化学物质、蛋白质或病毒载体的立体定位颅内递送以研究帕金森病

摘要

我们描述了如何使用立体定位框架成功地将溶液注射到啮齿动物的特定大脑区域。这种生存手术是一种行之有效的方法，用于模拟帕金森病的各个方面。

摘要

帕金森病 （PD） 是一种进行性疾病，传统上定义为静止性震颤和运动不能，主要是由于黑质中多巴胺能神经元的丢失。受影响的大脑区域显示神经元内纤维包涵体，主要由 α-突触核蛋白 （asyn） 蛋白组成。迄今为止，还没有动物模型概括了这种疾病的所有特征。在这里，我们描述了使用立体定向注射在颅内递送化学物质、蛋白质或病毒载体，以模拟 PD 的各个方面。这些方法在整个 PD 领域得到广泛应用。立体定向注射非常灵活;它们可以调整浓度、用于注射的动物年龄、目标脑区域和使用的动物物种。物质的组合允许快速变化以评估治疗或改变病理或行为缺陷的严重程度。通过将毒素注射到大脑中，我们可以模拟炎症和/或多巴胺能神经元的严重丢失，从而导致大量的运动表型。病毒载体可用于转导细胞以模拟遗传或机制方面。预制的纤维 asyn 注射在较长时间内最好地概括了进行性表型。一旦建立了这些方法，与创建新的转基因系相比，生成新模型可能是经济的。然而，这种方法是劳动密集型的，因为每只动物需要 30 分钟到 4 小时，具体取决于所使用的模型。每只动物的靶向都略有不同，因此会创建一个多样化的队列，一方面，解释结果可能具有挑战性;另一方面，有助于模拟在患者身上发现的更真实的多样性。可以使用行为或影像学读数来识别目标错误的动物，或者只有在研究结束后才牺牲导致队列规模更小。总的来说，这种方法是评估各种 PD 方面的一种基本但有效的方法。

引言

帕金森病 （PD） 是一种相对常见的进行性神经退行性疾病，影响多达 1% 的 60 岁以上人群¹。PD 是异质性的，但临床特征主要表现为运动症状，包括静止性震颤、运动迟缓、运动不能、强直、步态障碍和姿势不稳。大多数运动症状通常出现在 60-70% 的纹状体多巴胺 （DA） 由于黑质 （SN） 致密部进行性和明显的神经退化而丢失时 ^2,3。幸存的多巴胺能神经元包含称为路易体的细胞内包涵体⁴。这些聚集体主要由 α-突触核蛋白 （asyn） 组成，这是一种在大脑神经元中小但高度表达的蛋白质⁵。

PD 神经退行性变的潜在机制尚不清楚。衰老仍然是这种疾病的最大风险因素⁶。此外，人类是唯一自然发展 PD 的物种。因此，为了研究 PD 病理学和测试预防疾病进展的新药，已经开发了多种动物模型⁷。理想情况下，PD 的动物模型应显示 SN 中 DA 神经元的年龄依赖性进行性丢失，伴有细胞内包涵体，然后是运动功能障碍，并对 DA 替代疗法有反应。目前可用的动物模型都没有完全概括 PD 的所有临床症状和病理。由于每个模型都呈现了疾病的不同方面，因此根据提出的问题仔细考虑在实验中使用的适当模型非常重要。

从历史上看，动物模型基于毒物，包括 6-羟基多巴胺 （6-OHDA） 和 1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶 （MPTP），以及杀虫剂，如鱼藤酮和百草枯⁸。每种毒物都有不同的作用机制，范围从 DA 神经元特异性到通常对脑细胞有害。毒素可以口服、腹膜内注射或使用立体定向注射直接进入大脑，具体取决于血脑屏障通透性。与其他模型不同，毒素模型保证了高度的黑质纹状体多巴胺能细胞丢失和行为表型。一些模型甚至可能出现轻微的病理。这些特征使毒素 PD 模型成为研究替代疗法和环境毒素对 PD 发作影响的绝佳工具 ^9,10。

