Stereotaktische intrakranielle Verabreichung von Chemikalien, Proteinen oder viralen Vektoren zur Erforschung der Parkinson-Krankheit

Zusammenfassung

Wir beschreiben, wie man mit Hilfe eines stereotaktischen Rahmens erfolgreich Lösungen in bestimmte Hirnareale von Nagetieren injizieren kann. Diese Überlebensoperation ist eine etablierte Methode, mit der verschiedene Aspekte der Parkinson-Krankheit nachgeahmt werden.

Zusammenfassung

Die Parkinson-Krankheit (PD) ist eine fortschreitende Erkrankung, die traditionell durch Ruhetremor und Akinesie definiert wird, hauptsächlich aufgrund des Verlusts von dopaminergen Neuronen in der Substantia nigra. Betroffene Hirnareale weisen intraneuronale fibrilläre Einschlüsse auf, die hauptsächlich aus alpha-Synuclein (asyn) Proteinen bestehen. Kein Tiermodell hat bisher alle Merkmale dieser Krankheit rekapituliert. Hier beschreiben wir die Verwendung von stereotaktischer Injektion zur intrakraniellen Verabreichung von Chemikalien, Proteinen oder viralen Vektoren, um verschiedene Aspekte der Parkinson-Krankheit nachzuahmen. Diese Methoden sind gut etabliert und im gesamten PD-Bereich weit verbreitet. Stereotaktische Injektionen sind unglaublich flexibel; Sie können in der Konzentration, dem Alter des zur Injektion verwendeten Tieres, dem Zielbereich des Gehirns und der verwendeten Tierart angepasst werden. Kombinationen von Substanzen ermöglichen schnelle Variationen, um Behandlungen zu beurteilen oder den Schweregrad der Pathologie oder Verhaltensdefizite zu verändern. Durch die Injektion von Giftstoffen in das Gehirn können wir Entzündungen und/oder einen starken Verlust von dopaminergen Neuronen nachahmen, was zu erheblichen motorischen Phänotypen führt. Virale Vektoren können verwendet werden, um Zellen zu transduzieren, um genetische oder mechanistische Aspekte nachzuahmen. Vorgeformte fibrilläre asyn-Injektionen rekapitulieren den progressiven Phänotyp am besten über einen längeren Zeitraum. Sobald diese Methoden etabliert sind, kann es wirtschaftlich sein, ein neues Modell zu generieren, verglichen mit der Schaffung einer neuen transgenen Linie. Diese Methode ist jedoch arbeitsintensiv, da sie je nach verwendetem Modell 30 Minuten bis vier Stunden pro Tier benötigt. Jedes Tier hat ein etwas anderes Targeting und bildet daher eine vielfältige Kohorte, deren Ergebnisse einerseits schwer zu interpretieren sein können; Auf der anderen Seite können Sie eine realistischere Vielfalt bei Patienten nachahmen. Falsch anvisierte Tiere können anhand von Verhaltens- oder Bildgebungswerten identifiziert werden, oder erst nach der Tötung, was zu einer kleineren Kohortengröße führt, nachdem die Studie bereits abgeschlossen ist. Insgesamt ist diese Methode eine rudimentäre, aber effektive Methode, um eine Vielzahl von Parkinson-Aspekten zu bewerten.

Einleitung

Die Parkinson-Krankheit (PD) ist eine relativ häufige fortschreitende neurodegenerative Erkrankung, von der bis zu 1 % der Menschen über 60 Jahre betroffen sind^. Die Parkinson-Krankheit ist heterogen, aber klinisch hauptsächlich durch motorische Symptome wie Ruhetremor, Bradykinesie, Akinesie, Steifigkeit, Gangstörung und Haltungsinstabilität gekennzeichnet. Die Mehrzahl der motorischen Symptome tritt typischerweise auf, wenn 60-70% des striatalen Dopamins (DA) infolge einer fortschreitenden und ausgeprägten Neurodegeneration in der Substantia nigra (SN) pars compacta^{verloren gehen 2,3}. Überlebende dopaminerge Neuronen enthalten intrazelluläre Einschlüsse, die als Lewy-Körperchen bekannt sind⁴. Diese Aggregate bestehen hauptsächlich aus Alpha-Synuclein (Asyn), einem kleinen, aber stark exprimierten Protein in Neuronen im Gehirn⁵.

