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  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Este protocolo delinea un método rutinario para usar la microscopia electrónica serial de la exploración de la bloque-cara (SBF-SEM), una técnica de proyección de imagen 3D potente. El uso acertado de SBF-SEM depende de técnicas apropiadas de la fijación y de la coloración del tejido, así como de la consideración cuidadosa de los ajustes de la proyección de imagen. Este protocolo contiene consideraciones prácticas para la totalidad de este proceso.

Resumen

La microscopia electrónica serial de la bloque-cara de la exploración (SBF-SEM) permite la colección de centenares a millares de imágenes ultraestructurales en serie-registradas, ofreciendo una vista tridimensional sin precedentes del tejido microanatomy. Mientras que SBF-SEM ha visto un aumento exponencial en uso estos últimos años, los aspectos técnicos tales como preparación apropiada del tejido y parámetros de la proyección de imagen son supremos para el éxito de esta modalidad de la proyección de imagen. Este sistema de imágenes se beneficia de la naturaleza automatizada del dispositivo, lo que permite dejar el microscopio desatendido durante el proceso de obtención de imágenes, con la recopilación automatizada de cientos de imágenes posibles en un solo día. Sin embargo, sin la preparación apropiada del tejido la ultraestructura celular se puede alterar de una manera tal que las conclusiones incorrectas o engañosas pudieran ser dibujadas. Además, las imágenes se generan escaneando la cara de bloque de una muestra biológica incrustada en resina y esto a menudo presenta desafíos y consideraciones que deben abordarse. La acumulación de electrones dentro del bloque durante la proyección de imagen, conocida como "carga del tejido," puede llevar a una pérdida de contraste y a una inhabilidad de apreciar la estructura celular. Además, si bien el aumento de la intensidad/voltaje del haz de electrones o la disminución de la velocidad de escaneo del haz pueden aumentar la resolución de la imagen, esto también puede tener el desafortunado efecto secundario de dañar el bloque de resina y distorsionar las imágenes posteriores en la serie de imágenes. Aquí presentamos un protocolo de rutina para la preparación de muestras de tejido biológico que preserva la ultraestructura celular y disminuye la carga tisular. También proporcionamos las consideraciones de la proyección de imagen para la adquisición rápida de serial-imágenes de alta calidad con daño mínimo al bloque del tejido.

Introducción

La microscopía electrónica de barrido facial de bloques en serie (SBF-SEM) fue descrita por primera vez por Leighton en 1981, donde creó un microscopio electrónico de barrido aumentado con un microtomo incorporado que podía cortar e imaginar secciones delgadas de tejido incrustadas en resina. Desafortunadamente, las limitaciones técnicas restringieron su uso a muestras conductoras, ya que las muestras no conductoras, como el tejido biológico, acumularon niveles inaceptables de carga (acumulación de electrones dentro de la muestra de tejido)1. Si bien el recubrimiento de la cara de bloque entre cortes con carbono evaporado redujo la carga de tejido, esto aumentó en gran medida el tiempo de adquisición de imágenes y el almacenamiento de imágenes siguió siendo un problema, ya que la tecnología informática en ese momento era insuficiente para administrar los grandes tamaños de archivo creados por el dispositivo. Esta metodología fue revisada por Denk y Horstmann en 2004 utilizando un SBF-SEM equipado con una cámara de presión variable2. Esto permitió la introducción de vapor de agua a la cámara de imágenes, lo que reduce la carga dentro de la muestra, haciendo que las imágenes de muestras no conductoras sean viables, aunque con una pérdida de resolución de imagen. Las mejoras adicionales en la preparación del tejido y los métodos de la proyección de imagen ahora permiten la proyección de imagen usando el alto vacío, y la proyección de imagen de SBF-SEM confía no más en el vapor de agua para disipar la carga3,4,5,6,7,8,9. Mientras que SBF-SEM ha visto un aumento exponencial en uso estos últimos años, los aspectos técnicos tales como preparación apropiada del tejido y parámetros de la proyección de imagen son supremos para el éxito de esta modalidad de la proyección de imagen.

