Стереотаксическая внутричерепная доставка химических веществ, белков или вирусных векторов для изучения болезни Паркинсона

Резюме

Мы описываем, как успешно вводить растворы в определенные области мозга грызунов с помощью стереотаксической рамки. Эта операция по выживанию является хорошо зарекомендовавшим себя методом, используемым для имитации различных аспектов болезни Паркинсона.

Аннотация

Болезнь Паркинсона (БП) — это прогрессирующее заболевание, традиционно характеризующееся тремором покоя и акинезией, в первую очередь из-за потери дофаминергических нейронов в черной субстанции. Пораженные участки мозга демонстрируют внутринейрональные фибриллярные включения, состоящие в основном из белков альфа-синуклеина (асин). Ни одна животная модель до сих пор не повторила все характеристики этого заболевания. В этой статье мы описываем использование стереотаксической инъекции для доставки химических веществ, белков или вирусных векторов внутричерепно, чтобы имитировать различные аспекты БП. Эти методы хорошо зарекомендовали себя и широко используются в области ПД. Стереотаксические инъекции невероятно гибкие; Они могут быть отрегулированы по концентрации, возрасту животного, используемого для инъекции, целевой области мозга и виду используемых животных. Комбинации веществ позволяют быстро варьировать методы лечения или изменять тяжесть патологии или поведенческие нарушения. Вводя токсины в мозг, мы можем имитировать воспаление и/или серьезную потерю дофаминергических нейронов, что приводит к значительным моторным фенотипам. Вирусные векторы могут быть использованы для трансдукции клеток с целью имитации генетических или механистических аспектов. Предварительно сформированные фибриллярные инъекции азина лучше всего повторяют прогрессирующий фенотип в течение длительного периода времени. Как только эти методы будут разработаны, создание новой модели может быть экономически выгодным по сравнению с созданием новой трансгенной линии. Тем не менее, этот метод является трудоемким, так как требует от 30 минут до четырех часов на животное в зависимости от используемой модели. Каждое животное будет иметь немного разное нацеливание и, следовательно, создаст разнообразную когорту, результаты которой, с одной стороны, может быть сложно интерпретировать; С другой стороны, они помогают имитировать более реалистичное разнообразие, обнаруженное у пациентов. Неправильно нацеленные животные могут быть идентифицированы с помощью поведенческих или визуализирующих показаний или только после того, как они были принесены в жертву, что приводит к уменьшению размера когорты после того, как исследование уже было завершено. В целом, этот метод является рудиментарным, но эффективным способом оценки разнообразного набора аспектов БП.

Введение

Болезнь Паркинсона (БП) является относительно распространенным прогрессирующим нейродегенеративным заболеванием, поражающим до 1 % людей в возрасте старше 60^лет. БП является гетерогенным, но клинически характеризуется в основном двигательными симптомами, включая тремор в покое, брадикинезию, акинезию, ригидность, нарушение походки и постуральную нестабильность. Большинство моторных симптомов обычно появляются, когда 60-70% дофамина полосатого тела (DA) теряется в результате прогрессирующей и отчетливой нейродегенерации в черной субстанции (SN) pars compacta ^2,3. Выжившие дофаминергические нейроны содержат внутриклеточные включения, известные как тельца Леви⁴. Эти агрегаты в основном состоят из альфа-синуклеина (асина), небольшого, но высоко экспрессирующегося белка в нейронах мозга⁵.

Основной механизм нейродегенерации при БП до сих пор неизвестен. Старение по-прежнему является самым большим фактором риска развития этого расстройства⁶. Кроме того, люди являются единственным видом, у которого болезнь Паркинсона развивается естественным образом. Таким образом, для исследования патологии болезни Паркинсона и тестирования новых лекарств для предотвращения прогрессирования заболевания^{был разработан широкий} спектр животных моделей. В идеале животные модели БП должны демонстрировать возрастную прогрессирующую потерю нейронов DA в SN, сопровождающуюся внутриклеточными включениями с последующей двигательной дисфункцией, и быть чувствительными к заместительной терапии DA. Ни одна из имеющихся в настоящее время животных моделей не воспроизводит полностью все клинические симптомы и патологию БП. Поскольку каждая модель представляет различные аспекты заболевания, важно тщательно обдумать подходящую модель для использования в эксперименте на основе заданных вопросов.