此外，已经使用各种启动子和 PD 相关基因生成了许多转基因小鼠模型¹¹。大多数小鼠表现为黑质纹状体病变，但没有神经退行性的明确证据。转基因模型的优势在于动物和群体之间保持一致，并且一旦生成就易于维护和分发。虽然它们不会导致神经退行性变，但它们仍然是研究复杂体内系统中由遗传变异和可能的候选药物引起的细胞变化的有用模型¹²。

与转基因模型相比，病毒载体介导的 PD 相关基因表达提供了一种更灵活的方法¹³。立体定向注射允许为各种动物物种（如小鼠、大鼠、猪和非人灵长类动物）选择各种大脑区域、细胞类型和表达水平。最初，编码 asyn 的重组病毒载体用于转导位于大鼠 SN 中的神经元。蛋白质积累和细胞功能障碍先于进行性多巴胺能细胞丢失，导致行为缺陷。靶向的差异会导致动物之间的细胞损失差异很大 （30-80%），这就是导致仅约 25% 的注射大鼠出现可变行为缺陷的原因¹⁴。

最近建立的模型是颅内注射预先形成的 asyn 原纤维 （PFF） 或从小鼠或患者脑组织中聚集的提取物^15,16。多项研究表明，注射 PFF 或提取物会导致动物大脑中广泛传播的非同步病理以及 SN 中多巴胺能神经元的丢失。asyn 的积累出现在支配注射区域的神经元内。与基于病毒载体的模型不同，PFF 模型在几个月内缓慢发展，然后在 6 个月时出现运动缺陷。该模型在研究 asyn 病理学的机制或预防方面具有巨大潜力^17,18。

上面提到的所有模型都已经建立起来，并被多次用于研究人类疾病的各个方面。将物质直接立体定向注射到大脑中，不仅在 PD 领域，而且在其他神经系统疾病领域，在这些动物模型的开发中发挥了重要作用。虽然它是劳动密集型的，但立体定位手术的优点是在使用动物的年龄、靶向大脑区域和注射的物质方面具有高度的灵活性，并且可以根据提出的研究问题进行调整。例如，可以单独或组合注射物质（载体 + 原纤维或毒物 + 载体）以概括疾病的更多方面或评估治疗^19,20。此外，物质可以单侧注射，留下未注射的一侧作为评估行为和神经退行性变的内部对照。因此，本手稿将概述使用立体定向注射生成 PD 模型的详细步骤。

研究方案

本研究中的所有实验均严格按照美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》中的建议进行，并经美国国家老龄化研究所动物护理和使用委员会批准。

在开始之前，请确保已从您的机构获得执行此程序所需的适当培训和道德批准。此外，应根据您所在机构的相关规则购买和处理所使用的麻醉剂（例如氯胺酮和丁丙诺啡，或芬太尼和美托咪定）。