Der zugrundeliegende Mechanismus der Neurodegeneration bei Parkinson ist noch unbekannt. Das Altern ist nach wie vor der größte Risikofaktor für diese Störung⁶. Darüber hinaus ist der Mensch die einzige Spezies, die Parkinson auf natürliche Weise entwickelt. Um die Parkinson-Pathologie zu untersuchen und neue Medikamente zu testen, um das Fortschreiten der Krankheit zu verhindern, wurde daher eine breite Palette von Tiermodellen entwickelt⁷. Im Idealfall sollten Tiermodelle der Parkinson-Krankheit einen altersabhängigen, fortschreitenden Verlust von DA-Neuronen in der SN aufweisen, begleitet von intrazellulären Einschlüssen, gefolgt von einer motorischen Dysfunktion, und auf DA-Ersatztherapien ansprechen. Keines der derzeit verfügbaren Tiermodelle rekapituliert alle klinischen Symptome und Pathologien der Parkinson-Krankheit vollständig. Da jedes Modell unterschiedliche Aspekte der Krankheit aufweist, ist es wichtig, das geeignete Modell für ein Experiment auf der Grundlage der gestellten Fragen sorgfältig abzuwägen.

In der Vergangenheit basierten Tiermodelle auf Giftstoffen wie 6-Hydroxydopamin (6-OHDA) und 1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP) und Pestiziden wie Rotenon und Paraquat⁸. Jedes Giftmittel hat einen anderen Wirkmechanismus und reicht von spezifisch für DA-Neuronen bis hin zu allgemein schädlich für Gehirnzellen. Toxine können je nach Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke entweder oral, intraperitoneal oder direkt in das Gehirn mit stereotaktischen Injektionen verabreicht werden. Im Gegensatz zu anderen Modellen garantieren Toxinmodelle einen hohen Grad an nigrostriatalem dopaminergen Zellverlust und Verhaltensphänotypen. Einige Modelle können sogar eine subtile Pathologie aufweisen. Diese Eigenschaften machen Toxin-PD-Modelle zu einem großartigen Werkzeug für die Untersuchung von Ersatztherapien und der Auswirkungen von Umweltgiften auf den Ausbruch von PD ^9,10.

Darüber hinaus wurden zahlreiche transgene Mausmodelle mit einer Vielzahl von Promotoren und Parkinson-bezogenen Genen generiert¹¹. Die meisten Mäuse weisen eine nigrostriatale Pathologie auf, jedoch ohne eindeutige Hinweise auf Neurodegeneration. Transgene Modelle haben den Vorteil, dass sie zwischen Tieren und Kohorten konsistent sind und nach ihrer Erstellung leicht zu pflegen und zu verteilen sind. Sie führen zwar nicht zu Neurodegeneration, sind aber dennoch nützliche Modelle, um zelluläre Veränderungen zu untersuchen, die durch genetische Varianten und mögliche Wirkstoffkandidaten in einem komplexen In-vivo-System verursacht werden¹².

Im Gegensatz zu transgenen Modellen bietet die virale Vektor-vermittelte Expression von Parkinson-verwandten Genen einen flexibleren Ansatz¹³. Stereotaktische Injektionen ermöglichen die Auswahl verschiedener Gehirnbereiche, Zelltypen und Expressionsniveaus für ein breites Spektrum von Tierarten wie Mäusen, Ratten, Schweinen und nichtmenschlichen Primaten. Zunächst wurden rekombinante virale Vektoren, die für asyn kodieren, verwendet, um Neuronen zu transduzieren, die sich in der SN der Ratte befinden. Proteinakkumulation und zelluläre Dysfunktion gehen einem fortschreitenden dopaminergen Zellverlust voraus, der zu einem Verhaltensdefizit führt. Unterschiede in der Zielbestimmung können zu einer großen Variation des Zellverlusts zwischen den Tieren (30-80%) führen, was für variable Verhaltensdefizite verantwortlich ist, die nur bei etwa 25% der injizierten Ratten beobachtet wurden¹⁴.

Ein kürzlich etabliertes Modell ist die intrakranielle Injektion von vorgeformten Asynfibrillen (PFFs) oder Aggregatextrakten aus Hirngewebe von Mäusen oder Patienten^15,16. Mehrere Studien deuten darauf hin, dass die Injektion von PFFs oder Extrakten zu einer weit verbreiteten asynen Pathologie im tierischen Gehirn sowie zu einem Verlust von dopaminergen Neuronen im SN führt. Die Akkumulation von Asyn tritt in den Neuronen auf, die den injizierten Bereich innervieren. Im Gegensatz zu viralen vektorbasierten Modellen entwickelt sich das PFF-Modell langsam über mehrere Monate, gefolgt von motorischen Defiziten nach 6 Monaten. Dieses Modell hat ein großes Potenzial für die Untersuchung des Mechanismus oder der Prävention der asynen Pathologie^17,18.