Исторически сложилось так, что животные модели основывались на токсикантах, включая 6-гидроксидофамин (6-OHDA) и 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин (MPTP), а также пестицидах, таких как ротенон и паракват⁸. Каждый токсикант имеет свой механизм действия и варьируется от специфических для нейронов DA до в целом вредных для клеток мозга. Токсины могут вводиться перорально, внутрибрюшинно или непосредственно в мозг с помощью стереотаксических инъекций в зависимости от проницаемости гематоэнцефалического барьера. В отличие от других моделей, токсинные модели гарантируют высокую степень нигростриарной потери дофаминергических клеток и поведенческие фенотипы. У некоторых моделей может даже проявляться малозаметная патология. Эти особенности делают модели токсинов PD отличным инструментом для изучения заместительной терапии и влияния токсинов окружающей среды на возникновение PD ^9,10.

Кроме того, были созданы многочисленные трансгенные модели мышей с использованием различных промоторов и генов, связанных с болезнью Паркинсона¹¹. У большинства мышей наблюдается нигростриарная патология, но нет явных признаков нейродегенерации. Преимущество трансгенных моделей заключается в том, что они согласованы между животными и когортами, а после создания их легко поддерживать и распространять. Несмотря на то, что они не приводят к нейродегенерации, они, тем не менее, являются полезными моделями для исследования клеточных изменений, вызванных генетическими вариантами и возможными кандидатами в лекарства в комплексной системе in vivo¹².

В отличие от трансгенных моделей, опосредованная вирусным вектором экспрессия генов, связанных с болезнью Паркинсона, предлагает более^{гибкий подход.} Стереотаксические инъекции позволяют выбирать различные области мозга, типы клеток и уровни экспрессии для широкого спектра видов животных, таких как мыши, крысы, свиньи и приматы. Первоначально для трансдукции нейронов, расположенных в SN крысы, использовались рекомбинантные вирусные векторы, кодирующие asyn. Накопление белка и клеточная дисфункция предшествуют прогрессирующей дофаминергической потере клеток, что приводит к поведенческому дефициту. Различия в нацеливании могут привести к большой вариабельности потери клеток у разных животных (30-80%), что ответственно за вариабельный поведенческий дефицит, наблюдаемый только у примерно 25% инъекционных крыс¹⁴.

Недавно созданной моделью является внутричерепное введение предварительно сформированных азиновых фибрилл (PFF) или агрегатных экстрактов из тканей мозга мыши или пациента^15,16. Многочисленные исследования показывают, что инъекции PFF или экстрактов приводят к широко распространенной asyn-патологии в мозге животных, а также к потере дофаминергических нейронов в SN. Накопление азина появляется в нейронах, иннервирующих область введения. В отличие от моделей, основанных на вирусных векторах, модель PFF развивается медленно в течение нескольких месяцев с последующим моторным дефицитом через 6 месяцев. Данная модель имеет большой потенциал для изучения механизма или профилактики asyn-патологии^17,18.

Все упомянутые выше модели хорошо зарекомендовали себя и многократно использовались для изучения различных аспектов человеческого расстройства. Стереотаксические инъекции веществ непосредственно в мозг сыграли большую роль в развитии этих животных моделей не только в области БП, но и других неврологических расстройств. Несмотря на трудоемкость, стереотаксическая хирургия имеет преимущества в том, что она очень гибкая в зависимости от возраста используемых животных, целевой области мозга и вводимого вещества, а также может быть скорректирована в зависимости от заданного исследовательского вопроса. Например, вещества могут вводиться по отдельности или в комбинации (вектор + фибриллы или токсикант + вектор) для повторения большего количества аспектов заболевания или оценки методов лечения^19,20. Кроме того, вещества могут вводиться в одностороннем порядке, оставляя неинъекционную сторону в качестве внутреннего контроля для оценки поведения, а также нейродегенерации. Поэтому в данной рукописи будут подробно описаны шаги по созданию моделей ПД с использованием стереотаксических инжекций.

протокол

Все эксперименты в этом исследовании проводились в строгом соответствии с рекомендациями в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных Национальных институтов здравоохранения и одобрены комитетами по уходу за животными и их использованию Национального института старения США.