SBF-SEM permite la recolección automatizada de miles de imágenes de microscopía electrónica registradas en serie, con una resolución plana tan pequeña como 3-5 nm10,11. El tejido, impregnado con metales pesados e incrustado en resina, se coloca dentro de un microscopio electrónico de barrido (SEM) que contiene un ultramicrotomo equipado con un cuchillo de diamante. Una superficie plana se corta con el cuchillo de diamante, el cuchillo se retrae y la superficie del bloque se escanea en un patrón ráster con un haz de electrones para crear una imagen de ultraestructura de tejido. A continuación, el bloque se eleva una cantidad especificada (por ejemplo, 100 nm) en el eje z, conocido como "paso z", y se corta una nueva superficie antes de que se repita el proceso. De esta manera se produce un bloque de imágenes de 3 dimensiones (3D) a medida que se corta el tejido. Este sistema de imágenes se beneficia aún más de la naturaleza automatizada del dispositivo, lo que permite dejar el microscopio desatendido durante el proceso de obtención de imágenes, con la recopilación automatizada de cientos de imágenes posibles en un solo día.

Mientras que las imágenes SBF-SEM utilizan principalmente electrones retrosperdicionados para formar una imagen de la cara de bloque, los electrones secundarios se generan durante el proceso de obtención de imágenes12. Los electrones secundarios pueden acumularse, junto con los electrones retrospersión y de haz primario que no escapan del bloque, y producen "carga de tejido", lo que puede conducir a un campo electrostático localizado en la cara del bloque. Esta acumulación de electrones puede distorsionar la imagen o hacer que los electrones sean expulsados del bloque y contribuir a la señal recogida por el detector de retrospersión, disminuyendo la relación señal/ruido13. Mientras que el nivel de carga del tejido puede disminuirse reduciendo el voltaje o la intensidad del haz de electrones, o reduciendo el tiempo de permanencia del haz, esto resulta en una relación señal/ruido disminuida14. Cuando se utiliza un haz de electrones de menor voltaje o intensidad, o el haz solo puede habitar dentro de cada espacio de píxeles durante un período de tiempo más corto, menos electrones retrodispersión son expulsados del tejido y capturados por el detector de electrones, lo que resulta en una señal más débil. Denk y Horstmann abordaron este problema introduciendo vapor de agua en la cámara, reduciendo así la carga en la cámara y en la cara del bloque a costa de la resolución de la imagen. Con una presión de cámara de 10-100 Pa, una parte del haz de electrones se dispersa contribuyendo al ruido de la imagen y una pérdida de resolución, sin embargo, esto también produce iones en la cámara de la muestra que neutraliza la carga dentro del bloque de muestra2. Los métodos más recientes para neutralizar la carga dentro del bloque de muestra utilizan la inyección focal de gas de nitrógeno sobre la cara del bloque durante la toma de imágenes, o la introducción de voltaje negativo en la etapa SBF-SEM para disminuir la energía de la sonda-haz-lading y aumentar la señal recogida6,7,15. En lugar de introducir sesgo de etapa, presión de cámara o inyección localizada de nitrógeno para disminuir la acumulación de carga en la superficie del bloque, también es posible aumentar la conductividad de la resina mediante la introducción de carbono en la mezcla de resina, lo que permite ajustes de imagen más agresivos16. El siguiente protocolo general es una adaptación del protocolo de Deerinck et al. publicado en 2010 y cubre las modificaciones en la preparación de tejidos y las metodologías de imagen que encontramos útiles para minimizar la carga de tejidos mientras se mantiene la adquisición de imágenes de alta resolución3,17,18,19. Mientras que el protocolo previamente mencionado se centró en el proceso del tejido y la impregnación del metal pesado, este protocolo proporciona la penetración en la proyección de imagen, el análisis de datos, y el flujo de trabajo de la reconstrucción inherentes a los estudios de SBF-SEM. En nuestro laboratorio, este protocolo se ha aplicado con éxito y reproduciblemente a una amplia variedad de tejidos, incluyendo córnea y estructuras del segmento anterior, párpado, glándula lagrimal y harderiana, retina y nervio óptico, corazón, pulmón y vía aérea, riñón, hígado, músculo cremaster y corteza cerebral / médula, y en una variedad de especies que incluyen ratón, rata, conejo, conejillo de Indias, peces, monocapa y cultivos celulares estratificados, cerdo, primate no humano, así como humanos20,21,22,23. Mientras que los pequeños cambios pueden valer la pena para tejidos y aplicaciones específicos, este protocolo general ha demostrado ser altamente reproducible y útil en el contexto de nuestra instalación de imágenes principales.

