Entrega intracraniana estereotáxica de produtos químicos, proteínas ou vetores virais para estudar a doença de Parkinson

Resumo

Descrevemos como injetar com sucesso soluções em áreas específicas do cérebro de roedores usando uma estrutura estereotáxica. Esta cirurgia de sobrevivência é um método bem estabelecido usado para imitar vários aspectos da doença de Parkinson.

Resumo

A doença de Parkinson (DP) é um distúrbio progressivo tradicionalmente definido por tremor de repouso e acinesia, principalmente devido à perda de neurônios dopaminérgicos na substância negra. As áreas cerebrais afetadas exibem inclusões fibrilares intraneuronais que consistem principalmente em proteínas alfa-sinucleína (asína). Nenhum modelo animal até agora recapitulou todas as características desta doença. Aqui, descrevemos o uso de injeção estereotáxica para fornecer produtos químicos, proteínas ou vetores virais intracranialmente, a fim de imitar vários aspectos da DP. Esses métodos estão bem estabelecidos e amplamente utilizados em todo o campo da DP. As injeções estereotáxicas são incrivelmente flexíveis; Podem ser ajustados em termos de concentração, idade do animal utilizado para injeção, área cerebral visada e em espécies animais utilizadas. As combinações de substâncias permitem variações rápidas para avaliar tratamentos ou alterar a gravidade da patologia ou déficits comportamentais. Ao injetar toxinas no cérebro, podemos imitar a inflamação e / ou uma perda severa de neurônios dopaminérgicos, resultando em fenótipos motores substanciais. Os vetores virais podem ser usados para transduzir células para imitar aspectos genéticos ou mecanicistas. As injeções fibrilares pré-formadas de asíncrono recapitulam melhor o fenótipo progressivo por um longo período de tempo. Uma vez estabelecidos esses métodos, pode ser econômico gerar um novo modelo em comparação com a criação de uma nova linhagem transgênica. No entanto, este método é trabalhoso, pois requer de 30 minutos a quatro horas por animal, dependendo do modelo utilizado. Cada animal terá um direcionamento ligeiramente diferente e, portanto, criará uma coorte diversificada que, por um lado, pode ser difícil de interpretar os resultados; por outro lado, ajudar a imitar uma diversidade mais realista encontrada nos pacientes. Animais mal direcionados podem ser identificados usando leituras comportamentais ou de imagem, ou somente após serem sacrificados, levando a um tamanho de coorte menor após a conclusão do estudo. No geral, esse método é uma maneira rudimentar, mas eficaz, de avaliar um conjunto diversificado de aspectos da DP.

Introdução

A doença de Parkinson (DP) é uma doença neurodegenerativa progressiva relativamente comum que afeta até 1% das pessoas com mais de 60 anos¹. A DP é heterogênea, mas clinicamente caracterizada principalmente por sintomas motores, incluindo tremor de repouso, bradicinesia, acinesia, rigidez, distúrbio da marcha e instabilidade postural. A maioria dos sintomas motores geralmente aparece quando 60-70% da dopamina estriatal (DA) é perdida como resultado de neurodegeneração progressiva e distinta na substância negra (SN) pars compacta ^2,3. Os neurônios dopaminérgicos sobreviventes contêm inclusões intracelulares conhecidas como corpos de Lewy⁴. Esses agregados consistem principalmente em alfa-sinucleína (asína), uma proteína pequena, mas altamente expressa, nos neurônios do cérebro⁵.

O mecanismo subjacente da neurodegeneração na DP ainda é desconhecido. O envelhecimento ainda é o maior fator de risco para esse distúrbio⁶. Além disso, os humanos são a única espécie que desenvolve DP naturalmente. Portanto, a fim de investigar a patologia da DP e testar novos medicamentos para prevenir a progressão da doença, uma ampla gama de modelos animais foi desenvolvida⁷. Idealmente, os modelos animais de DP devem apresentar uma perda progressiva e dependente da idade de neurônios DA no SN, acompanhada por inclusões intracelulares seguidas de disfunção motora e responder às terapias de reposição de DA. Nenhum dos modelos animais atualmente disponíveis recapitula totalmente todos os sintomas clínicos e patologia da DP. Como cada modelo apresenta diferentes aspectos da doença, é importante considerar cuidadosamente o modelo apropriado a ser usado em um experimento com base nas perguntas feitas.

