiha Quality Tools	27225
Acetone	Electron Microscopy Sciences	RT 10000	Used to dilute silver paint.
Aspartic Acid	Sigma-Aldrich	A8949
Calcium Chloride	FisherScientific	C79-500
Conductive Silver Paint	Ted Pella	16062
Denton Desk-II Vacuum Sputtering Device equipped with standard gold foil target	Denton Vacuum	N/A	This is the gold-sputtering device used by the authors, alternates are acceptable.
Double-edged Razors	Fisher Scientific	50-949-411
Embed 812	Electron Microscopy Sciences	14120
Gatan 3View2 mounted in a Tescan Mira3 Field emission SEM	Gatan & Tescan	N/A	This is the SBF-SEM device used by the authors, alternates are acceptable.
Glass Shell Vials, 0.5 DRAM (1.8 ml)	Electron Microscopy Sciences	72630-05
Gluteraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16320
Gorilla Super Glue - Impact Tough	NA	NA	Refered to as cyanoacrylate glue in text.
Ketjen Black	HM Royal	EC-600JD	Refered to as carbon black in text.
KOH	FisherScientific	18-605-593
Lead Nitrate	Fisher Scientific	L62-100
Microwave	Pelco	BioWave Pro	This is the microwave used by the authors, alternates are acceptable.
Osmium Tetroxide	Sigma-Aldrich	201030
Potassium Ferrocyanide	Sigma-Aldrich	P9387
Silicone Embedding Mold	Ted Pella	10504
Sodium Cacodylate Trihydrate	Electron Microscopy Sciences	12300
Samco Transfer Pipette	ThermoFisher Scientific	202	Used to make specimen pin storage tubes.
Swiss Pattern Needle Files	Electron Microscopy Sciences	62115
Thiocarbohydrazide	Sigma-Aldrich	223220
Uranyl Acetate	Polysciences, Inc.	21447-25
Reconstruction Software
Amira Software	Thermo Scientific	N/A	Used to create the reconstructions found in figures 5-7 and 9.
Fiji (Fiji is Just ImageJ)	ImageJ.net	N/A	TrakEM2 can be added to Fiji to asist in manual segmentation.
Microscopy Image Browser (MIB)	University of Helsinki, Institute of Biotechnology	N/A
Reconstuct Software	Neural Systems Lab	N/A
SuRVoS Workbench	Diamond Light Source & The University of Nottingham	N/A
SyGlass	IstoVisio, Inc.	N/A	Allows for reconstruction in virtual reality and histogram-based reconstruction methods.