Protocolo

Todos los animales fueron manejados de acuerdo con las pautas descritas en la Declaración de manejo de animales para el uso de animales en la visión y la investigación oftálmica de la Universidad de Houston y la Facultad de Optometría de la Universidad de Houston. Todos los procedimientos de animales fueron aprobados por las instituciones en las que se manejaron: los procedimientos de ratón, rata, conejo, conejillo de Indias y primates no humanos fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Houston, los procedimientos de pez cebra fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de DePauw, y los procedimientos de cerdos fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de baylor College of Medicine. Todos los tejidos humanos se manipularon de conformidad con la Declaración de Helsinki relativa a la investigación sobre tejidos humanos y se obtuvo la aprobación de la junta de revisión institucional apropiada.

1. Procesamiento de tejidos

  1. Prepare una solución común de tampón de cacodilato de sodio de 0,4 M mezclando polvo de cacodilato de sodio en ddH2O. Mezcle bien el tampón y el pH ajuste la solución a 7.3. Este tampón se utiliza para hacer fijativo (composición que se describe a continuación en el paso 1.3), tampón de lavado, así como soluciones de ferrocianuro de osmio y potasio.
    NOTA: La fijación de la perfusión es a menudo el mejor método de fijación para los estudios de SBF-SEM, pues la fijación ocurre rápidamente y en el cuerpo. Si la fijación de perfusión no es posible dentro del diseño del estudio, vaya al paso 1.3.
  2. Realizar la fijación de perfusión con la presión fisiológica adecuada para el modelo animal24,25,26. Esto se hace vía la perfusión secuencial transcardial con la solución salina heparinized seguida por el fijador, cada uno colocado en una altura específica (e.g., 100 cm) sobre el organismo (apropiado a la presión fisiológica del sistema vascular en el modelo animal), con el fijador que fluye en el ventrículo izquierdo, y saliendo de una incisión hecha en el atrio derecho. El tejido de interés se volverá pálido a medida que la sangre se reemplace con fijador, si todo o una parte de su tejido no se blanquea, entonces el tejido puede no fijarse adecuadamente y la ultraestructura puede no preservarse.
  3. Use una cuchilla de afeitar o un bisturí afilado para recortar las muestras de tejido en bloques no mayores de 2 mm x 2 mm x 2 mm. Si se omitió el paso 1.2, hágalo rápidamente para que el tejido pueda fijarse por inmersión lo más rápido posible.
    1. Alternativamente, diseccione el tejido bajo fijador y transfiera al fijador fresco para completar el proceso de inmersión. La composición final del fijador consiste en un tampón de cacodilato de sodio de 0,1 M que contiene glutaraldehído al 2,5% y cloruro de calcio de 2 mM. Deje que la fijación proceda durante un mínimo de 2 horas a temperatura ambiente y un máximo de noche a 4 °C. Si es posible, utilice un balancín/placa basculante para agitar suavemente las muestras mientras se fijan.
    2. Alternativamente, si un microondas inversor está disponible, fijar el tejido en el fijador antes mencionado bajo vacío a 150 vatios durante 4 ciclos de 1 minuto en, 1 minuto de descuento. La fijación por microondas es el método preferido para el paso 1.3, ya que fija rápidamente el tejido y preserva la ultraestructura del tejido27.
      NOTA: Nunca se debe permitir que el tejido se seque durante este protocolo, se debe tener cuidado de transferir tejido rápidamente de una solución a la siguiente.
  4. Lavar el tejido fijo 5 veces durante 3 minutos cada uno (15 minutos en total) a temperatura ambiente en tampón de cacodilato de sodio de 0,1 M que contenga cloruro de calcio de 2 mM.
  5. Haga fresca la siguiente solución de ferrocianuro de osmio, preferiblemente durante los pasos de lavado anteriores. Combine una solución de tetróxido de osmio al 4% (preparada en ddH2O) con un volumen igual de ferrocianuro de potasio al 3% en tampón de cacodilato de 0,2 M con cloruro de calcio de 4 mM. Después del paso de lavado anterior, coloque el tejido en esta solución durante 1 hora sobre hielo en la oscuridad y en la campana extractora de humos.
    NOTA: El tetróxido de osmio es una sustancia cristalina amarilla que viene en una ampolla. Para crear la solución de tetróxido de osmio, abra la ampolla, agregue ddH2O y sonice durante 3-4 horas en la oscuridad hasta que los cristales se disuelvan por completo. La solución de tetróxido de osmio es una solución de color amarillo claro, si la solución es negra, el osmio se ha reducido y ya no debe usarse.
  6. Mientras el tejido está incubando en la solución de ferrocianuro de osmio, comience a preparar la solución de tiocarbohidrazida (TCH). Prepare esta solución fresca y tenga fácilmente disponible al final del período de fijación de ferrocianuro de osmio de 1 hora. Combinar 0,1 g de tiocarbohidrazda con 10 mL de ddH2O y colocar esta solución en un horno de 60 °C durante 1 hora. Para asegurarse de que la solución se disuelva, gire suavemente cada 10 minutos. Antes de su uso, filtre esta solución a través de un filtro de jeringa de 0,22 μm.