Historicamente, os modelos animais eram baseados em substâncias tóxicas, incluindo 6-hidroxidopamina (6-OHDA) e 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP), e pesticidas, como rotenona e paraquat⁸. Cada tóxico tem um mecanismo de ação diferente e varia de neurônio DA específico a geralmente prejudicial às células cerebrais. As toxinas podem ser administradas por via oral, injetadas intraperitonealmente ou diretamente no cérebro usando injeções estereotáxicas, dependendo da permeabilidade da barreira hematoencefálica. Ao contrário de outros modelos, os modelos de toxinas garantem um alto grau de perda de células dopaminérgicas nigroestriatais e fenótipos comportamentais. Alguns modelos podem até apresentar patologia sutil. Essas características tornam os modelos de toxina da DP uma ótima ferramenta para estudar terapias de reposição e os efeitos das toxinas ambientais no início da DP ^9,10.

Além disso, vários modelos de camundongos transgênicos foram gerados usando uma variedade de promotores e genes relacionados à DP¹¹. A maioria dos camundongos apresenta patologia nigroestriatal, mas sem evidências claras de neurodegeneração. Os modelos transgênicos têm a vantagem de serem consistentes entre animais e coortes e, uma vez gerados, são fáceis de manter e distribuir. Embora não resultem em neurodegeneração, são modelos úteis para investigar alterações celulares causadas por variantes genéticas e possíveis candidatos a fármacos em um sistema complexo in vivo¹².

Em contraste com os modelos transgênicos, a expressão mediada por vetores virais de genes relacionados à DP oferece uma abordagem mais flexível¹³. As injeções estereotáxicas permitem que várias áreas cerebrais, tipos de células e níveis de expressão sejam escolhidos para uma ampla gama de espécies animais, como camundongos, ratos, porcos e primatas não humanos. Inicialmente, vetores virais recombinantes que codificam para asyn foram usados para transduzir neurônios localizados no SN de ratos. O acúmulo de proteínas e a disfunção celular precedem a perda progressiva de células dopaminérgicas, resultando em déficit comportamental. Diferenças no direcionamento podem levar a uma grande variação de perda celular entre os animais (30-80%), o que é responsável por déficits comportamentais variáveis observados em apenas aproximadamente 25% dos ratos injetados¹⁴.

Um modelo recentemente estabelecido é a injeção intracraniana de fibrilas assíncronas pré-formadas (PFFs) ou extratos agregados de tecido cerebral de camundongos ou pacientes^15,16. Vários estudos indicam que a injeção de PFFs ou extratos resulta em uma patologia assínrica generalizada no cérebro animal, bem como uma perda de neurônios dopaminérgicos no SN. O acúmulo de asín aparece dentro dos neurônios que inervam a área injetada. Ao contrário dos modelos baseados em vetores virais, o modelo PFF se desenvolve lentamente ao longo de vários meses, seguido por déficits motores em 6 meses. Esse modelo tem grande potencial para estudar o mecanismo ou prevenção de uma patologia assínrica ^17,18.

Todos os modelos mencionados acima foram bem estabelecidos e usados inúmeras vezes para estudar vários aspectos da doença humana. As injeções estereotáxicas de substâncias diretamente no cérebro desempenharam um papel importante no desenvolvimento desses modelos animais, não apenas no campo da DP, mas também em outros distúrbios neurológicos. Embora seja trabalhosa, a cirurgia estereotáxica tem as vantagens de ser altamente flexível na idade dos animais usados, na região do cérebro e na substância injetada, e pode ser ajustada dependendo da pergunta de pesquisa feita. Por exemplo, substâncias podem ser injetadas isoladamente ou em combinação (vetor + fibrilas ou tóxico + vetor) para recapitular mais aspectos da doença ou avaliar tratamentos^19,20. Além disso, as substâncias podem ser injetadas unilateralmente, deixando o lado não injetado como um controle interno para avaliar o comportamento e a neurodegeneração. Portanto, este manuscrito descreverá etapas detalhadas para gerar modelos de DP usando injeções estereotáxicas.