1. 准备（时长 1 小时）

1. 将动物带到手术室，让它们在设置手术区域时适应环境。穿戴适当的个人防护装备 （PPE）。
   注意： 这可能取决于当地的安全法规和注射的物质。病毒载体大多需要生物安全 2 级 PPE。一般来说，至少要戴口罩、手套和一次性实验服。在特定情况下，应使用额外的手套和护目镜。
2. 使用高压灭菌器或玻璃珠灭菌器对手术工具进行消毒。对于啮齿动物，您需要手术刀手柄、止血钳、杜蒙镊子、弯曲镊子、伤口闭合套件（夹子）或剪刀和镊子（用于缝合）和钻头。
3. 用 70% 乙醇对手术区域和立体定位器械进行消毒，并用干净的纸巾或无菌吸水片覆盖立体定位器械旁边的区域。
4. 将以下内容放在毛巾上：滴眼液（例如 Liquigel）、头发修剪器、棉签、稀释的碘克沙醇、一次性手术刀片、带有消毒钻头的手术钻头、记号笔或耳刀、无菌 H₂O 1.5 mL 管、1.5 mL 管中含有 3 % H₂O₂ 的无菌 H₂O （1.35 mL H₂O + 0.15 mL 30 % H₂O_2， 新鲜制备）、一个带有 33 克针头和无菌 PBS 或生理盐水的 1 mL 注射器、如果使用注射麻醉剂，则使用镇痛剂和解毒剂的注射器（例如，阿替美唑 + 丁丙诺啡/酮洛芬;新鲜制备并在道德许可中批准）和高压灭菌手术工具。
5. 如果使用气体麻醉，则填充异氟醚并检查 O₂ 和 N₂ 压力。在吸入室底部添加纸巾，以保持其干燥和清洁。
   如果使用注射麻醉剂并且获得伦理许可批准，则混合并新鲜制备麻醉剂（例如，芬太尼 + 美托咪定（用于大鼠）或氯胺酮 + 甲苯噻嗪溶液（用于小鼠））。
6. 组装 Hamilton 玻璃注射器和玻璃毛细管（图 1A 1.）。
   1. 将拉出的玻璃毛细管放在桌子上。将食指放在毛细血管变薄的地方，将指甲末端放在应该切割毛细血管的地方。
      注意：根据注射深度，在 0.5 - 2 厘米之间的任意位置。
   2. 用瓷砖的边缘小心地划伤针头部分几次。一只手拿着玻璃毛细管，用拇指和食指抓住细针部分。从中间拉到末端，直到针头钝折断。
      注意： 如果它不起作用或针头边缘折断，请重复几次。如果它仍然没有断裂，请重复刮擦瓷砖。确保针部分不要太细（直径>50 μm）且不易弯曲。
7. 将玻璃毛细管密封到 Hamilton 注射器上。
   1. 将 1 cm 收缩管连接到连接到 Hamilton 玻璃注射器的钝金属针头上。然后将玻璃毛细管的粗端放在 Hamilton 金属针上。
   2. 将收缩管放在玻璃毛细管的一半上，确保 Hamilton 金属针的末端与毛细管的锥形过渡之间至少留出 1 cm 的空间。这将是稍后容纳所需注射溶液的空间。
   3. 使用打火机或火柴加热热缩管并密封注射针。
      注意：有几种不同的支架选项可让您将 Hamilton 注射器固定到左侧的立体定位臂上。确保您仍然可以读取 Hamilton 注射器上的数字。如果使用泵注入溶液，请将泵连接到立体定位臂，并将 Hamilton 注射器固定在泵上。
8. 拆下金属柱塞。将 27G 针头插入 Hamilton 注射器顶部，该针头连接到装满生理盐水或 PBS 的 1 mL 注射器上。用 PBS 冲洗 Hamilton 注射器，检查其是否密封并冲洗掉所有气泡。
   注意：气泡会干扰您对溶液的吸收和注射，因为空气的压缩程度大于液体。
9. 检查并准备好所有内容后，打开立体定位仪 z 轴臂上的小螺钉（图 1A 2.），然后以顺时针 90° 的增量旋转臂以将玻璃注射器/毛细管移开（以避免毛细管破裂在将动物固定到立体定位仪器上时）。
   注意：检查所有立体角度和设置是否设置为所需的参数（通常为 0°），牙杆和耳杆是否设置为所需的坐标，并且汉密尔顿注射器/毛细管都是直的。
10. 打开 stereotax 平台上的加热垫，如果太热，请在顶部使用额外的衬垫。在手术区域旁边放置一个空的、干净的笼子，并带有额外的加热垫。