  7. Antes de incubar en TCH, lave el tejido con temperatura ambiente ddH2O 5x durante 3 minutos cada uno (15 minutos en total).
  8. Colocar el tejido en la solución TCH filtrada durante un total de 20 minutos a temperatura ambiente (Figura 1A-C).
  9. Después de la incubación en TCH, lavar el tejido 5x durante 3 minutos cada uno (15 minutos en total) a temperatura ambiente ddH2O.
  10. Colocar el tejido en ddH2O que contenga tetróxido de osmio al 2% (no diósmico reducido con ferrocianuro de potasio) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Esto debe hacerse en el capó de humos y en la oscuridad, ya que el osmio puede reducirse con luz (por ejemplo, bajo papel de aluminio)(Figura 1D-F).
  11. Después de la incubación del tetróxido de osmio, lave el tejido 5x durante 3 minutos cada uno (15 minutos en total) a temperatura ambiente ddH2O.
  12. Coloque el tejido en acetato de uranilo acuoso al 1% (acetato de uranilo en polvo mezclado en ddH2O) durante la noche en un refrigerador a 4 °C.
  13. Justo antes de retirar el tejido del refrigerador, prepare la solución fresca de aspartato de plomo de Walton. Comience disolviendo 0.066 g de nitrato de plomo en 10 mL de solución de ácido aspártico de 0.03 M (0.04 g de ácido aspártico en 10 mL de agua destilada) y ajuste el pH a 5.5 con 1 N KOH (0.5611 g en 10 mL de agua destilada).
    PRECAUCIÓN: Se puede formar un precipitado al ajustar el pH. Esto no es aceptable.
    1. Usando una barra de agitación, agregue lentamente el 1 N KOH gota a gota mientras monitorea el pH. Precalentar la solución de aspartato de plomo transparente terminada en un horno de 60 °C durante 30 minutos. Si se forma un precipitado, la solución no se puede usar y se debe preparar otra solución.
  14. Retire el pañuelo desechable del refrigerador y lave 5 veces durante 3 minutos cada uno (15 minutos en total) a temperatura ambiente ddH2O.
  15. Después del lavado, coloque el tejido en la solución de aspartato de plomo de Walton calentada durante 30 minutos mientras mantiene la temperatura a 60 °C.
  16. Después de la incubación en aspartato de plomo de Walton, lavar el tejido 5x durante 3 minutos cada uno (15 minutos en total) a temperatura ambiente ddH2O (Figura 1G-I).
  17. Deshidratar el tejido a través de una serie de acetona helada (30%, 50%, 70%, 95%, 95%, 100%, 100% y 100% de acetona (en ddH2O cuando corresponda) permitiendo 10 minutos para cada paso de la serie.
  18. Después de la serie de deshidratación helada, coloque el tejido en acetona a temperatura ambiente durante 10 minutos.
    1. Durante este tiempo, formule la resina Embed 812 ACM. Utilice la receta de "mezcla dura", ya que es más resistente al daño de la viga. Mezcle la resina a fondo y coloque el tejido en Embed 812:acetone (1:3 mix) durante 4 horas, seguido de Embed 812:acetone (1:1 mix) durante 8 horas o durante la noche, y finalmente Embed 812:acetone (3:1 mix) durante la noche. Realice estos pasos de infiltración de resina a temperatura ambiente.
  19. Al día siguiente, coloque el tejido en 100% Embed 812 durante 4-8 horas, luego en fresco 100% Embed 812 durante la noche, y finalmente en fresco 100% Embed 812 durante 4 horas. Realice estos pasos de infiltración de resina a temperatura ambiente.
    1. Justo antes de incrustar, coloque una pequeña cantidad de resina en un recipiente de mezcla y mezcle lentamente (se puede usar un palo de madera para remover) en polvo negro de carbón hasta que la resina esté saturada con el polvo, pero todavía sea fluida y no se vuelva granulada. Debe parecerse a la tinta gruesa y ser capaz de gotear lentamente desde el palo de madera sin grupos visibles.
  20. Oriente las muestras de tejido en un molde de caucho de silicona y tome una foto para que la orientación de la muestra dentro del bloque de resina se registre y se pueda hacer referencia a ella. Cubra las muestras en resina saturada de negro de carbón en la punta del molde de silicona y coloque el molde en un horno durante ~ 1 hora a 65 ° C.
    1. Coloque el molde en una inclinación para contener la resina en la punta del molde donde cubre la muestra de tejido. Coloque una etiqueta con un identificador de muestra de experimento/tejido en el molde en el extremo opuesto de la resina (Figura 2A).
  21. Retire el molde de silicona del horno y llene el resto del molde con resina transparente (sin negro de carbón) asegurándose de que la etiqueta permanezca visible. Cure la resina infundida con negro de carbón lo suficiente como para no mezclarse fácilmente con la resina transparente.
    1. Preparar un pozo extra dentro del molde que no contenga tejido. Comenzando con el pozo extra, llene el resto del molde con resina transparente.
    2. Si la resina infundida de negro de carbón comienza a sangrar en la resina transparente, coloque el molde de silicona de nuevo en el horno por tiempo adicional (por ejemplo, 15 minutos).
    3. Una vez que todas las muestras de tejido se hayan rematado con resina transparente, coloque el molde de silicona de nuevo en el horno (plano, sin inclinación) a 65 °C durante 48 horas para completar el proceso de curado.