Alle oben genannten Modelle sind gut etabliert und werden mehrfach verwendet, um verschiedene Aspekte der menschlichen Störung zu untersuchen. Stereotaktische Injektionen von Substanzen direkt in das Gehirn haben bei der Entwicklung dieser Tiermodelle nicht nur im Bereich der Parkinson-Krankheit, sondern auch bei anderen neurologischen Erkrankungen eine große Rolle gespielt. Die stereotaktische Chirurgie ist zwar arbeitsintensiv, hat aber den Vorteil, dass sie sehr flexibel in Bezug auf das Alter der verwendeten Tiere, die Zielregion des Gehirns und die Injektion von Substanzen ist und je nach Forschungsfrage angepasst werden kann. Zum Beispiel können Substanzen einzeln oder in Kombination (Vektor + Fibrillen oder Toxin + Vektor) injiziert werden, um weitere Aspekte der Krankheit zu rekapitulieren oder Behandlungen zu bewerten^19,20. Darüber hinaus können Substanzen einseitig injiziert werden, wobei die nicht injizierte Seite als interne Kontrolle zur Bewertung des Verhaltens sowie der Neurodegeneration verbleibt. Daher werden in diesem Manuskript detaillierte Schritte zur Generierung von Parkinson-Modellen unter Verwendung stereotaktischer Injektionen beschrieben.

Protokoll

Alle Experimente in dieser Studie wurden in strikter Übereinstimmung mit den Empfehlungen des Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health durchgeführt und von den Animal Care and Use Committees des US National Institute on Aging genehmigt.

Bevor Sie beginnen, stellen Sie bitte sicher, dass Sie die entsprechende Schulung und ethische Genehmigung Ihres Instituts erhalten haben, die für die Durchführung dieses Verfahrens erforderlich ist. Darüber hinaus sollten verwendete Anästhetika (z. B. Ketamin und Buprenorphin oder Fentanyl und Medetomidin) gemäß den einschlägigen Regeln Ihrer Institution erworben und gehandhabt werden.

