التوصيل التجسيمي داخل الجمجمة للمواد الكيميائية أو البروتينات أو النواقل الفيروسية لدراسة مرض باركنسون

Summary

نصف كيفية حقن المحاليل بنجاح في مناطق معينة من الدماغ من القوارض باستخدام إطار تجسيم. جراحة البقاء على قيد الحياة هذه هي طريقة راسخة تستخدم لتقليد الجوانب المختلفة لمرض باركنسون.

Abstract

مرض باركنسون (PD) هو اضطراب تدريجي يعرف تقليديا بالرعاش أثناء الراحة وعدم الحركة ، ويرجع ذلك أساسا إلى فقدان الخلايا العصبية الدوبامينية في المادة السوداء. تظهر مناطق الدماغ المصابة شوائب ليفية داخل الخلايا العصبية تتكون بشكل أساسي من بروتينات ألفا سينوكلين (asyn). لم يلخص أي نموذج حيواني حتى الآن جميع خصائص هذا المرض. هنا ، نصف استخدام الحقن التجسيمي لتوصيل المواد الكيميائية أو البروتينات أو النواقل الفيروسية داخل الجمجمة من أجل تقليد الجوانب المختلفة لمرض باركنسون. هذه الأساليب راسخة وتستخدم على نطاق واسع في جميع أنحاء مجال PD. الحقن التجسيمية مرنة بشكل لا يصدق. يمكن تعديلها في التركيز وعمر المستخدم للحقن ومنطقة الدماغ المستهدفة وفي الأنواع الحيوانية المستخدمة. تسمح مجموعات المواد بإجراء اختلافات سريعة لتقييم العلاجات أو تغيير شدة علم الأمراض أو العجز السلوكي. عن طريق حقن السموم في الدماغ, يمكننا تقليد الالتهاب و/أو فقدان شديد للخلايا العصبية الدوبامين مما أدى إلى أنماط ظاهرية حركية كبيرة. يمكن استخدام النواقل الفيروسية لنقل الخلايا لتقليد الجوانب الجينية أو الميكانيكية. أفضل لخص حقن الليفية الليفية المضغوطة للنمط الظاهري التدريجي على مدى فترة طويلة من الزمن. بمجرد إنشاء هذه الطرق ، قد يكون من الاقتصادي إنشاء نموذج جديد مقارنة بإنشاء خط جديد معدل وراثيا. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة كثيفة العمالة لأنها تتطلب 30 دقيقة إلى أربع ساعات لكل اعتمادا على الطراز المستخدم. سيكون لكل استهداف مختلف قليلا ، وبالتالي إنشاء مجموعة متنوعة والتي من ناحية قد يكون من الصعب تفسير النتائج منها ؛ من ناحية أخرى ، ساعد في تقليد تنوع أكثر واقعية موجود في المرضى. يمكن التعرف على التي تم استهدافها بشكل خاطئ باستخدام قراءات سلوكية أو تصويرية ، أو فقط بعد التضحية بها مما يؤدي إلى حجم مجموعة أصغر بعد الانتهاء من الدراسة بالفعل. بشكل عام ، هذه الطريقة هي طريقة بدائية ولكنها فعالة لتقييم مجموعة متنوعة من جوانب مرض باركنسون.

Introduction

مرض باركنسون (PD) هو مرض تنكسي عصبي تدريجي شائع نسبيا يصيب ما يصل إلى 1٪ من الأشخاص الذين تزيد أعمارهم عن 60¹. مرض باركنسون غير متجانس ولكنه يتميز سريريا بشكل أساسي بأعراض حركية بما في ذلك الرعاش أثناء الراحة ، وبطء الحركة ، والحركة الحركية ، والصلابة ، واضطراب المشي ، وعدم استقرار الوضعية. تظهر غالبية الأعراض الحركية عادة عندما يتم فقدان 60-70٪ من الدوبامين المخطط (DA) نتيجة للتنكس العصبي التدريجي والمتميز في المادة السوداء (SN) بارس كومباكتا^2،3. تحتوي الخلايا العصبية الدوبامينية الباقية على شوائب داخل الخلايا تعرف باسم أجسام ليوي⁴. تتكون هذه المجاميع بشكل أساسي من ألفا سينوكلين (أسين) ، وهو بروتين صغير ولكنه معبر عنه بدرجة عالية في الخلايا العصبية في^{الدماغ 5}.