2. Preparación de bloques

Nota : el método dependerá de cómo se orienta el ejemplo en el bloque y cómo se va a realizar la sección. Sin embargo, la orientación más común del tejido encuentra el tejido centrado en la punta del bloque de resina, perpendicular al extremo largo del bloque de resina.

  1. En la mayoría de los casos, primero recorte el extremo del bloque para localizar el tejido colocando el bloque de la muestra en el mandril del microtomo con el extremo cónico que sobresale aproximadamente 5-6 mm del mandril. Bloquee en su lugar con el tornillo de ajuste y colóquelo debajo de una lámpara de calor.
  2. Después de varios minutos, el bloque será maleable y fácil de recortar. Coloque el mandril en el soporte del estereomicroscopio y use una nueva cuchilla de afeitar de doble filo para hacer secciones delgadas paralelas a la cara del bloque hasta que el tejido sea visible. Esto se ve mejor mediante la pesca con caña de luz a través de la cara del bloque, la muestra de tejido será menos reflectante y granular en comparación con las porciones de la resina que están desprovistas de tejido. Consulte la fotografía tomada de muestras de tejido antes de la introducción de resina saturada de negro de carbono para tener una idea de cómo y dónde se encuentra el tejido.
  3. Reserve un soporte de pasador de muestra para fines de recorte. Este soporte de pasador nunca se coloca en la cámara SEM y, por lo tanto, se puede manipular sin guantes, esto se denominará soporte de pasador de recorte. Cualquier soporte de muestra destinado a ser colocado en la cámara de imágenes nunca debe ser tocado sin guantes. Esto evita la introducción de grasa y aceite en la cámara del microscopio.
  4. Coloque un pasador de aluminio en el soporte del pasador de recorte y apriete ligeramente el tornillo de ajuste con la cara (superficie plana) del pasador sostenido 3-4 mm por encima del soporte del pasador.
  5. Haga varios arañazos profundos y entrecruzados en la cara del pasador para proporcionar un área de superficie más grande para el pegamento utilizado para mantener la muestra en su lugar. Si se utiliza un pasador de aluminio, se recomienda un pequeño destornillador de cabeza plana de acero para este paso (Figura 2B).
  6. Coloque el mandril que contiene la muestra de tejido de nuevo debajo de la lámpara de calor hasta que la resina se vuelva suave y maleable, luego colócalo en el receptáculo del mandril debajo del estereomicroscopio.
  7. Usar una cuchilla de afeitar de doble filo para recortar el exceso de resina de la porción del bloque de resina que contiene la muestra de tejido. En última instancia, el tamaño del bloque de tejido unido al pasador será de aproximadamente 3 mm de diámetro y 2-3 mm de altura.
    1. Empuje cuidadosamente la maquinilla de afeitar hacia abajo en el bloque de resina aproximadamente 1-2 mm, luego empuje cuidadosamente la maquinilla de afeitar horizontalmente en el bloque de resina a una profundidad igual al corte anterior. Haga esto lentamente y con mucho cuidado, ya que es posible dañar o cortar la parte del bloque que contiene la muestra de tejido. A medida que los dos cortes se encuentran, el exceso de resina se separará del bloque. Continúe eliminando la resina hasta que solo quede un área elevada de 3 mm x 3 mm.
  8. Después de este recorte inicial, coloque el bloque (todavía en el mandril) debajo de la lámpara de calor durante varios minutos.
  9. Una vez que la resina se vuelve suave y maleable, coloque el bloque de nuevo debajo del estereomicroscopio. Usando una nueva cuchilla de afeitar de doble filo, corte la parte superior del bloque de resina, aproximadamente 1 mm por debajo de la porción recortada, con un solo corte liso. Una superficie plana es preferible, ya que esta se pegará al pasador de la muestra. Tenga cuidado de no permitir que la muestra se pierda, ya que este paso requiere cierta fuerza que puede transferirse a la parte eliminada del bloque y hacer que se aleje volando. Coloque la muestra cortada y recortada a un lado.