1. Vorbereitung (Dauer 1 Stunde)

1. Bringen Sie die Tiere in den Operationssaal und lassen Sie sie sich akklimatisieren, während Sie den Operationsbereich einrichten. Ziehen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA) an.
   HINWEIS: Dies kann von den örtlichen Sicherheitsvorschriften und der injizierten Substanz abhängen. Virale Vektoren benötigen meist PSA der Biosicherheitsstufe 2. Tragen Sie im Allgemeinen zumindest eine Maske, Handschuhe und einen Einweg-Laborkittel. Unter bestimmten Umständen sollten zusätzliche Handschuhe und eine Schutzbrille verwendet werden.
2. Sterilisieren Sie die chirurgischen Instrumente entweder mit einem Autoklaven oder einem Glasperlensterilisator. Für Nagetiere benötigen Sie einen Skalpellgriff, eine hämostatische Pinzette, eine Dumont-Pinzette, eine gebogene Pinzette, ein Wundverschlussset (Clips) oder eine Schere und Pinzette (für Nähte) und einen Bohrkopf.
3. Desinfizieren Sie den Operationsbereich und das stereotaktische Instrument mit 70 % Ethanol und decken Sie den Bereich neben dem stereotaktischen Instrument entweder mit sauberen Papiertüchern oder einem sterilen saugfähigen Tuch ab.
4. Geben Sie Folgendes auf die Handtücher: Augentropfen (z. B. Liquigel), Haarschneider, Wattestäbchen, verdünntes Iodixanol, chirurgische Einwegklinge, chirurgischer Bohrer mit desinfiziertem Bohrer, Marker oder Ohrabschneider, steriles H₂O in einem 1,5 mL Röhrchen, 1,5 ml Röhrchen mit 3 % H₂O₂ in sterilem H₂O (1,35 mL von H₂O + 0,15 mL von 30 % H₂O_2, frisch zubereitet), eine 1-ml-Spritze mit 33G-Nadel und sterilem PBS oder Kochsalzlösung, Spritze mit Analgetikum und Gegenmittel, wenn injizierbare Anästhesie verwendet wird (z. B. Atipamezol + Buprenorphin/Ketoprofen; frisch zubereitet und in der ethischen Genehmigung zugelassen) und autoklavierte chirurgische Instrumente.
5. Isofluran auffüllen und bei Gasanästhesie die Drücke O₂ und N₂ prüfen. Lege ein Papiertuch auf den Boden der Inhalationskammer, um sie trocken und sauber zu halten.
   Mischen und bereiten Sie das Anästhetikum (z. B. Fentanyl + Medetomidin (für Ratten) oder Ketamin + Xylazin-Lösung (für Mäuse)) frisch vor, wenn Sie eine injizierbare Anästhesie verwenden und wenn dies in der ethischen Genehmigung genehmigt ist.
6. Montieren Sie die Hamilton-Glasspritze und die Glaskapillare (Abbildung 1A 1.).
   1. Lege die gezogene Glaskapillare auf den Tisch. Platzieren Sie Ihren Zeigefinger an der Stelle, an der die Kapillare dünner wird, und das Nagelende an der Stelle, an der die Kapillare geschnitten werden sollte.
      HINWEIS: Abhängig von der Tiefe Ihrer Injektion zwischen 0,5 und 2 cm.
   2. Kratzen Sie mit dem Rand einer Keramikfliese vorsichtig einige Male vorsichtig auf das Nadelteil. Nehmen Sie eine Glaskapillare in eine Hand und greifen Sie mit Daumen und Zeigefinger nach dem dünnen Nadelteil. Von der Mitte bis zum Ende ziehen, bis die Nadel stumpf abbricht.
      HINWEIS: Wenn es nicht funktioniert oder die Nadel mit der Kante abbricht, wiederholen Sie den Vorgang einige Male. Wenn es immer noch nicht abbricht, wiederholen Sie das Kratzen der Fliesen. Achten Sie darauf, dass das Nadelteil nicht zu dünn ist (>50 μm Durchmesser) und sich nicht leicht verbiegt.
7. Verschließen Sie die Glaskapillare mit der Hamilton-Spritze.
   1. Befestigen Sie 1 cm Schrumpfschlauch über der stumpfen Metallnadel, die an der Hamilton-Glasspritze befestigt ist. Legen Sie dann das dicke Ende der Glaskapillare über die Hamilton-Metallnadel.
   2. Platzieren Sie den Schrumpfschlauch über der Hälfte der Glaskapillare und achten Sie darauf, dass zwischen dem Ende der Hamilton-Metallnadel und dem konischen Übergang der Kapillare mindestens 1 cm Abstand bleibt. Dies ist der Raum, in dem sich später die gewünschte Injektionslösung befindet.
   3. Verwenden Sie ein Feuerzeug oder Streichholz, um den Schrumpfschlauch zu erhitzen und die Injektionsnadel zu versiegeln.
      HINWEIS: Es gibt verschiedene Halteroptionen, mit denen Sie die Hamilton-Spritze am stereotaktischen Arm auf der linken Seite befestigen können. Stellen Sie sicher, dass Sie die Zahlen auf der Hamilton-Spritze noch lesen können. Wenn Sie eine Pumpe verwenden, um die Lösung zu injizieren, befestigen Sie die Pumpe am stereotaktischen Arm und befestigen Sie die Hamilton-Spritze an der Pumpe.
8. Entfernen Sie den Metallkolben. Führen Sie eine 27G-Nadel, die an einer mit Kochsalzlösung oder PBS gefüllten 1-ml-Spritze befestigt ist, in den oberen Teil der Hamilton-Spritze ein. Spülen Sie die Hamilton-Spritze mit PBS, um zu überprüfen, ob sie dicht ist, und um alle Luftblasen auszuspülen.
   HINWEIS: Luftblasen stören die Aufnahme und Injektion Ihrer Lösung, da Luft mehr komprimiert als Flüssigkeit.
9. Sobald alles überprüft und bereit ist, öffnen Sie die kleine Schraube am Z-Achsen-Arm (Abbildung 1A 2.) des stereotaktischen Instruments und drehen Sie den Arm in 90°-Schritten im Uhrzeigersinn, um die Glasspritze/Kapillare aus dem Weg zu räumen (um zu vermeiden, dass die Kapillare bricht, während das Tier am stereotaktischen Instrument befestigt wird).
   HINWEIS: Überprüfen Sie, ob alle Stereotax-Winkel und -Einstellungen auf die gewünschten Parameter (normalerweise 0°) eingestellt sind, Zahnstangen und Ohrbügel auf die gewünschten Koordinaten eingestellt sind und die Hamilton-Spritze/Kapillare alle gerade sind.
10. Schalten Sie das Heizkissen auf der Stereotax-Plattform ein und verwenden Sie eine zusätzliche Polsterung darüber, wenn es zu warm ist. Stellen Sie einen leeren, sauberen Käfig mit einem zusätzlichen Wärmekissen neben die Operationsfläche.