لا تزال الآلية الكامنة وراء التنكس العصبي في مرض باركنسون غير معروفة. الشيخوخة لا تزال أكبر عامل خطر لهذا الاضطراب⁶. علاوة على ذلك ، فإن البشر هم النوع الوحيد الذي يتطور مرض باركنسون بشكل طبيعي. لذلك ، من أجل التحقيق في أمراض باركنسون واختبار أدوية جديدة لمنع تطور المرض ، تم تطوير مجموعة واسعة من النماذج الحيوانية⁷. من الناحية المثالية ، يجب أن تظهر النماذج الحيوانية لمرض باركنسون فقدانا تدريجيا يعتمد على العمر للخلايا العصبية DA في SN ، مصحوبا بشوائب داخل الخلايا متبوعا بخلل وظيفي حركي وتكون مستجيبة للعلاجات البديلة ل DA. لا يلخص أي من النماذج الحيوانية المتاحة حاليا جميع الأعراض السريرية وأمراض مرض باركنسون. نظرا لأن كل نموذج يقدم جوانب مختلفة من المرض ، فمن المهم التفكير بعناية في النموذج المناسب لاستخدامه في تجربة بناء على الأسئلة المطروحة.

تاريخيا ، كانت النماذج الحيوانية تستند إلى المواد السامة ، بما في ذلك 6-هيدروكسي دوبامين (6-OHDA) و 1-ميثيل -4-فينيل -1،2،3،6-رباعي هيدروبيريدين (MPTP) ، والمبيدات الحشرية ، مثل روتينون وباراكوات⁸. كل مادة سامة لها آلية عمل مختلفة وتتراوح من الخلايا العصبية DA الخاصة إلى الضارة بشكل عام بخلايا الدماغ. السموم يمكن أن تعطى إما عن طريق الفم, حقن داخل الصفاق أو مباشرة في الدماغ باستخدام الحقن التجسيمية اعتمادا على نفاذية حاجز الدم في الدماغ. على عكس النماذج الأخرى ، تضمن نماذج السموم درجة عالية من فقدان الخلايا الدوبامينية nigrostriatal والأنماط الظاهرية السلوكية. قد تظهر بعض النماذج مع علم الأمراض الدقيق. تجعل هذه الميزات نماذج باركنسون السمية أداة رائعة لدراسة العلاجات البديلة وتأثيرات السموم البيئية على بداية مرض باركنسون^9،10.

بالإضافة إلى ذلك ، تم إنشاء العديد من نماذج الفئران المعدلة وراثيا باستخدام مجموعة متنوعة من المروجين والجينات ذات الصلة بمرض^{باركنسون 11}. تعاني معظم الفئران من أمراض nigrostriatal ولكن بدون دليل واضح على التنكس العصبي. تتميز النماذج المعدلة وراثيا بكونها متسقة بين والأفواج ، وبمجرد إنشائها يسهل صيانتها وتوزيعها. على الرغم من أنها لا تؤدي إلى التنكس العصبي ، إلا أنها نماذج مفيدة للتحقيق في التغيرات الخلوية التي تسببها المتغيرات الجينية والأدوية المرشحة المحتملة في نظام مجمع في الجسم الحي¹².

على عكس النماذج المعدلة وراثيا ، فإن التعبير بوساطة النواقل الفيروسية للجينات المرتبطة بمرض باركنسون يوفر نهجا أكثر مرونة¹³. تسمح الحقن التجسيمية باختيار مناطق مختلفة من الدماغ وأنواع الخلايا ومستويات التعبير لمجموعة واسعة من الأنواع الحيوانية مثل الفئران والجرذان والخنازير والرئيسيات غير البشرية. في البداية ، تم استخدام النواقل الفيروسية المؤتلفة التي تشفر ل asyn لتحويل الخلايا العصبية الموجودة في SN للفئران. يسبق تراكم البروتين والخلل الخلوي فقدان الخلايا الدوبامين التدريجي مما يؤدي إلى عجز سلوكي. يمكن أن تؤدي الاختلافات في الاستهداف إلى تباين كبير في فقدان الخلايا بين (30-80٪) ، وهو المسؤول عن العجز السلوكي المتغير الذي شوهد في ما يقرب من 25٪ فقط من الفئران المحقونة¹⁴.

النموذج الذي تم إنشاؤه مؤخرا هو الحقن داخل الجمجمة للألياف التجسيدية مسبقة التشكيل (PFFs) أو المستخلصات المجمعة من أنسجة دماغ الفأر أو المريض^15،16. تشير دراسات متعددة إلى أن حقن PFFs أو المستخلصات يؤدي إلى انتشار أمراض asyn على نطاق واسع في دماغ بالإضافة إلى فقدان الخلايا العصبية الدوبامينية في SN. يظهر تراكم asyn داخل الخلايا العصبية التي تغذي المنطقة المحقونة. على عكس النماذج القائمة على النواقل الفيروسية ، يتطور نموذج PFF ببطء على مدى عدة أشهر متبوعا بعجز حركي في 6 أشهر. هذا النموذج لديه إمكانات كبيرةلدراسة آلية أو الوقاية من علم الأمراض asyn^17،18.