  10. Coloque el soporte del pasador de recorte que contiene el pasador de aluminio cortado en el receptáculo del estereomicroscopio. Aplique una capa delgada de pegamento de cianocrilato a la cara del alfiler de tal manera que cubra completamente el alfiler sin formar un menisco visible. Recoja la pieza recortada del bloque de tejido con fórceps y colótela en la cara del pasador. Centre la muestra de tejido en el pasador de la muestra. Empúrtelo hacia abajo y mantenlo presionado durante varios segundos. Deje que el pegamento se establezca durante varios minutos.
  11. Cuando el pegamento esté completamente seco, coloque el soporte del pasador de recorte de nuevo debajo del estereomicroscopio. Usando un archivo fino, archivar el exceso de resina para que ninguna resina sobresalga del pasador. La forma de la resina debe parecerse a la cabeza circular del perno.
  12. Localice el tejido en la porción elevada de su bloque de resina, la iluminación oblicua es útil para esto. Utilizando una maquinilla de afeitar de doble filo, la parte elevada de la resina que contiene la muestra de tejido deberá recortarse a una superficie no superior a 1 mm2. Si es posible, la cara del bloque se puede recortar aún más pequeño, esto reducirá el estrés en el cuchillo de diamante y mejorará su longevidad.
    1. Retire la mayor cantidad posible de resina sobrante, dejando el bloque ligeramente más largo en una dimensión. Esto se hace lentamente y con cuidado, ya que es posible que la resina que contiene la muestra de tejido se rompa si se aplica demasiada fuerza. Aunque se recomienda una maquinilla de afeitar, se puede usar un archivo de metal fino para este paso.
  13. Con un ángulo de archivo de metal fino el exceso de resina, en el área fuera de la porción elevada que contiene la muestra de tejido, hacia abajo hacia el borde del pasador (Figura 2C).
  14. Retire las partículas de resina y el polvo de la muestra preparada antes de aplicar pintura de plata seguida de pulverización de oro. Mezcle la plata con acetona para que sea un líquido fácilmente untable, similar al esmalte de uñas (pero no tan delgado que gotea del aplicador) y aplique una capa delgada a toda la superficie del bloque de muestra. La acetona se evapora rápidamente, por lo que puede ser necesario agregar acetona adicional a medida que la pintura plateada comienza a espesar.
    1. Deje que la pintura de plata se seque durante la noche antes de cargarla en el microscopio.
      NOTA: Esta capa de plata debe ser delgada para evitar expandir la cara del bloque más allá de 1 mm x 1 mm, y aunque la pintura de plata nunca ha dañado el cuchillo de diamante, todavía se recomiendan caras de bloque más pequeñas para preservar la longevidad del cuchillo de diamante. La acetona mezclada con la plata debe evaporarse por completo antes de pulverizar el oro o cargar la muestra en el microscopio para evitar la introducción de vapor de acetona en la cámara de imágenes.
    2. Después de la aplicación de pintura de plata, aplique una capa delgada de oro al bloque de muestra. Utilizando un dispositivo de pulverización al vacío estándar equipado con un objetivo de lámina de oro estándar, una presión de cámara de 200 miliTorr (gas argón) y 40 miliamperios que se ejecutan durante 2 minutos dará como resultado un recubrimiento de oro de 20 nm de espesor.
  15. Después del recubrimiento, coloque el bloque montado y recortado en un tubo con la etiqueta de experimento apropiada adjunta. Cree tubos personalizados utilizando pipetas de transferencia desechables.
    1. Corte la pipeta de transferencia justo debajo de la bombilla, dejando una breve porción del tubo de la pipeta de transferencia conectada debajo del extremo bulboso. Acorte la porción tubular que se cortó y corte la punta de la pipeta lo suficiente como para que el pasador de la muestra de aluminio se pueda empujar acurrucar dentro de ella.
    2. Coloque el extremo que contiene el pasador de la muestra de aluminio dentro del extremo bulboso de la pipeta de transferencia modificada.
  16. Antes de cargar un bloque de tejido preparado, recorte cuidadosamente el exceso de pintura de plata de la superficie de la cara del bloque.