2. 手术（每只动物平均持续时间 1 小时）

1. 用于气体麻醉
   1. 用 N₂ + O₂ 气流（约 1 L/min）将异氟醚打开至 5%，然后打开吸入室的阀门。将动物放入腔室并确保其密封良好。观察呼吸，直到呼吸明显减慢（深呼吸）。
   2. 一旦动物失去知觉，打开立体定位器的阀门并关闭腔室阀门。将异氟醚设置为 2%。
   3. 打开腔室，取出握住它脖子上的动物，用镊子张开它的嘴，然后将动物放在齿条上（图 1A 6.），前上牙插入孔中。
      注意：此步骤对时间敏感，因为动物可以通过不吸入异氟醚而再次醒来。
   4. 将鼻锥放在鼻子上，观察呼吸，以确保稳定的节奏，而不会用力呼吸。在继续之前，通过检查后肢的踏板撤退反射是否消失，确保动物被深度麻醉。
      注意：在整个过程中保持检查，以免动物停止呼吸或醒来。如有必要，以小增量调整异氟醚的百分比。要测试后肢的踏板撤退反射，请使用一把镊子并捏住后爪。如果动物缩回肢体（反射以消除疼痛刺激），则麻醉效果太低。
   5. 使用两个耳杆将动物的头部固定到位（图 1A 7.）。正确作后，耳朵应侧指向耳杆上方。如果头部仍在移动，请调整耳杆或鼻锥，将头部固定得更紧。
      注意： 要轻柔，以免因将耳罩插入太深而破坏动物的耳膜。当正确插入耳杆时，老鼠往往会眨眼。
2. 对于注射麻醉：
   1. 给动物注射适当/推荐剂量的麻醉剂腹腔注射（大鼠 300 μg/kg 芬太尼和 300 μg/kg 美托咪定;小鼠 100 mg/kg 氯胺酮和 10 mg/kg 甲苯噻嗪）并将其放回家笼中。
   2. 注射后 5 分钟检查动物的踏板撤退反射。如果没有，请使用两个耳杆将动物的头部固定到位（图 1A、 7.）。正确作后，耳朵应侧指向耳杆上方。然后，将动物放在牙条上（图 1A 6.）并拧紧杠杆。如果头部仍在移动，请调整耳杆或杠杆锥，将头部固定得更紧。
      注意： 当耳杆插入太深时，可能会破坏动物的耳膜。不要将控制杆拧得太紧。它可以打破动物的鼻子。
   3. 如果观察到踏板撤离反射，请再等待 5-10 分钟。如果仍然观察到，再注射 10% 的先前麻醉剂。
      注意：缓慢增加麻醉剂剂量，中间有一段等待期，以避免动物因窒息而死亡。
   4. 通过调整齿条和/或耳条高度，确保颅骨平坦。
      注意：调整杆时要小心，因为头部会改变角度，鼻锥/杠杆可能会折断动物的鼻子。
3. 在每只眼睛上滴眼药水（例如 Liquigel），以避免它们在手术过程中干燥。将动物的头部从眼睛剃到耳朵。
4. 使用 10% 碘泊维酮对手术区域进行消毒。此外，在切口部位皮内注射局部麻醉剂（例如 0.5% 利多卡因）。建议等待 2-3 分钟，让它起作用，然后再继续。
5. 使用手术刀，从眼睛之间到耳朵之间做一个连续的切口。
   注意：小心不要切得太靠后，因为剪断颈部肌肉会使恢复复杂化。
6. 使用棉签打开伤口并清洁该区域的血液。对于大鼠，使用止血钳保持伤口开放，将它们夹入皮下组织并让它们垂下两侧。对于鼠标，如有必要，请使用微型夹子。
   注意：这是手术中最痛苦的部分。夹住皮下组织而不是皮肤会增加愈合。
7. 将注射器/毛细管（图 1A 1.）沿 z 轴逆时针移动 180°（图 1A 2.）并将其放在动物的头上。确保完全关闭旋钮，以便 z 轴臂在手术过程中不会晃动。
8. 使用显微镜和每个立体定位臂上的旋钮（图 1A 3.-5.）移动玻璃毛细管的钝端（连接到 Hamilton 玻璃注射器; 图 1A 1.）就在前囟的顶部（触摸但不按压骨头）。将数字显示屏上的所有值设置为零（图 1A 8.）。
   注意：前囟（图 1B）是顶骨和额骨的矢状缝和冠状缝合线相交的点。这将是原点。