تم تأسيس جميع النماذج المذكورة أعلاه واستخدمت عدة مرات لدراسة جوانب مختلفة من الاضطراب البشري. لعبت الحقن التجسيمي للمواد مباشرة في الدماغ دورا كبيرا في تطوير هذه النماذج الحيوانية ليس فقط في مجال مرض باركنسون ولكن أيضا في الاضطرابات العصبية الأخرى. في حين أنها تتطلب عمالة مكثفة ، إلا أن الجراحة التجسيمية لها مزايا كونها مرنة للغاية في عمر المستخدمة ، ومنطقة الدماغ المستهدفة والمواد المحقونة ، ويمكن تعديلها اعتمادا على سؤال البحث المطروح. على سبيل المثال ، يمكن حقن المواد منفردة أو مجتمعة (ناقل + ألياف أو مادة سامة + ناقل) لتلخيص المزيد من جوانب المرض أو تقييم^{العلاجات 19،20}. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن حقن المواد من جانب واحد تاركا الجانب غير المحقون كعنصر تحكم داخلي لتقييم السلوك وكذلك التنكس العصبي. لذلك ، ستحدد هذه المخطوطة خطوات مفصلة لإنشاء نماذج PD باستخدام الحقن التجسيمية.

Protocol

أجريت جميع التجارب في هذه الدراسة بما يتفق بدقة مع التوصيات الواردة في دليل رعاية واستخدام المختبر التابع للمعاهد الوطنية للصحة ووافقت عليها لجان رعاية واستخدامه التابع للمعهد الوطني الأمريكي للشيخوخة.

قبل البدء ، يرجى التأكد من حصولك على التدريب المناسب والموافقة الأخلاقية اللازمة من معهدك لتنفيذ هذا الإجراء. بالإضافة إلى ذلك ، يجب الحصول على التخدير (على سبيل المثال ، الكيتامين والبوبرينورفين ، أو الفنتانيل والميديتوميدين) المستخدمة والتعامل معها وفقا للقواعد ذات الصلة لمؤسستك.

1. التحضير (المدة 1 ساعة)