2. Operation (Dauer durchschnittlich 1 Stunde pro Tier)

1. Für die Gasanästhesie
   1. Isofluran auf 5% mit einem N₂ + O₂ Luftstrom (ca. 1 L/min) einschalten und das Ventil zur Inhalationskammer öffnen. Setzen Sie das Tier in die Kammer und stellen Sie sicher, dass es gut verschlossen ist. Beobachten Sie die Atmung, bis sie sich deutlich verlangsamt hat (tiefes Atmen).
   2. Sobald das Tier bewusstlos ist, öffnen Sie das Ventil zum stereotaktischen Instrument und schließen Sie das Kammerventil. Setze Isofluran auf 2%.
   3. Öffnen Sie die Kammer und nehmen Sie das Tier heraus, das es am Hals hält, öffnen Sie das Maul mit der Pinzette und setzen Sie das Tier auf die Zahnstange (Abbildung 1A 6.), wobei die vorderen oberen Zähne in das Loch passen.
      HINWEIS: Dieser Schritt ist zeitkritisch, da das Tier wieder aufwachen kann, ohne Isofluran einzuatmen.
   4. Legen Sie den Nasenkegel über die Schnauze und beobachten Sie die Atmung, um einen gleichmäßigen Rhythmus ohne erzwungene Atmung zu gewährleisten. Stellen Sie sicher, dass das Tier tief betäubt ist, indem Sie überprüfen, ob die Pedalrückzugsreflexe der Hinterbeine nicht vorhanden sind, bevor Sie fortfahren.
      HINWEIS: Überprüfen Sie während des gesamten Eingriffs immer wieder, ob das Tier nicht aufhört zu atmen oder aufwacht. Falls erforderlich, passen Sie den prozentualen Isoflurangehalt in kleinen Schritten an. Um den Pedalrückzugsreflex der Hinterbeine zu testen, verwenden Sie eine Pinzette und kneifen Sie die Hinterpfote zusammen. Wenn das Tier die Gliedmaße zurückzieht (Reflex zur Entfernung von Schmerzreizen), ist die Anästhesie zu niedrig.
   5. Fixieren Sie den Kopf des Tieres mit den beiden Ohrstangen (Abbildung 1A 7.). Wenn es richtig gemacht wird, sollten die Ohren seitlich über die Ohrbügel zeigen. Wenn sich der Kopf noch bewegt, passen Sie die Ohrbügel oder den Nasenkonus an, um den Kopf fester zu fixieren.
      HINWEIS: Seien Sie vorsichtig, um zu vermeiden, dass das Trommelfell der Tiere bricht, indem Sie die Ohrbügel zu tief einführen. Ratten neigen dazu, zu blinzeln, wenn die Ohrstange richtig eingesetzt ist.
2. Für injizierbare Anästhesie:
   1. Injizieren Sie dem Tier eine angemessene/empfohlene Dosis i.p. Anästhesie (300 μg/kg Fentanyl und 300 μg/kg Medetomidin bei Ratten; 100 mg/kg Ketamin und 10 mg/kg Xylazin bei Mäusen) und setzen Sie es zurück in den Heimkäfig.
   2. Überprüfen Sie die Pedalrückzugsreflexe der Tiere 5 Minuten nach der Injektion. Wenn nicht vorhanden, fixieren Sie den Kopf des Tieres mit den beiden Ohrstangen (Abbildung 1A 7.). Wenn es richtig gemacht wird, sollten die Ohren seitlich über die Ohrbügel zeigen. Setzen Sie anschließend das Tier auf die Zahnstange (Abbildung 1A 6.) und schrauben Sie den Hebel fest. Wenn sich der Kopf noch bewegt, stellen Sie die Ohrbügel oder den Hebelkonus ein, um den Kopf fester zu fixieren.
      HINWEIS: Es ist möglich, dass das Trommelfell eines Tieres bricht, wenn die Ohrbügel zu tief eingeführt werden. Schrauben Sie den Hebel nicht zu fest an. Es kann den Tieren die Nase brechen.
   3. Wenn die Reflexe des Pedalzurückziehens beobachtet werden, warten Sie weitere 5-10 Minuten. Wenn immer noch beobachtet, injizieren Sie weitere 10% des vorherigen Anästhetikums.
      HINWEIS: Erhöhen Sie die Narkosedosis langsam mit einer Wartezeit dazwischen, um den Tod des Tieres durch Ersticken zu vermeiden.
   4. Stellen Sie sicher, dass der Schädel flach ist, indem Sie die Höhe der Zahnstange und/oder der Ohrstange anpassen.
      HINWEIS: Seien Sie vorsichtig beim Einstellen der Stangen, da sich der Winkel des Kopfes ändert und der Nasenkegel/Hebel die Nase der Tiere brechen kann.
3. Tragen Sie Augentropfen auf jedes Auge auf (z. B. Liquigel), um ein Austrocknen während der Operation zu vermeiden. Rasieren Sie den Kopf des Tieres von den Augen bis zu den Ohren.