Protocolo

Todos os experimentos neste estudo foram conduzidos em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório dos Institutos Nacionais de Saúde e aprovados pelos Comitês de Cuidados e Uso de Animais do Instituto Nacional de Envelhecimento dos EUA.

Antes de começar, certifique-se de ter adquirido o treinamento apropriado e a aprovação ética de seu instituto necessários para realizar este procedimento. Além disso, os anestésicos (por exemplo, cetamina e buprenorfina, ou fentanil e medetomidina) usados devem ser adquiridos e manuseados de acordo com as regras relevantes de sua instituição.

1. Preparação (duração de 1 hora)

1. Traga os animais para a sala de cirurgia e deixe-os se aclimatar enquanto montam a área cirúrgica. Coloque equipamento de proteção individual (EPI) adequado.
   NOTA: Isso pode depender dos regulamentos de segurança locais e da substância injetada. Os vetores virais precisam principalmente de EPI de nível 2 de biossegurança. Geralmente, pelo menos use máscara, luvas e jaleco descartável. Em circunstâncias específicas, luvas e óculos adicionais devem ser usados.
2. Esterilize as ferramentas cirúrgicas usando uma autoclave ou um esterilizador de esferas de vidro. Para roedores, você precisa de cabo de bisturi, pinça hemostática, pinça Dumont, pinça curva, kit de fechamento de feridas (clipes) ou tesoura e pinça (para suturas) e uma cabeça de perfuração.
3. Desinfete a área cirúrgica e o instrumento estereotáxico com etanol a 70% e cubra a área próxima ao instrumento estereotáxico com toalhas de papel limpas ou uma folha absorvente estéril.
4. Coloque o seguinte nas toalhas: colírio (por exemplo, Liquigel), aparador de cabelo, cotonetes, iodixanol diluído, lâmina cirúrgica descartável, broca cirúrgica com broca desinfetada, marcador ou cortador de orelha, H₂O estéril em um tubo de 1,5 mL, tubo de 1,5 mL com 3% H₂O₂ em H₂O estéril (1,35 mL de H₂O + 0,15 mL de 30% H₂O_2, recém-preparada), uma seringa de 1 mL com agulha 33G e PBS ou solução salina estéril, seringa com analgésico e antídoto se for usada anestesia injetável (por exemplo, atipamezol + buprenorfina/cetoprofeno; recém-preparado e aprovado na licença ética) e ferramentas cirúrgicas autoclavadas.
5. Encha o isoflurano e verifique as pressões de O₂ e N₂ , se estiver usando anestesia gasosa. Adicione uma toalha de papel no fundo da câmara de inalação para mantê-la seca e limpa.
   Misture e prepare o anestésico (por exemplo, fentanil + medetomidina (para ratos) ou solução de cetamina + xilazina (para camundongos)) se estiver usando anestesia injetável e se aprovado na licença ética.
6. Monte a seringa de vidro Hamilton e o capilar de vidro (Figura 1A 1.).
   1. Coloque o capilar de vidro puxado sobre a mesa. Coloque o dedo indicador onde o capilar fica mais fino com a unha terminando onde o capilar deve ser cortado.
      NOTA: Dependendo da profundidade da sua injeção, entre 0,5 - 2 cm.
   2. Use a borda de um ladrilho de cerâmica para arranhar cuidadosamente a parte da agulha algumas vezes. Pegue um capilar de vidro em uma mão e use o polegar e o indicador para agarrar a parte fina da agulha. Puxe do meio até a ponta até que a agulha se quebre sem rodeios.
      NOTA: Se não funcionar ou a agulha quebrar com bordas, repita algumas vezes. Se ainda não quebrar, repita os arranhões do ladrilho. Certifique-se de que a parte da agulha não seja muito fina (>50 μm de diâmetro) e não dobre facilmente.
7. Sele o capilar de vidro na seringa Hamilton.
   1. Prenda um tubo retrátil de 1 cm sobre a agulha de metal romba conectada à seringa de vidro Hamilton. Em seguida, coloque a extremidade grossa do capilar de vidro sobre a agulha de metal Hamilton.
   2. Coloque o tubo retrátil sobre a metade do capilar de vidro, garantindo pelo menos 1 cm de espaço entre a extremidade da agulha de metal Hamilton e a transição cônica do capilar. Este será o espaço que contém a solução injetável desejada posteriormente.
   3. Use um isqueiro ou fósforo para aquecer o tubo retrátil e vedar a agulha de injeção.
      NOTA: Existem várias opções de suporte diferentes que permitem fixar a seringa Hamilton no braço estereotáxico à esquerda. Certifique-se de que você ainda pode ler os números na seringa Hamilton. Se utilizar uma bomba para injetar a solução, ligue a bomba ao braço estereotáxico e fixe a seringa Hamilton na bomba.
8. Remova o êmbolo de metal. Insira uma agulha 27G conectada a uma seringa de 1 mL cheia de solução salina ou PBS na parte superior da seringa Hamilton. Lave a seringa Hamilton com PBS para verificar se está selada e para eliminar todas as bolhas de ar.
   NOTA: As bolhas de ar perturbarão a absorção e injeção da solução, pois o ar comprime mais do que o líquido.
9. Quando tudo estiver verificado e pronto, abra o pequeno parafuso no braço do eixo z (Figura 1A 2.) do instrumento estereotáxico e gire o braço em incrementos de 90° no sentido horário para mover a seringa/capilar de vidro para fora do caminho (para evitar que o capilar se quebre enquanto fixa o animal ao instrumento estereotáxico).
   NOTA: Verifique se todos os ângulos e configurações de stereotax estão definidos para os parâmetros desejados (normalmente 0°), a barra de dentes e as barras auriculares estão definidas para as coordenadas desejadas e se a seringa/capilar Hamilton está toda reta.
10. Ligue a almofada térmica na plataforma stereotax, usando acolchoamento adicional na parte superior se estiver muito quente. Coloque uma gaiola vazia e limpa com uma almofada térmica adicional ao lado da área cirúrgica.