1. أحضر إلى غرفة الجراحة واتركها تتأقلم أثناء إعداد منطقة الجراحة. ارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE).
   ملاحظة: يمكن أن يعتمد هذا على لوائح السلامة المحلية والمواد المحقونة. تحتاج النواقل الفيروسية في الغالب إلى معدات الوقاية الشخصية من المستوى 2 للسلامة البيولوجية. بشكل عام ، ارتد على الأقل قناعا وقفازات ومعطف مختبر يمكن التخلص منه. في ظروف معينة ، يجب استخدام قفازات ونظارات واقية إضافية.
2. عقم الأدوات الجراحية باستخدام الأوتوكلاف أو معقم الخرز الزجاجي. بالنسبة للقوارض ، تحتاج إلى مقبض مشرط ، ملقط مرقئ ، ملاقط دومون ، ملقط منحني ، طقم إغلاق الجرح (مشابك) أو مقص وملقط (للخيوط) ورأس حفر.
3. قم بتطهير المنطقة الجراحية وأداة التجسيم بنسبة 70٪ من الإيثانول ، وقم بتغطية المنطقة المجاورة للأداة التجسيمية إما بمناشف ورقية نظيفة أو ورقة ماصة معقمة.
4. ضع ما يلي على المناشف: قطرات العين (على سبيل المثال ، Liquigel) ، ماكينة تشذيب الشعر ، مسحات قطنية ، يوديكسانول مخفف ، شفرة جراحية يمكن التخلص منها ، مثقاب جراحي مع مثقاب مطهر ، قلم تحديد أو مقص أذن ، H₂O معقم في أنبوب 1.5 مل ، أنبوب 1.5 مل مع 3٪ H₂O₂ في H₂O معقم (1.35 مل من H₂O + 0.15 مل من 30٪ H₂O_{2 ،} محضرة حديثا) ، حقنة سعة 1 مل مع إبرة 33G و PBS معقمة أو محلول ملحي ، حقنة مع مسكن وتراق إذا تم استخدام التخدير عن طريق الحقن (على سبيل المثال ، أتيباميزول + بوبرينورفين / كيتوبروفين ؛ محضرة حديثا ومعتمدة في التصريح الأخلاقي) وأدوات جراحية معقمة.
5. املأ الأيزوفلوران وتحقق من ضغوط O₂ و N₂ ، إذا كنت تستخدم التخدير بالغاز. أضف منشفة ورقية إلى قاع حجرة الاستنشاق لإبقائها جافة ونظيفة.
   امزج وحضر المخدر حديثا (على سبيل المثال ، الفنتانيل + ميديتوميدين (للفئران) أو محلول الكيتامين + الزيلازين (للفئران)) في حالة استخدام التخدير عن طريق الحقن وإذا تمت الموافقة عليه في التصريح الأخلاقي.
6. قم بتجميع حقنة هاملتون الزجاجية والشعرية الزجاجية (الشكل 1 أ 1.).
   1. ضع الشعيرات الدموية الزجاجية المسحوبة على الطاولة. ضع إصبعك السبابة حيث تصبح الشعيرات الدموية أرق مع نهاية الظفر حيث يجب قطع الشعيرات الدموية.
      ملاحظة: اعتمادا على عمق الحقن الخاص بك في أي مكان بين 0.5 - 2 سم.
   2. استخدم حافة بلاط السيراميك لخدش جزء الإبرة بعناية عدة مرات. خذ شعيرات دموية زجاجية بيد واحدة واستخدم إصبعك الإبهامي والسبابة للاستيلاء على جزء الإبرة الرفيع. اسحب من المنتصف حتى النهاية حتى تنفصل الإبرة بصراحة.
      ملاحظة: إذا لم ينجح الأمر أو انفصلت الإبرة عن الحواف ، كرر ذلك عدة مرات. إذا كان لا يزال لا ينكسر ، كرر خدش البلاط. تأكد من أن جزء الإبرة ليس رقيقا جدا (قطره >50 ميكرومتر) ولا ينحني بسهولة.
7. أغلق الشعيرات الدموية الزجاجية لحقنة هاميلتون.
   1. قم بتوصيل أنبوب الانكماش 1 سم فوق الإبرة المعدنية الحادة المتصلة بحقنة هاميلتون الزجاجية. ثم ضع الطرف السميك من الشعيرات الدموية الزجاجية فوق إبرة هاميلتون المعدنية.
   2. ضع الأنابيب المتقلصة على نصف الشعيرات الدموية الزجاجية ، مما يضمن مسافة لا تقل عن 1 سم بين نهاية إبرة هاميلتون المعدنية والانتقال المخروطي للشعيرات الدموية. ستكون هذه هي المساحة التي تحتوي على الحل القابل للحقن المطلوب لاحقا.
   3. استخدم ولاعة أو عود ثقاب لتسخين أنبوب الانكماش وإغلاق إبرة الحقن.
      ملاحظة: هناك العديد من خيارات الحامل المختلفة التي تسمح لك بتثبيت حقنة هاميلتون على الذراع التجسيمي على اليسار. تأكد من أنه لا يزال بإمكانك قراءة الأرقام الموجودة على حقنة هاميلتون. إذا كنت تستخدم مضخة لحقن المحلول، فقم بتوصيل المضخة بالذراع التجسيمي وقم بتثبيت حقنة هاميلتون على المضخة.
8. قم بإزالة المكبس المعدني. أدخل إبرة 27G متصلة بحقنة سعة 1 مل مملوءة بالمحلول الملحي أو PBS في الجزء العلوي من حقنة هاميلتون. اغسل حقنة هاميلتون باستخدام PBS للتحقق مما إذا كانت محكمة الغلق وطرد جميع فقاعات الهواء.
   ملاحظة: سوف تزعج فقاعات الهواء تناول المحلول وحقنه حيث يضغط الهواء أكثر من السائل.
9. بمجرد فحص كل شيء وجاهزه ، افتح المسمار الصغير الموجود على ذراع المحور z (الشكل 1 أ 2.) للأداة التجسيمية وقم بتدوير الذراع بزيادات 90 درجة في اتجاه عقارب الساعة لتحريك المحقنة الزجاجية / الشعيرات الدموية بعيدا عن الطريق (لتجنب كسر الشعيرات الدموية أثناء تثبيت على الأداة التجسيمية).
   ملاحظة: تحقق من ضبط جميع زوايا وإعدادات التجسيم على المعلمات المطلوبة (عادة 0 درجة) ، ويتم ضبط قضيب الأسنان وقضبان الأذن على الإحداثيات المطلوبة وأن تكون حقنة هاميلتون / الشعيرات الدموية كلها مستقيمة.
10. قم بتشغيل وسادة الحرارة على منصة الترقيم ، باستخدام حشوة إضافية في الأعلى إذا كانت دافئة جدا. ضع قفصا فارغا ونظيفا مع وسادة حرارية إضافية بجوار منطقة الجراحة.