Прежде чем начать, убедитесь, что вы прошли соответствующее обучение и получили этическое одобрение от вашего института, необходимое для выполнения этой процедуры. Кроме того, используемые анестетики (например, кетамин и бупренорфин или фентанил и медетомидин) должны быть приобретены и обработаны в соответствии с соответствующими правилами вашего учреждения.

1. Подготовка (продолжительность 1 час)

1. Приведите животных в операционную и дайте им акклиматизироваться, пока они обустраивают операционную зону. Наденьте соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это может зависеть от местных правил безопасности и введенного вещества. Вирусные векторы в основном нуждаются в СИЗ уровня биобезопасности 2. Как правило, как минимум надевайте маску, перчатки и одноразовый лабораторный халат. В определенных обстоятельствах следует использовать дополнительные перчатки и защитные очки.
2. Простерилизуйте хирургические инструменты с помощью автоклава или стерилизатора со стеклянными шариками. Для грызунов понадобится рукоятка скальпеля, кровоостанавливающие щипцы, пинцет Дюмона, изогнутые щипцы, набор для закрытия раны (клипсы) или ножницы и щипцы (для швов) и дрель-головка.
3. Продезинфицируйте операционную область и стереотаксический инструмент 70% этанолом и накройте область рядом со стереотаксическим инструментом либо чистыми бумажными полотенцами, либо стерильной абсорбирующей простыней.
4. Положите на полотенца: глазные капли (например, Liquigel), триммер для волос, ватные палочки, разведенный йодиксанол, одноразовое хирургическое лезвие, хирургическую дрель с продезинфицированным сверлом, маркер или машинку для стрижки ушей, стерильную H₂O в пробирке объемом 1,5 мл, пробирку объемом 1,5 мл с 3 % H₂O₂ в стерильной H₂O (1,35 мл H₂O + 0,15 мл 30 % H₂O_2, свежеприготовленный), шприц объемом 1 мл с иглой 33G и стерильным PBS или физиологическим раствором, шприц с анальгетиком и антидотом, если используется инъекционная анестезия (например, атипамезол + бупренорфин/кетопрофен; свежеприготовленный и одобренный в этическом разрешении) и автоклавные хирургические инструменты.
5. Залейте изофлуран и проверьте давление O₂ и N₂ , если используете газовую анестезию. Добавьте бумажное полотенце на дно ингаляционной камеры, чтобы она оставалась сухой и чистой.
   Смешайте и приготовьте анестетик (например, фентанил + медетомидин (для крыс) или раствор кетамин + ксилазин (для мышей)) при использовании инъекционной анестезии и если это одобрено в этическом разрешении.
6. Соберите стеклянный шприц Hamilton и стеклянный капилляр (Рисунок 1A 1.).
   1. Положите вытянутый стеклянный капилляр на стол. Поместите указательный палец там, где капилляр истончается, с окончанием ногтя там, где должен быть разрезан капилляр.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от глубины инъекции от 0,5 до 2 см.
   2. Используйте край керамической плитки, чтобы несколько раз осторожно поцарапать игольчатую часть. Возьмите стеклянный капилляр в одну руку и большим и указательным пальцами возьмитесь за тонкую часть иглы. Тяните от середины до конца, пока игла не обломится тупо.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если это не работает или игла отламывается с краями, повторите несколько раз. Если она все еще не отламывается, повторите процарапывание плитки. Следите за тем, чтобы игольная часть не была слишком тонкой (>50 мкм в диаметре) и не поддавалась легкому сгибанию.
7. Запечатайте стеклянный капилляр на шприце Гамильтона.
   1. Прикрепите термоусадочную трубку диаметром 1 см к тупой металлической игле, прикрепленной к стеклянному шприцу Hamilton. Затем наденьте толстый конец стеклянного капилляра на металлическую иглу Гамильтона.
   2. Поместите термоусадочную трубку на половину стеклянного капилляра, обеспечив расстояние не менее 1 см между концом металлической иглы Гамильтона и коническим переходом капилляра. Это будет пространство, в котором позже будет содержаться желаемый раствор для инъекций.
   3. Используйте зажигалку или спичку, чтобы нагреть термоусадочную трубку и запечатать иглу для инъекций.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Существует несколько различных вариантов держателей, которые позволяют закрепить шприц Hamilton на стереотаксическом кронштейне слева. Убедитесь, что вы все еще можете прочитать цифры на шприце Hamilton. Если вы используете насос для введения раствора, прикрепите насос к стереотаксическому кронштейну и закрепите шприц Гамильтона на насосе.
8. Снимите металлический поршень. Вставьте иглу 27G, прикрепленную к шприцу объемом 1 мл, наполненному физиологическим раствором или PBS, в верхнюю часть шприца Hamilton. Промойте шприц Hamilton с помощью PBS, чтобы проверить, запечатан ли он, и удалить все пузырьки воздуха.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пузырьки воздуха будут препятствовать всасыванию и впрыску раствора, поскольку воздух сжимает больше, чем жидкость.
9. Когда все будет проверено и готово, откройте маленький винтик на рычаге оси Z (Рисунок 1A 2.) стереотаксического инструмента и поверните рычаг с шагом 90° по часовой стрелке, чтобы отодвинуть стеклянный шприц/капилляр в сторону (чтобы избежать разрыва капилляра при фиксации животного к стереотаксическому инструменту).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что все углы и настройки стереотаксиса установлены на желаемые параметры (обычно 0°), зубная дуга и ушные вкладыши установлены на нужные координаты, а шприц/капилляр Hamilton находятся в правильном положении.
10. Включите грелку на платформе стереотакс, используя сверху дополнительную набивку, если она слишком теплая. Поставьте пустую чистую клетку с дополнительной грелкой рядом с областью операции.