4. Desinfizieren Sie den Operationsbereich mit 10% Jodopovidon. Injizieren Sie zusätzlich ein Lokalanästhetikum (z. B. 0,5 % Lidocain) intradermal an der Stelle des Einschnitts. Es wird empfohlen, 2-3 Minuten zu warten, bis es wirkt, bevor Sie fortfahren.
5. Machen Sie mit dem Skalpell einen kontinuierlichen Schnitt zwischen den Augen bis zwischen den Ohren.
   HINWEIS: Achten Sie darauf, nicht zu weit nach hinten zu schneiden, da das Durchtrennen der Nackenmuskulatur die Regeneration erschwert.
6. Verwenden Sie die Wattestäbchen, um die Wunde zu öffnen und den Bereich von Blut zu reinigen. Bei Ratten verwenden Sie die hämostatische Pinzette, um die Wunde offen zu halten, indem Sie sie in das Unterhautgewebe klemmen und an jeder Seite herunterhängen lassen. Bei Mäusen verwenden Sie ggf. Mikroclips.
   HINWEIS: Dies ist der schmerzhafteste Teil des Eingriffs. Das Einklemmen des Unterhautgewebes anstelle der Haut erhöht die Heilung.
7. Bewegen Sie die Spritze/Kapillare (Abbildung 1A 1.) um 180° gegen den Uhrzeigersinn auf der z-Achse (Abbildung 1A 2.) und führen Sie sie über den Kopf des Tieres. Achten Sie darauf, den Knopf vollständig zu schließen, damit der Z-Achsen-Arm während der Operation nicht wackelt.
8. Verwenden Sie das Mikroskop und die Knöpfe an jedem stereotaktischen Arm (Abbildung 1A 3.-5.), um das stumpfe Ende der Glaskapillare (an der Hamilton-Glasspritze befestigt; Abbildung 1A 1.) Direkt auf dem Bregma (berührt den Knochen, drückt aber nicht auf ihn). Stellen Sie alle Werte auf der Digitalanzeige auf Null (Abbildung 1A 8.).
   HINWEIS: Das Bregma (Abbildung 1B) ist der Punkt, an dem sich die sagittalen und koronalen Nähte des Scheitel- und des Stirnknochens treffen. Dies wird der Ausgangspunkt sein.
9. Wenn Sie durch das Mikroskop schauen, bewegen Sie das stumpfe Ende der Kapillare direkt auf das Lambda. Liegt der Wert der z-Achse (dorsal/ventral = DV) innerhalb von +/-0,1 mm, wird der Kopf des Tieres nivelliert. Wenn er höher oder niedriger ist, stellen Sie den Kopf mit dem Zahnbalken entsprechend ein, bis er auf +/-0,1 mm genau ist.
   HINWEIS: Lambda (Abbildung 1B) ist definiert als der Punkt, an dem sich die sagittalen und koronalen Nähte des Parietal- und des Hinterhauptknochens treffen. Diese Methode könnte auch zur Nivellierung der linken und rechten Schädelseite verwendet werden, wenn die Ohrbügel individuell angepasst werden können. Seien Sie vorsichtig beim Einstellen der Stangen, da sich der Winkel des Kopfes ändert und der Nasenkegel / Hebel die Nase des Tieres brechen kann.
10. Verwenden Sie den Allen-Gehirnatlas (Abbildung 1C, D), um die Koordinaten für Ihre gewünschte Zielregion zu identifizieren. Verwenden Sie die Arme der y-Achse (anterior/posterior = AP) und der x-Achse (medial/lateral = ML), um die Spritze/Kapillare in die richtige Position zu bewegen.
    HINWEIS: Färbeinjektionen (Abbildung 2A-E) sollten vor chirurgischen Eingriffen an getrennten Tieren durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass die Koordinaten für den Stamm/das Alter der verwendeten Tiere korrekt sind.
11. Schauen Sie durch das Mikroskop und bereiten Sie sich darauf vor, vorsichtig ein Loch zu bohren, wo das stumpfe Ende der Kapillare auf den Knochen trifft. Bevor Sie beginnen, bewegen Sie die Kapillare auf der y-Achse so weit nach oben, dass sie beim Bohren nicht beschädigt wird. Beginnen Sie mit dem Bohren in einem größeren Kreis und werden Sie kleiner, je tiefer Sie bohren. Legen Sie die Hand beim Bohren auf eine Ohrstange, um sie ruhig zu halten.
    HINWEIS: Bohren Sie nicht bis zum Gehirngewebe. Lassen Sie eine dünne Schicht Knochen übrig, um Schäden an der Dura zu vermeiden. Verwenden Sie stattdessen eine Pinzette, um die verbleibende dünne Knochenschicht vorsichtig zu entfernen.