2. الجراحة (متوسط المدة 1 ساعة لكل)

1. للتخدير بالغازات
   1. قم بتشغيل الأيزوفلوران إلى 5٪ مع تدفق هواء N₂ + O₂ (حوالي 1 لتر / دقيقة) وافتح الصمامإلى غرفة الاستنشاق. ضع في الغرفة وتأكد من إغلاقه جيدا. راقب التنفس حتى يتباطأ بشكل كبير (التنفس العميق).
   2. بمجرد أن يفقد الوعي ، افتح الصمام على أداة التجسيمية وأغلق صمام الغرفة. اضبط الأيزوفلوران على 2٪.
   3. افتح الغرفة وأخرج الذي يمسكها عند الرقبة ، وافتح فمه بالملقط وضع على قضيب الأسنان (الشكل 1 أ 6.) مع تركيب الأسنان العلوية الأمامية في الحفرة.
      ملاحظة: هذه الخطوة حساسة للوقت حيث يمكن للحيوان أن يستيقظ مرة أخرى عن طريق عدم استنشاق الأيزوفلوران.
   4. ضع مخروط الأنف فوق الخطم وراقب التنفس لضمان إيقاع ثابت دون التنفس القسري. تأكد من تخدير بعمق عن طريق التحقق من عدم وجود ردود أفعال سحب الدواسة للأطراف الخلفية قبل المتابعة.
      ملاحظة: استمر في التحقق طوال الإجراء حتى لا يتوقف عن التنفس أو يستيقظ. إذا لزم الأمر، اضبط النسبة المئوية للأيزوفلوران بزيادات صغيرة. لاختبار منعكس انسحاب الدواسة للأطراف الخلفية ، استخدم زوجا من الملقط واضغط على المخلب الخلفي. إذا قام بسحب الطرف (رد الفعل لإزالة محفزات الألم) ، يكون التخدير منخفضا جدا.
   5. ثبت رأس في مكانه باستخدام قضيتي الأذن (الشكل 1 أ 7.). عند القيام بذلك بشكل صحيح ، يجب أن تشير الأذنين بشكل جانبي فوق قضبان الأذن. إذا كان الرأس لا يزال يتحرك ، فاضبط قضبان الأذن أو مخروط الأنف لتثبيت الرأس بشكل أكثر إحكاما في مكانه.
      ملاحظة: كن لطيفا لتجنب كسر طبلة أذن عن طريق إدخال قضبان الأذن بعمق كبير. تميل الفئران إلى الوميض عند إدخال قضيب الأذن بشكل صحيح.
2. للتخدير عن طريق الحقن:
   1. حقن بجرعة مناسبة / موصى بها من التخدير (300 ميكروغرام / كجم من الفنتانيل و 300 ميكروغرام / كجم ميديتوميدين للفئران ؛ 100 مجم / كجم كيتامين و 10 مجم / كجم زيلازين للفئران) ووضعه مرة أخرى في القفص المنزلي.
   2. افحص ردود أفعال سحب دواسة بعد 5 دقائق من الحقن. في حالة غيابه ، قم بتثبيت رأس في مكانه باستخدام قضيتي الأذن (الشكل 1 أ 7.). عند القيام بذلك بشكل صحيح ، يجب أن تشير الأذنين بشكل جانبي فوق قضبان الأذن. بعد ذلك ، ضع على قضيب الأسنان (الشكل 1 أ 6.) وقم بلف الرافعة. إذا كان الرأس لا يزال يتحرك ، فاضبط قضبان الأذن أو مخروط الرافعة لتثبيت الرأس بإحكام في مكانه.
      ملاحظة: من الممكن كسر طبلة الأذن عند إدخال أغطية الأذن بعمق شديد. لا تقم بربط الرافعة بإحكام شديد. يمكن أن يكسر أنف.
   3. إذا لوحظت ردود أفعال سحب الدواسة ، فانتظر 5-10 دقائق أخرى. إذا كان لا يزال لوحظ ، فقم بحقن 10٪ أخرى من التخدير السابق.
      ملاحظة: قم بزيادة جرعة التخدير ببطء مع فترة انتظار بينهما لتجنب موت بسبب الاختناق.
   4. تأكد من أن الجمجمة مسطحة عن طريق ضبط ارتفاع شريط الأسنان و / أو شريط الأذن.
      ملاحظة: كن حذرا أثناء ضبط القضبان لأن الرأس سيغير الزاوية ويمكن لمخروط الأنف / ذراع الأنف أن يكسر أنف.
3. ضع قطرات العين على كل عين (على سبيل المثال ، Liquigel) لتجنب جفافها أثناء الجراحة. حلق رأس من العينين إلى الأذنين.