2. Cirurgia (duração média de 1 hora por animal)

1. Para anestesia gasosa
   1. Ligue o isoflurano a 5% com um fluxo de ar N₂ + O₂ (cerca de 1 L / min) e abra a válvula para a câmara de inalação. Coloque o animal na câmara e certifique-se de que está bem selado. Observe a respiração até que ela diminua consideravelmente (respiração profunda).
   2. Quando o animal estiver inconsciente, abra a válvula para o instrumento estereotáxico e feche a válvula da câmara. Defina o isoflurano para 2%.
   3. Abra a câmara e retire o animal que o segura pelo pescoço, abra a boca com a pinça e coloque o animal na barra do dente (Figura 1A 6.) com os dentes superiores da frente encaixados no orifício.
      NOTA: Esta etapa é sensível ao tempo, pois o animal pode acordar novamente sem respirar isoflurano.
   4. Coloque o cone do nariz sobre o focinho e observe a respiração para garantir um ritmo constante sem respiração forçada. Certifique-se de que o animal esteja profundamente anestesiado, verificando a ausência dos reflexos de retirada do pedal dos membros posteriores antes de prosseguir.
      NOTA: Continue verificando durante todo o procedimento para que o animal não pare de respirar ou acorde. Se necessário, ajuste % de isoflurano em pequenos incrementos. Para testar o reflexo de retirada do pedal dos membros posteriores, use uma pinça e aperte a pata traseira. Se o animal retrair o membro (reflexo para remover os estímulos dolorosos), a anestesia é muito baixa.
   5. Fixe a cabeça do animal no lugar usando as duas barras auriculares (Figura 1A 7.). Quando feito corretamente, as orelhas devem estar apontando para os lados sobre as barras auriculares. Se a cabeça ainda estiver em movimento, ajuste as barras auriculares ou o cone do nariz para fixar a cabeça mais firmemente no lugar.
      NOTA: Seja gentil para evitar quebrar os tímpanos dos animais inserindo as barras de ouvido muito profundamente. Os ratos tendem a piscar quando a barra auricular é inserida corretamente.
2. Para anestesia injetável:
   1. Injete no animal uma dose apropriada / recomendada de anestesia i.p. (300 μg / kg de fentanil e 300 μg / kg de medetomidina para ratos; 100 mg / kg de cetamina e 10 mg / kg de xilazina para camundongos) e coloque-o de volta na gaiola doméstica.
   2. Verifique os reflexos de retirada do pedal dos animais 5 min após a injeção. Se ausente, fixe a cabeça do animal no lugar usando as duas barras auriculares (Figura 1A, 7.). Quando feito corretamente, as orelhas devem estar apontando para os lados sobre as barras auriculares. Em seguida, coloque o animal na barra de dentes (Figura 1A 6.) e aperte a alavanca. Se a cabeça ainda estiver em movimento, ajuste as barras auriculares ou o cone da alavanca para fixar a cabeça mais firmemente no lugar.
      NOTA: É possível quebrar o tímpano de um animal quando as barras auriculares são inseridas muito profundamente. Não aperte muito a alavanca. Pode quebrar o nariz dos animais.
   3. Se os reflexos de retirada do pedal forem observados, aguarde mais 5-10 min. Se ainda observado, injete mais 10% do anestésico anterior.
      NOTA: Aumente a dose de anestésico lentamente com um período de espera entre eles para evitar a morte do animal por asfixia.
   4. Certifique-se de que o crânio esteja plano ajustando as alturas da barra do dente e/ou da barra da orelha.