9. 通过显微镜观察，将毛细管的钝端移动到 lambda 的顶部。如果 z 轴（背侧/腹侧 = DV）值在 +/-0.1 毫米范围内，则动物的头部处于水平状态。如果它更高或更低，请使用齿条相应地调整头部，直到 +/-0.1 毫米以内。
   注意：Lambda（图 1B）定义为顶骨和枕骨的矢状缝和冠状缝合线相交的点。如果可以单独调整耳杆，这种方法也可用于调平颅骨的左侧和右侧。调整杆时要小心，因为头部会改变角度，鼻锥/杠杆可能会折断动物的鼻子。
10. 使用 Allen 脑图谱（图 1C、D）确定所需目标区域的坐标。使用 y 轴（前/后 = AP）和 x 轴（内侧/外侧 = ML）臂将注射器/毛细管移动到正确的位置。
    注意：在对单独的动物进行外科手术之前，应进行染料注射（图 2A-E），以确保坐标对于所用动物的品系/年龄是正确的。
11. 通过显微镜观察，准备在毛细血管的钝端与骨骼相接处小心地钻一个孔。在开始之前，将毛细管在 y 轴上向上移动足够多，这样它在钻孔时就不会损坏。开始在更大的圆圈中钻孔，随着钻孔的深入而变小。钻孔时，将手放在耳杆上以保持稳定。
    注意： 不要一直钻到脑组织。留下一层薄薄的骨头，以免损伤硬脑膜。相反，使用镊子小心地去除剩余的薄骨层。
12. 使用显微镜检查针头的钝端是否可以接触硬脑膜/脑组织而不会被骨块转移。
13. 清洁注射器/毛细管以避免注射液污染。
    1. 将注射器/毛细管完全向上移动，将其浸入含有 3% H₂O₂ 的 1.5 mL 试管中。确保清除玻璃杯上的所有碎屑和血迹。然后，将毛细管浸入含有 H₂O 的 1.5 mL 试管中，以洗掉 H₂O₂。
    2. 从 Hamilton 注射器中取出金属柱塞，并在注射器/毛细管下方，在动物的头部顶部放置纱布。使用装满 PBS 的 1 mL 注射器清洗 Hamilton 注射器，将针头插入顶部并喷出 PBS。在此之后，将金属柱塞插入 Hamilton 注射器。
14. 吸入 1 μL 空气。这将防止 Hamilton 注射器中的 PBS 和注射液在毛细管中混合。然后吸取所需量的注射液。建议小鼠和大鼠每次沉积最多分别为 1 μL 和 2 μL。
    注：每个半球的总剂量不应超过 3 μL /6 μL，因为大脑中的压力会升高太多。使用笔，可以非常小心地在溶液的弯液面所在位置做一个小标记。然后，可以将此标记用作参考点，以衡量溶液是否进入大脑。
15. 对于大鼠，使用 25G 针头刺穿硬脑膜。将毛细管插入大脑至所需的 DV 坐标。将注射器/毛细管移动比预期深 0.1 mm，然后向上拉，为溶液腾出空间。
16. 用手（每 10-15 秒 0.1 μL）或泵（0.4-0.6 μL/min）注入溶液。检查弯液面以确保溶液已完全注射。
    注：如果溶液没有进入大脑，请上下移动注射器/毛细管 0.2 mm。如果仍然没有注入，请重复 步骤 2.13-2.14。针头很可能被脑组织碎片堵塞。
17. 将注射器/毛细管再固定 5 分钟，让注射的溶液分布并降低压力。在此等待期内，注射镇痛药并在必要时标记动物。
18. 将注射器/毛细管向上移动 0.2 mm，再保持 2 分钟。非常缓慢地将注射器/针头拉出，以避免因负压而拉起任何注射的溶液。
19. 注射器/毛细管从大脑中出来后，按照 步骤 2.13 中的说明进行清洁，以防止组织干燥和堵塞毛细管。
20. 继续注射更多的大脑区域或完成手术。
21. 将注射器针头沿 z 轴旋转 180°，将其移到一边，以避免在闭合伤口时破损。然后，用夹子、组织胶或缝合线闭合伤口。如果使用注射麻醉剂，请给动物注射解毒剂。
    注意：不是单独饲养的动物往往会清洁彼此的头部，并可能去除夹子、胶水或缝合物。
22. 从立体定位框架中取出动物，然后将其放入加热垫顶部的干净笼子中。监测动物以确保它醒来时没有并发症。在最初的 24 小时内提供方便的食物和水。