4. تطهير المنطقة الجراحية باستخدام 10٪ يودوبوفيدون. بالإضافة إلى ذلك ، قم بحقن مخدر موضعي (على سبيل المثال ، 0.5٪ ليدوكائين) داخل الجلد في موقع الشق. يوصى بالانتظار لمدة 2-3 دقائق حتى تعمل قبل المتابعة.
5. باستخدام المشرط ، قم بعمل شق واحد مستمر من بين العينين إلى بين الأذنين.
   ملاحظة: احرص على عدم التقليص بعيدا لأن قطع عضلات الرقبة سيعقد الشفاء.
6. استخدم أطراف القطن لفتح الجرح وتنظيف المنطقة من الدم. بالنسبة للفئران ، استخدم ملقط مرقئ لإبقاء الجرح مفتوحا ، عن طريق تثبيته في الأنسجة تحت الجلد وتركه يتدلى على كل جانب. بالنسبة للفئران ، إذا لزم الأمر ، استخدم مقاطع صغيرة.
   ملاحظة: هذا هو الجزء الأكثر إيلاما في الإجراء. سيؤدي تثبيت الأنسجة تحت الجلد بدلا من الجلد إلى زيادة الشفاء.
7. حرك المحقنة / الشعيرات الدموية (الشكل 1 أ 1.) 180 درجة عكس اتجاه عقارب الساعة على المحور z (الشكل 1 أ 2.) وضعه فوق رأس. تأكد من إغلاق المقبض تماما حتى لا يتذبذب ذراع المحور z أثناء الجراحة.
8. استخدم المجهر والمقابض الموجودة على كل ذراع تجسيمي (الشكل 1 أ 3.-5) لتحريك الطرف الحاد للشعيرات الدموية الزجاجية (المرفقة بحقنة زجاجية هاميلتون. الشكل 1 أ 1.) مباشرة فوق بريجما (لمس العظم ولكن لا يضغط عليه). اضبط جميع القيم على الشاشة الرقمية على الصفر (الشكل 1 أ 8.).
   ملاحظة: بريجما (الشكل 1 ب) هي النقطة التي تلتقي فيها الغرز السهمية والإكليلية للعظام الجدارية والأمامية. ستكون هذه هي نقطة المنشأ.
9. بالنظر من خلال المجهر ، حرك الطرف الحاد للشعيرات الدموية يمينا فوق لامدا. إذا كانت قيمة المحور z (الظهرية / البطنية = DV) في حدود +/- 0.1 مم ، يتم تسوية رأس. إذا كان أعلى أو أقل ، فاستخدم قضيب الأسنان لضبط الرأس وفقا لذلك حتى في حدود +/- 0.1 مم.
   ملاحظة: يتم تعريف Lambda (الشكل 1 ب) على أنه النقطة التي تلتقي فيها الغرز السهمية والإكليلية للعظام الجداري والقذالي. يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة لتسوية الجانب الأيسر والأيمن من الجمجمة إذا كان من الممكن ضبط أشرطة الأذن بشكل فردي. كن حذرا أثناء ضبط القضبان لأن الرأس سيتغير الزاوية ويمكن لمخروط الأنف / الرافعة أن يكسر أنف.
10. استخدم أطلس دماغ ألين (الشكل 1 ج ، د) لتحديد إحداثيات المنطقة المستهدفة التي تريدها. استخدم ذراعي المحور Y (الأمامي / الخلفي = AP) والمحور x (الإنسي / الجانبي = ML) لتحريك المحقنة / الشعيرات الدموية إلى الموضع الصحيح.
    ملاحظة: يجب إجراء حقن الصبغة (الشكل 2A-E) قبل العمليات الجراحية على منفصلة للتأكد من أن الإحداثيات صحيحة لسلالة / عمر المستخدمة.
11. انظر من خلال المجهر واستعد لحفر حفرة بعناية حيث تلتقي النهاية الحادة للشعرية بالعظام. قبل البدء ، حرك الشعيرات الدموية لأعلى بدرجة كافية على المحور Y حتى لا تتلف أثناء الحفر. ابدأ الحفر في دائرة أكبر وأصبح أصغر كلما كنت تحفر بشكل أعمق. أثناء الحفر ، ضع اليد على قضيب الأذن لإبقائها ثابتة.
    ملاحظة: لا تحفر على طول الطريق إلى أنسجة المخ. اترك طبقة رقيقة من العظام لتجنب تلف الجافة. بدلا من ذلك ، استخدم ملاقطا لإزالة الطبقة الرقيقة المتبقية من العظام بعناية.