      NOTA: Tenha cuidado ao ajustar as barras, pois a cabeça mudará de ângulo e o cone/alavanca do nariz pode quebrar o nariz dos animais.
3. Coloque colírio em cada olho (por exemplo, Liquigel) para evitar que sequem durante a cirurgia. Raspe a cabeça do animal dos olhos aos ouvidos.
4. Desinfetar a área cirúrgica com iodopovidona a 10%. Além disso, injete um anestésico local (por exemplo, lidocaína a 0.5%) por via intradérmica no local da incisão. Recomenda-se esperar 2-3 minutos para que ele aja antes de continuar.
5. Usando o bisturi, faça uma incisão contínua entre os olhos e entre as orelhas.
   NOTA: Tenha cuidado para não cortar muito para trás, pois cortar os músculos do pescoço complicará a recuperação.
6. Use as pontas de algodão para abrir a ferida e limpar a área do sangue. Para ratos, use a pinça hemostática para manter a ferida aberta, prendendo-a no tecido subcutâneo e deixando-a pendurada de cada lado. Para ratos, se necessário, use micro clipes.
   NOTA: Esta é a parte mais dolorosa do procedimento. Clampear o tecido subcutâneo em vez da pele aumentará a cicatrização.
7. Mova a seringa/capilar (Figura 1A 1.) 180° no sentido anti-horário no eixo z (Figura 1A 2.) e coloque-a sobre a cabeça do animal. Certifique-se de fechar o botão completamente para que o braço do eixo z não oscile durante a cirurgia.
8. Use o microscópio e os botões em cada braço estereotáxico (Figura 1A 3.-5.) para mover a extremidade romba do capilar de vidro (preso à seringa de vidro Hamilton; Figura 1A 1.) bem em cima do bregma (tocando, mas não pressionando o osso). Defina todos os valores no display digital para zero (Figura 1A 8.).
   NOTA: Bregma (Figura 1B) é o ponto onde as suturas sagital e coronal dos ossos parietal e frontal se encontram. Este será o ponto de origem.
9. Olhando através do microscópio, mova a extremidade romba do capilar bem em cima do lambda. Se o valor do eixo z (dorsal/ventral = DV) estiver dentro de +/- 0,1 mm, a cabeça do animal é nivelada. Se for mais alto ou mais baixo, use a barra do dente para ajustar a cabeça de acordo até +/- 0.1 mm.
   NOTA: Lambda (Figura 1B) é definido como o ponto onde as suturas sagital e coronal dos ossos parietal e occipital se encontram. Este método também pode ser usado para nivelar o lado esquerdo e direito do crânio se as barras auriculares puderem ser ajustadas individualmente. Tenha cuidado ao ajustar as barras, pois a cabeça mudará de ângulo e o cone / alavanca do nariz pode quebrar o nariz dos animais.
10. Use o atlas cerebral de Allen (Figura 1C, D) para identificar as coordenadas para a região alvo desejada. Use os braços do eixo y (anterior/posterior = AP) e do eixo x (medial/lateral = ML) para mover a seringa/capilar para a posição correta.
    NOTA: As injeções de corante (Figura 2A-E) devem ser realizadas antes dos procedimentos cirúrgicos em animais separados para garantir que as coordenadas estejam corretas para a cepa / idade dos animais usados.
11. Olhe através do microscópio e prepare-se para fazer um furo cuidadosamente onde a extremidade romba do capilar encontra o osso. Antes de começar, mova o capilar o suficiente para cima no eixo y para que não seja danificado durante a perfuração. Comece a perfurar em um círculo maior e fique menor à medida que perfura mais fundo. Durante a perfuração, descanse a mão em uma barra de ouvido para mantê-la firme.