3. 术后护理（持续时间 3-7 天）

1. 在接下来的 2-3 天内（注射毒物最多 10 天），检查动物的体重（可以接受 10% 的体重减轻）、皮毛、粪便和食物/水摄入量，以确保适当恢复。如有必要，隔离动物并提供湿粮、盐水注射和加热垫，这对于某些毒物注射至关重要，因为动物可能有额外的全身问题。
2. 根据当地法规，手术后再给动物注射镇痛药 1-2 天，以确保疼痛缓解。如果缝合线、夹子或胶水没有自行脱落，请在术后 1 周使用异氟醚麻醉动物并去除缝合线、夹子或胶水。

结果

为避免错误靶向，在每次实验之前，使用染料注射验证坐标。使用相同的方案向动物注射 0.2-0.5 μL 色氨酸蓝，注射后毛细血管迅速撤出，大脑迅速冷冻以避免扩散。在切片机上切片后，可以看到注射部位呈蓝色（图 2 C、E）。为确保有效靶向，在实际实验之前，应成功对 2-3 只动物进行染料注射。

立体定向注射可用...

讨论

立体定位注射与任何外科手术一样，保证动物的健康和生存是主要困难的。因此，必须在整个过程中密切监测动物。注意呼吸不规则、呼吸丧失或反射和运动的重复出现应该是主要重点，尤其是对于没有经验的外科医生。此外，镇痛药的应用对于帮助恢复过程至关重要。涉及毒物的手术可能特别难以恢复，应提供额外的湿粮。

除了动物福利外，立体?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Allen brain atlas	Allen Institute	mouse brain - reference atlas
analgesic: ketoprofin OR buprenorphine
anesthetic: Isoflurane OR ketamine / xylazine OR fentanyl / medetomidine
blades - surgical sterile	Oasis Medical	No 10
capillaries - glass	Stoelting	50811
capillary puller	Sutter Instruments	P-97
cotton-tipped applicators	Stoelting	50975
drill - dental	Foredom	MH-170
Ethanol 70%
eye drops (Liquigel)	CVS	NDC 0023-9205-02	Carboxymethylcellulose Sodium (1%), Boric acid; calcium chloride; magnesium chloride; potassium chloride; purified water; PURITE® (stabilized oxychloro complex); sodium borate; and sodium chloride
forceps - full curved	Stoelting	52102-38P
forceps - hemostatic delicate	Stoelting	52110-13
gauze - cotton absorbent
H2O - sterile
H2O2 30%	Sigma Aldrich	216763
Hamilton 5ul syringe	Hamilton Company	7634-01
Hamilton blunt metal needle	Hamilton Company	7770-01
heat pad - far infrared	Kent Scientific	2665967
Iodine solution (Dynarex) 10%	Indemedical	102538
isoflurane	Baxter	1001936040
lidocaine 0.5%
lighter / matches
microscope (Stemi 508 Boom stand)	Zeiss	435064-9000-000
PBS sterile	Gibco - Thermo Fischer	10010-023
pump (injector)	Stoelting	53311
scalpel handle	Stoelting	52171P
shaver - electrical	andis	64800
solution to inject / material to implant
stereotax - small animal digital	Kopf	Model 940
sterilizer - glass bead	BT Lab Systems	BT1703
tubing - heat-shrink	Nelco	NP221-3/64
tweezers - dumont fine curved	Roboz	RS-5045A
underpad - absorbent
vaporizer for isoflurane (package)	Scivena Scientific	M3000
wound clips and applier / remover	Stoelting	59040
wound glue (Vetbond)	3M corporation	1469SB