3. Configuración de SEM para obtener imágenes de la cara de bloque

NOTA: Los ajustes de imagen que siguen se produjeron en el dispositivo utilizado por los autores, que se enumera en la Tabla de materiales proporcionados. Si bien este dispositivo es capaz de obtener imágenes de presión variable, los mejores resultados se capturaron bajo alto vacío.

  1. Tiempo de permanencia: Usa 12 μs/px durante el seccionamiento en serie. Cuando se ha identificado una región de interés, se puede adquirir una imagen de mayor resolución a 32 μs/px.
  2. Configuración de vacío: Utilice una presión de la pistola de 9e-008 Pa, una presión de columna de 1.1e-004 Pa y una presión de cámara de 9.5e-002 Pa.
  3. Tiempo de captura: Con la configuración anterior, captura una pila de imágenes de 2048x2048 px a una velocidad de 50 segundos por imagen. Las imágenes de mayor resolución de las regiones de interés se pueden capturar a 4096x4096 px a poco menos de 9 minutos por imagen.
  4. Espesor de la sección: Utilice 100-200 nm. Menos es posible, pero puede requerir menor voltaje del haz, intensidad o tiempo de permanencia.
  5. Alto voltaje (HV): Utilice 7-12 kV. Si bien el aumento del voltaje reduce el tamaño del punto y aumenta la resolución, introduce más posibilidades de daño del haz. Un kV más alto aumenta la penetración del haz, lo que resulta en la pérdida de detalles. Sin embargo, bajar el kV degrada la relación señal/ruido(Figura 3)14.
  6. Intensidad del haz (BI): El dispositivo SBF-SEM del autor ofrece una escala de intensidad de haz que oscila entre 1 y 20. En esta escala, los valores de 5-7 dan imágenes de calidad sin carga excesiva y daños en el haz. Cuanto mayor sea el BI mayor será la resolución sin embargo, hay más posibilidades de carga y daño del haz14.
  7. Tamaño de punto y ampliación de la imagen: Determine el tamaño del punto por la intensidad del haz y el nivel de voltaje. Idealmente, el tamaño de punto no debe ser mayor que el tamaño de píxel utilizado. El tamaño de píxel se determina dividiendo el campo de visión (FOV) por el número de píxeles. Por ejemplo, un campo de servicio de 25 μm con un tamaño de imagen de 2048x2048 px daría 12,2 nm por píxel. Por lo tanto, el tamaño del punto no debe ser superior a 12,2 nm. La Figura 4 muestra cómo se relacionan el HV, bi y el tamaño del punto.
  8. Distancia de trabajo (WD) - Con la proyección de imagen de la cara del bloque la distancia de trabajo no es ajustable. Es simplemente un factor de enfoque. Será casi idéntico para todos los bloques con imágenes. Si bien la distancia de trabajo no es ajustable, juega un papel crítico en la resolución de la imagen capturada. A medida que disminuye la distancia de trabajo, aumenta el límite de resolución de las imágenes capturadas. En algunos casos puede ser posible disminuir la distancia de trabajo haciendo modificaciones dentro de la cámara de imágenes, sin embargo, estas modificaciones deben hacerse a discreción del usuario. Con el fin de disminuir la distancia de trabajo y aumentar la resolución de la imagen, aflojamos los tornillos del microtome de montaje de la puerta y reposicionamos el microtome para que descansara ~ 2 mm más cerca del detector de haz después de volver a apretar los tornillos.
  9. Resolución : con la configuración anterior, es posible una resolución x & y tan alta como 3.8 nm. Es importante tener en cuenta que la resolución está limitada por el tamaño del punto del haz, así como por la resolución de píxeles de las capturas de imagen (por ejemplo, un campo de visión de 20 μm capturado en una imagen de píxeles de 2048x2048 tiene una resolución de píxeles de 9,8 nm, incluso si se utilizó un tamaño de punto de 3,8 nm). La resolución de la imagen en el plano z depende del espesor de seccionamiento, encontramos que 100-200 nm funciona bien con este protocolo.