12. Prüfen Sie mit dem Mikroskop, ob das stumpfe Ende der Nadel die Dura / das Hirngewebe berühren kann, ohne von Knochenstücken abgelenkt zu werden.
13. Reinigen Sie die Spritze/Kapillare, um eine Kontamination der Injektionslösung zu vermeiden.
    1. Bewegen Sie die Spritze/Kapillare ganz nach oben und tauchen Sie sie in das 1,5-ml-Röhrchen mit 3 % H₂O₂. Stellen Sie sicher, dass Sie alle Ablagerungen und Blut vom Glas entfernen. Tauchen Sie dann die Kapillare in das 1,5-ml-Röhrchen mit H₂O, um das H₂O₂ abzuwaschen.
    2. Entfernen Sie den Metallkolben von der Hamilton-Spritze und legen Sie eine Gaze unter die Spritze/Kapillare auf den Kopf des Tieres. Verwenden Sie die mit PBS gefüllte 1-ml-Spritze, um die Hamilton-Spritze zu waschen, indem Sie die Nadel in den oberen Bereich einführen und PBS herausspritzen. Führen Sie danach den Metallkolben in die Hamilton-Spritze ein.
14. Es wird 1 μl Luft angesaugt. Dadurch wird verhindert, dass sich das PBS in der Hamilton-Spritze und die Injektionslösung in der Kapillare vermischen. Ziehen Sie dann die gewünschte Menge der Injektionslösung auf. Für Mäuse bzw. Ratten wird eine maximale Dosis von 1 μl und 2 μl pro Ablagerung empfohlen.
    HINWEIS: Insgesamt sollten 3 μL /6 μL pro Hemisphäre nicht überschritten werden, da der Druck im Gehirn zu stark ansteigt. Mit einem Stift kann sehr vorsichtig eine kleine Markierung gemacht werden, wo sich der Meniskus der Lösung befindet. Diese Markierung kann dann als Referenzpunkt verwendet werden, um zu beurteilen, ob die Lösung in das Gehirn gelangt.
15. Bei Ratten verwenden Sie eine 25-G-Nadel, um die Dura zu punktieren. Führen Sie die Kapillare bis zur gewünschten DV-Koordinate in das Gehirn ein. Bewegen Sie die Spritze/Kapillare 0,1 mm tiefer als vorgesehen und ziehen Sie sie wieder nach oben, um Platz für die Lösung zu schaffen.
16. Injizieren Sie die Lösung entweder von Hand (0,1 μl pro 10-15 Sekunden) oder mit einer Pumpe (0,4-0,6 μl/min). Überprüfen Sie den Meniskus, um sicherzustellen, dass die Lösung vollständig injiziert ist.
    HINWEIS: Wenn die Lösung nicht in das Gehirn gelangt, bewegen Sie die Spritze/Kapillare 0,2 mm auf und ab. Wenn es immer noch nicht injiziert, wiederholen Sie die Schritte 2.13-2.14. Höchstwahrscheinlich ist die Nadel mit Hirngeweberesten verstopft.
17. Halten Sie die Spritze/Kapillare weitere 5 Minuten an Ort und Stelle, damit sich die injizierte Lösung verteilen und der Druck sinken kann. Während dieser Wartezeit injizieren Sie das Analgetikum und markieren Sie das Tier gegebenenfalls.
18. Bewegen Sie die Spritze/Kapillare um 0,2 mm nach oben und halten Sie sie für weitere 2 Minuten an Ort und Stelle. Ziehen Sie die Spritze/Nadel sehr langsam heraus, um zu vermeiden, dass die injizierte Lösung aufgrund des Unterdrucks hochgezogen wird.
19. Sobald die Spritze/Kapillare aus dem Gehirn entfernt ist, reinigen Sie sie wie in Schritt 2.13 beschrieben, um zu verhindern, dass das Gewebe austrocknet und die Kapillare verstopft.
20. Fahren Sie mit der Injektion weiterer Gehirnbereiche fort oder beenden Sie die Operation.
21. Schieben Sie die Spritzennadel zur Seite, indem Sie sie um 180° auf der z-Achse drehen, um einen Bruch beim Schließen der Wunde zu vermeiden. Verschließen Sie dann die Wunde entweder mit Klammern, Gewebekleber oder Nähten. Wenn eine injizierbare Anästhesie angewendet wurde, injizieren Sie dem Tier das Gegenmittel.
    HINWEIS: Tiere, die nicht einzeln untergebracht sind, neigen dazu, sich gegenseitig den Kopf zu reinigen und möglicherweise Klammern, Kleber oder Stiche zu entfernen.
22. Nehmen Sie das Tier aus dem stereotaktischen Rahmen und setzen Sie es in den sauberen Käfig auf dem Heizkissen. Überwachen Sie das Tier, um sicherzustellen, dass es ohne Komplikationen aufwacht. Sorgen Sie in den ersten 24 Stunden für einen einfachen Zugang zu Futter und Wasser.