12. باستخدام المجهر ، تأكد من أن الطرف الحاد للإبرة يمكن أن يلمس أنسجة الجافية / المخ دون أن يتم تحويله بواسطة قطع العظام.
13. نظف المحقنة / الشعيرات الدموية لتجنب تلوث محلول الحقن.
    1. حرك المحقنة / الشعيرات الدموية على طول الطريق لأعلى ، واغمسها في أنبوب سعة 1.5 مل يحتوي على 3٪ H₂O₂. تأكد من إزالة جميع الحطام والدم من الزجاج. بعد ذلك ، اغمس الشعيرات الدموية في أنبوب 1.5 مل يحتوي على H₂O لغسل H_{2O 2}.
    2. قم بإزالة المكبس المعدني من حقنة هاميلتون وضع شاشا تحت المحقنة / الشعيرات الدموية ، فوق رأس. استخدم حقنة سعة 1 مل مملوءة ب PBS لغسل حقنة هاميلتون عن طريق إدخال الإبرة في الأعلى وإخراج PBS. بعد ذلك ، أدخل المكبس المعدني في حقنة هاميلتون.
14. اسحب 1 ميكرولتر من الهواء. سيحافظ ذلك على PBS في حقنة هاميلتون ومحلول الحقن من الاختلاط في الشعيرات الدموية. ثم ارسم الكمية المطلوبة من محلول الحقن. يوصى بحد أقصى 1 ميكرولتر و 2 ميكرولتر لكل إيداع للفئران والجرذان على التوالي.
    ملاحظة: لا ينبغي تجاوز ما مجموعه 3 ميكرولتر / 6 ميكرولتر لكل نصف كرة كرة حيث سيرتفع الضغط في الدماغ كثيرا. باستخدام قلم ، يمكن عمل علامة صغيرة بعناية فائقة حيث يوجد الغضروف المفصلي للمحلول. يمكن بعد ذلك استخدام هذه العلامة كنقطة مرجعية لقياس ما إذا كان المحلول يدخل الدماغ.
15. بالنسبة للفئران ، استخدم إبرة 25G لثقب الجافية. أدخل الشعيرات الدموية في الدماغ إلى إحداثيات DV المطلوبة. حرك المحقنة / الشعيرات الدموية بعمق 0.1 مم من المقصود واسحب لأعلى لإفساح المجال للمحلول.
16. حقن المحلول إما يدويا (0.1 ميكرولتر لكل 10-15 ثانية) أو بمضخة (0.4-0.6 ميكرولتر / دقيقة). افحص الغضروف المفصلي للتأكد من حقن المحلول بالكامل.
    ملاحظة: إذا لم ينتقل المحلول إلى الدماغ ، حرك المحقنة / الشعيرات الدموية لأعلى ولأسفل 0.2 مم. إذا كان لا يزال لا يحقن ، كرر الخطوات 2.13-2.14. على الأرجح الإبرة مسدودة بحطام أنسجة المخ.
17. أمسك المحقنة / الشعيرات الدموية في مكانها لمدة 5 دقائق أخرى للسماح للمحلول المحقون بالتوزيع وانخفاض الضغط. خلال فترة الانتظار هذه ، قم بحقن المسكن ووضع علامة على إذا لزم الأمر.
18. حرك المحقنة / الشعيرات الدموية لأعلى 0.2 مم وثبتها في مكانها لمدة دقيقتين أخريين. اسحب المحقنة / الإبرة للخارج ببطء شديد لتجنب سحب أي محلول محقون بسبب الضغط السلبي.
19. بمجرد خروج المحقنة / الشعيرات الدموية من الدماغ ، قم بتنظيفها كما هو موضح في الخطوة 2.13 لمنع الأنسجة من الجفاف وانسداد الشعيرات الدموية.
20. استمر في حقن المزيد من مناطق الدماغ أو قم بإنهاء الجراحة.
21. حرك إبرة المحقنة جانبا عن طريق تدويرها بزاوية 180 درجة على المحور z لتجنب الكسر أثناء إغلاق الجرح. ثم أغلق الجرح إما بمشابك أو غراء مناديل أو خيوط جراحية. إذا تم استخدام التخدير عن طريق الحقن ، فقم بحقن بالترياق.
    ملاحظة: تميل التي لا يتم إيواؤها منفردة إلى تنظيف رأس بعضها البعض وربما إزالة المشابك أو الغراء أو الغرز.
22. قم بإزالة من الإطار التجسيمي وضعه في القفص النظيف أعلى وسادة الحرارة. راقب للتأكد من استيقاظه دون مضاعفات. توفير سهولة الوصول إلى الطعام والماء لأول 24 ساعة.