    NOTA: Não perfure todo o caminho até o tecido cerebral. Deixe uma fina camada de osso para evitar danos à dura-máter. Em vez disso, use uma pinça para remover cuidadosamente a fina camada restante de osso.
12. Usando o microscópio, verifique se a ponta romba da agulha pode tocar a dura-máter / tecido cerebral sem ser desviada por pedaços de osso.
13. Limpe a seringa / capilar para evitar a contaminação da solução injetável.
    1. Mova a seringa/capilar totalmente para cima e mergulhe-a no tubo de 1,5 mL contendo 3% de H₂O₂. Certifique-se de remover todos os detritos e sangue do vidro. Em seguida, mergulhe o capilar no tubo de 1,5 mL contendo H₂O para lavar o H₂O₂.
    2. Remova o êmbolo de metal da seringa Hamilton e coloque uma gaze sob a seringa/capilar, no topo da cabeça do animal. Use a seringa de 1 mL cheia de PBS para lavar a seringa Hamilton inserindo a agulha na parte superior e esguichando PBS. Depois disso, insira o êmbolo de metal na seringa Hamilton.
14. Aspire 1 μL de ar. Isso evitará que o PBS na seringa Hamilton e a solução injetável se misturem no capilar. Em seguida, retire a quantidade desejada de solução injetável. Recomenda-se um máximo de 1 μL e 2 μL por depósito para camundongos e ratos, respectivamente.
    NOTA: Um total de 3 μL / 6 μL por hemisfério não deve ser excedido, pois a pressão no cérebro aumentará muito. Usando uma caneta, uma pequena marca pode ser feita com muito cuidado onde está o menisco da solução. Essa marca pode então ser usada como um ponto de referência para avaliar se a solução entra no cérebro.
15. Para ratos, use uma agulha 25G para perfurar a dura-máter. Insira o capilar no cérebro até a coordenada DV desejada. Mova a seringa/capilar 0,1 mm mais fundo do que o pretendido e puxe de volta para cima para dar espaço à solução.
16. Injete a solução manualmente (0,1 μL por 10-15 seg) ou com uma bomba (0,4-0,6 μL / min). Verifique o menisco para garantir que a solução esteja totalmente injetada.
    NOTA: Se a solução não se mover para o cérebro, mova a seringa/capilar para cima e para baixo 0.2 mm. Se ainda não injetar, repita as etapas 2.13-2.14. Muito provavelmente, a agulha está entupida com detritos de tecido cerebral.
17. Segure a seringa/capilar no lugar por mais 5 minutos para deixar a solução injetada se distribuir e a pressão diminuir. Durante este período de espera, injetar o analgésico e marcar o animal, se necessário.
18. Mova a seringa/capilar para cima 0,2 mm e segure no lugar por mais 2 min. Retire a seringa/agulha muito lentamente para evitar puxar qualquer solução injetada devido à pressão negativa.
19. Assim que a seringa/capilar estiver fora do cérebro, limpe-a conforme descrito na etapa 2.13 para evitar que o tecido seque e entupa o capilar.
20. Continue injetando mais áreas do cérebro ou termine a cirurgia.
21. Mova a agulha da seringa para o lado girando-a 180° no eixo z para evitar quebra ao fechar a ferida. Em seguida, feche a ferida com clipes, cola de tecido ou suturas. Se a anestesia injetável foi usada, injete o antídoto no animal.
    NOTA: Animais não alojados sozinhos tendem a limpar a cabeça uns dos outros e possivelmente remover clipes, cola ou pontos.
22. Remova o animal da estrutura estereotáxica e coloque-o na gaiola limpa em cima da almofada térmica. Monitore o animal para garantir que ele acorde sem complicações. Forneça fácil acesso a comida e água nas primeiras 24 horas.