3. Nachsorge (Dauer 3-7 Tage)

1. Überprüfen Sie das Gewicht (10 % Gewichtsverlust ist akzeptabel), das Fell, den Kot und die Nahrungs-/Wasseraufnahme des Tieres in den nächsten 2-3 Tagen (bis zu 10 Tage bei der Injektion von Giftstoffen), um eine ordnungsgemäße Genesung sicherzustellen. Falls erforderlich, isolieren Sie das Tier und stellen Sie Nassfutter, Kochsalzinjektionen und ein Heizkissen zur Verfügung, das für einige Giftstoffinjektionen unerlässlich ist, da die Tiere zusätzliche systemische Probleme haben können.
2. Injizieren Sie den Tieren weitere 1-2 Tage nach der Operation ein Analgetikum, um eine Schmerzlinderung gemäß den örtlichen Vorschriften zu gewährleisten. Wenn sich Nähte, Clips oder Kleber nicht von selbst lösen, verwenden Sie Isofluran, um das Tier zu betäuben, und entfernen Sie Nähte, Clips oder Kleber 1 Woche nach der Operation.

Ergebnisse

Um Fehlausrichtungen zu vermeiden, überprüfen Sie vor jedem Experiment die Koordinaten mithilfe von Farbstoffinjektionen. Den Tieren wurden 0,2-0,5 μl Tryptophanblau nach dem gleichen Protokoll injiziert, die Kapillaren wurden nach der Injektion schnell entnommen und das Gehirn schnell eingefroren, um eine Diffusion zu vermeiden. Nach dem Schnitt auf dem Mikrotom ist die Injektionsstelle blau zu sehen (Abbildung 2 C,E). Um eine effektive ...

Diskussion

Die stereotaktische Injektion hat, wie jeder chirurgische Eingriff, die Hauptschwierigkeit, das Wohlbefinden und das Überleben des Tieres zu gewährleisten. Daher ist es wichtig, das Tier während des gesamten Eingriffs genau zu überwachen. Die Achtsamkeit auf Atemstörungen, Atemverlust oder das Wiederauftreten von Reflexen und Bewegungen sollte das Hauptaugenmerk sein, insbesondere für unerfahrene Chirurgen. Darüber hinaus ist die Anwendung von Analgetika von entscheidender Bedeutu...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Allen brain atlas	Allen Institute	mouse brain - reference atlas
analgesic: ketoprofin OR buprenorphine
anesthetic: Isoflurane OR ketamine / xylazine OR fentanyl / medetomidine
blades - surgical sterile	Oasis Medical	No 10
capillaries - glass	Stoelting	50811
capillary puller	Sutter Instruments	P-97
cotton-tipped applicators	Stoelting	50975
drill - dental	Foredom	MH-170
Ethanol 70%
eye drops (Liquigel)	CVS	NDC 0023-9205-02	Carboxymethylcellulose Sodium (1%), Boric acid; calcium chloride; magnesium chloride; potassium chloride; purified water; PURITE® (stabilized oxychloro complex); sodium borate; and sodium chloride
forceps - full curved	Stoelting	52102-38P
forceps - hemostatic delicate	Stoelting	52110-13
gauze - cotton absorbent
H2O - sterile
H2O2 30%	Sigma Aldrich	216763
Hamilton 5ul syringe	Hamilton Company	7634-01
Hamilton blunt metal needle	Hamilton Company	7770-01
heat pad - far infrared	Kent Scientific	2665967
Iodine solution (Dynarex) 10%	Indemedical	102538
isoflurane	Baxter	1001936040
lidocaine 0.5%
lighter / matches
microscope (Stemi 508 Boom stand)	Zeiss	435064-9000-000
PBS sterile	Gibco - Thermo Fischer	10010-023
pump (injector)	Stoelting	53311
scalpel handle	Stoelting	52171P
shaver - electrical	andis	64800
solution to inject / material to implant
stereotax - small animal digital	Kopf	Model 940
sterilizer - glass bead	BT Lab Systems	BT1703
tubing - heat-shrink	Nelco	NP221-3/64
tweezers - dumont fine curved	Roboz	RS-5045A
underpad - absorbent
vaporizer for isoflurane (package)	Scivena Scientific	M3000
wound clips and applier / remover	Stoelting	59040
wound glue (Vetbond)	3M corporation	1469SB