Resultados

Córnea del ratón
Este protocolo se ha aplicado extensivamente a la córnea del ratón. Usando proyección de imagen de SBF-SEM una red de paquetes elastino-libres de la microfibrrilla (EFMBs) fue mostrado para estar presente dentro de la córnea adulta del ratón. Se creía previamente que esta red sólo estaba presente durante el desarrollo embrionario y postnatal temprano. SBF-SEM reveló una extensa red EFMB en toda la córnea, con fibras individuales encontradas para ser 100-200 nanómetro de di...

Discusión

El propósito de este papel de los métodos es destacar la preparación del tejido y la metodología de la proyección de imagen que ha permitido que nuestro laboratorio capture confiablemente imágenes seriales de alta resolución de la microscopia electrónica, y señalar los pasos críticos que llevan a este resultado así como las trampas potenciales que pueden ocurrir al conducir proyección de imagen de SBF-SEM. El éxito en el uso de este protocolo requiere la fijación adecuada del tejido, la impregnación de met...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Nos gustaría agradecer al Dr. Sam Hanlon, Evelyn Brown y Margaret Gondo por su excelente asistencia técnica. Esta investigación fue apoyada en parte por los Institutos Nacionales de la Salud (NIH) R01 EY-018239 y P30 EY007551 (Instituto Nacional del Ojo), en parte por la Fundación del León para la Vista, y en parte por nih 1R15 HD084262-01 (Instituto Nacional de Salud Infantil y Desarrollo Humano).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
1/16 x 3/8 Aluminum RivetsIndustrial Rivet & Fastener Co.6N37RFLAP/1100Used as specimen pins.
2.5mm Flathead ScrewdriverWiha Quality Tools27225
AcetoneElectron Microscopy SciencesRT 10000Used to dilute silver paint.
Aspartic AcidSigma-AldrichA8949
Calcium ChlorideFisherScientificC79-500
Conductive Silver PaintTed Pella16062
Denton Desk-II Vacuum Sputtering Device equipped with standard gold foil targetDenton VacuumN/AThis is the gold-sputtering device used by the authors, alternates are acceptable.
Double-edged RazorsFisher Scientific50-949-411
Embed 812Electron Microscopy Sciences14120
Gatan 3View2 mounted in a Tescan Mira3 Field emission SEMGatan & TescanN/AThis is the SBF-SEM device used by the authors, alternates are acceptable.
Glass Shell Vials, 0.5 DRAM (1.8 ml)Electron Microscopy Sciences72630-05
GluteraldehydeElectron Microscopy Sciences16320
Gorilla Super Glue - Impact ToughNANARefered to as cyanoacrylate glue in text.
Ketjen BlackHM RoyalEC-600JDRefered to as carbon black in text.
KOHFisherScientific18-605-593
Lead NitrateFisher ScientificL62-100
MicrowavePelcoBioWave ProThis is the microwave used by the authors, alternates are acceptable.
Osmium TetroxideSigma-Aldrich201030
Potassium FerrocyanideSigma-AldrichP9387
Silicone Embedding MoldTed Pella10504
Sodium Cacodylate TrihydrateElectron Microscopy Sciences12300
Samco Transfer PipetteThermoFisher Scientific202Used to make specimen pin storage tubes.
Swiss Pattern Needle FilesElectron Microscopy Sciences62115
ThiocarbohydrazideSigma-Aldrich223220
Uranyl AcetatePolysciences, Inc.21447-25
Reconstruction Software
Amira SoftwareThermo ScientificN/AUsed to create the reconstructions found in figures 5-7 and 9.
Fiji (Fiji is Just ImageJ)ImageJ.netN/ATrakEM2 can be added to Fiji to asist in manual segmentation.
Microscopy Image Browser (MIB)University of Helsinki, Institute of BiotechnologyN/A
Reconstuct SoftwareNeural Systems LabN/A
SuRVoS WorkbenchDiamond Light Source & The University of NottinghamN/A
SyGlassIstoVisio, Inc.N/AAllows for reconstruction in virtual reality and histogram-based reconstruction methods.

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