3. Cuidados pós-operatórios (duração de 3 a 7 dias)

1. Verifique o peso (10% de perda de peso é aceitável), pelo, fezes e ingestão de comida/água do animal nos próximos 2-3 dias (até 10 dias para injeção de tóxico) para garantir a recuperação adequada. Se necessário, isole o animal e forneça comida úmida, injeções de solução salina e uma almofada de aquecimento, essencial para algumas injeções tóxicas, pois os animais podem ter problemas sistêmicos adicionais.
2. Injete analgésico em animais por mais 1-2 dias após a cirurgia para garantir o alívio da dor de acordo com os regulamentos locais. Se suturas, clipes ou cola não saírem sozinhos, use isoflurano para anestesiar o animal e remova suturas, clipes ou cola 1 semana após a operação.

Resultados

Para evitar erros de direcionamento, antes de cada experimento, verifique as coordenadas usando injeções de corante. Os animais foram injetados com 0,2-0,5 μL de azul de triptofano usando o mesmo protocolo, o capilar foi rapidamente retirado após a injeção e o cérebro foi rapidamente congelado para evitar a difusão. Após a secção no micrótomo, o local da injeção pode ser visto em azul (Figura 2 C,E). Para garantir um direcionam...

Discussão

A injeção estereotáxica, como qualquer procedimento cirúrgico, tem como principal dificuldade garantir o bem-estar e a sobrevivência do animal. Portanto, é essencial monitorar o animal de perto durante todo o procedimento. Observar irregularidades respiratórias, perda de respiração ou recorrência de reflexos e movimentos deve ser o foco principal, especialmente para cirurgiões inexperientes. Além disso, a aplicação de analgésicos é crucial para ajudar no processo de recup...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Allen brain atlas	Allen Institute	mouse brain - reference atlas
analgesic: ketoprofin OR buprenorphine
anesthetic: Isoflurane OR ketamine / xylazine OR fentanyl / medetomidine
blades - surgical sterile	Oasis Medical	No 10
capillaries - glass	Stoelting	50811
capillary puller	Sutter Instruments	P-97
cotton-tipped applicators	Stoelting	50975
drill - dental	Foredom	MH-170
Ethanol 70%
eye drops (Liquigel)	CVS	NDC 0023-9205-02	Carboxymethylcellulose Sodium (1%), Boric acid; calcium chloride; magnesium chloride; potassium chloride; purified water; PURITE® (stabilized oxychloro complex); sodium borate; and sodium chloride
forceps - full curved	Stoelting	52102-38P
forceps - hemostatic delicate	Stoelting	52110-13
gauze - cotton absorbent
H2O - sterile
H2O2 30%	Sigma Aldrich	216763
Hamilton 5ul syringe	Hamilton Company	7634-01
Hamilton blunt metal needle	Hamilton Company	7770-01
heat pad - far infrared	Kent Scientific	2665967
Iodine solution (Dynarex) 10%	Indemedical	102538
isoflurane	Baxter	1001936040
lidocaine 0.5%
lighter / matches
microscope (Stemi 508 Boom stand)	Zeiss	435064-9000-000
PBS sterile	Gibco - Thermo Fischer	10010-023
pump (injector)	Stoelting	53311
scalpel handle	Stoelting	52171P
shaver - electrical	andis	64800
solution to inject / material to implant
stereotax - small animal digital	Kopf	Model 940
sterilizer - glass bead	BT Lab Systems	BT1703
tubing - heat-shrink	Nelco	NP221-3/64
tweezers - dumont fine curved	Roboz	RS-5045A
underpad - absorbent
vaporizer for isoflurane (package)	Scivena Scientific	M3000
wound clips and applier / remover	Stoelting	59040
wound glue (Vetbond)	3M corporation	1469SB