3. رعاية ما بعد العلاج الاختياري (المدة 3-7 أيام)

1. تحقق من الوزن (فقدان الوزن بنسبة 10٪ مقبول) والفراء والبراز وتناول الطعام / الماء للحيوان خلال 2-3 أيام القادمة (حتى 10 أيام لحقن المواد السامة) لضمان الشفاء المناسب. إذا لزم الأمر ، قم بعزل وتوفير الطعام الرطب والحقن المالحة ووسادة التدفئة ، وهي ضرورية لبعض الحقن السامة حيث قد تعاني من مشاكل جهازية إضافية.
2. حقن بمسكن لمدة 1-2 أيام أخرى بعد الجراحة لضمان تخفيف الآلام وفقا للوائح المحلية. إذا لم تؤتي الغرز أو المشابك أو الغراء من تلقاء نفسها ، فاستخدم الأيزوفلوران لتخدير وإزالة الغرز أو المشابك أو الغراء بعد أسبوع واحد من العملية.

النتائج

لتجنب الاستهداف الخاطئ ، قبل كل تجربة ، تحقق من الإحداثيات باستخدام حقن الصبغة. تم حقن ب 0.2-0.5 ميكرولتر من التربتوفان الأزرق باستخدام نفس البروتوكول ، وتم سحب الشعيرات الدموية بسرعة بعد الحقن وتم تجميد الدماغ بسرعة لتجنب الانتشار. بعد التقسيم على الميكروتوم ، يمكن رؤية م?...

Discussion

الحقن التجسيمي ، مثل أي إجراء جراحي ، لديه صعوبة رئيسية لضمان رفاهية وبقائه. لذلك ، من الضروري مراقبة عن كثب طوال العملية. يجب أن يكون البحث عن عدم انتظام التنفس أو فقدان التنفس أو تكرار ردود الفعل والحركات هو التركيز الرئيسي ، خاصة بالنسبة للجراحين عديمي الخبرة. بالإضاف?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Allen brain atlas	Allen Institute	mouse brain - reference atlas
analgesic: ketoprofin OR buprenorphine
anesthetic: Isoflurane OR ketamine / xylazine OR fentanyl / medetomidine
blades - surgical sterile	Oasis Medical	No 10
capillaries - glass	Stoelting	50811
capillary puller	Sutter Instruments	P-97
cotton-tipped applicators	Stoelting	50975
drill - dental	Foredom	MH-170
Ethanol 70%
eye drops (Liquigel)	CVS	NDC 0023-9205-02	Carboxymethylcellulose Sodium (1%), Boric acid; calcium chloride; magnesium chloride; potassium chloride; purified water; PURITE® (stabilized oxychloro complex); sodium borate; and sodium chloride
forceps - full curved	Stoelting	52102-38P
forceps - hemostatic delicate	Stoelting	52110-13
gauze - cotton absorbent
H2O - sterile
H2O2 30%	Sigma Aldrich	216763
Hamilton 5ul syringe	Hamilton Company	7634-01
Hamilton blunt metal needle	Hamilton Company	7770-01
heat pad - far infrared	Kent Scientific	2665967
Iodine solution (Dynarex) 10%	Indemedical	102538
isoflurane	Baxter	1001936040
lidocaine 0.5%
lighter / matches
microscope (Stemi 508 Boom stand)	Zeiss	435064-9000-000
PBS sterile	Gibco - Thermo Fischer	10010-023
pump (injector)	Stoelting	53311
scalpel handle	Stoelting	52171P
shaver - electrical	andis	64800
solution to inject / material to implant
stereotax - small animal digital	Kopf	Model 940
sterilizer - glass bead	BT Lab Systems	BT1703
tubing - heat-shrink	Nelco	NP221-3/64
tweezers - dumont fine curved	Roboz	RS-5045A
underpad - absorbent
vaporizer for isoflurane (package)	Scivena Scientific	M3000
wound clips and applier / remover	Stoelting	59040
wound glue (Vetbond)	3M corporation	1469SB