2. Хирургическое вмешательство (продолжительность в среднем 1 час на животное)

1. Для газовой анестезии
   1. Включите изофлуран до 5% с потоком воздуха N₂ + O₂ (около 1 л/мин) и откройте клапан в камеру ингаляции. Поместите животное в камеру и убедитесь, что она хорошо закрыта. Наблюдайте за дыханием до тех пор, пока оно значительно не замедлится (глубокое дыхание).
   2. Как только животное потеряет сознание, откройте клапан стереотаксического инструмента и закройте клапан камеры. Установите изофлуран на 2%.
   3. Откройте камеру и выньте животное, держа его за шею, откройте его рот с помощью щипцов и положите животное на зубной брусок (Рисунок 1А 6.) так, чтобы передние верхние зубы вошли в отверстие.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг чувствителен ко времени, так как животное может проснуться, не вдыхая изофлуран.
   4. Поместите носовой конус на морду и наблюдайте за дыханием, чтобы обеспечить устойчивый ритм без форсированного дыхания. Убедитесь, что животное глубоко обезболито, проверив отсутствие рефлексов отвода педалей задних конечностей перед тем, как приступить к работе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжайте проверять на протяжении всей процедуры, чтобы животное не перестало дышать и не проснулось. При необходимости корректируйте % изофлурана с небольшим приращением. Чтобы проверить рефлекс отвода педали задних конечностей, используйте пинцет и ущипните заднюю лапу. Если животное втягивает конечность (рефлекс для снятия болевых раздражителей) анестезия оказывается слишком низкой.
   5. Зафиксируйте голову животного на месте с помощью двух ушных вкладышей (Рисунок 1А 7.). При правильном подходе уши должны быть направлены в сторону над ушными планками. Если голова все еще движется, отрегулируйте ушные планки или носовой конус, чтобы закрепить голову на месте покрепче.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не сломать барабанные перепонки животных, вставив их слишком глубоко. Крысы, как правило, моргают, когда наушники вставлены правильно.
2. Для инъекционной анестезии:
   1. Введите животному подходящую/рекомендуемую дозу анестезии в/(300 мкг/кг фентанила и 300 мкг/кг медетомидина для крыс; 100 мг/кг кетамина и 10 мг/кг ксилазина для мышей) и поместите его обратно в домашнюю клетку.
   2. Проверьте рефлексы отвода педалей у животных через 5 минут после инъекции. Если отсутствует, зафиксируйте голову животного на месте с помощью двух амбушюр (рис. 1А, 7). При правильном подходе уши должны быть направлены в сторону над ушными планками. После этого поместите животное на зубной стержень (Рисунок 1А 6.) и закрутите рычаг. Если голова все еще движется, отрегулируйте ушные вкладыши или конус рычага, чтобы крепче зафиксировать голову на месте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Можно сломать барабанную перепонку животного, если ушные вкладыши вставлены слишком глубоко. Не закручивайте рычаг слишком сильно. Это может сломать животному нос.
   3. Если наблюдаются рефлексы отвода педали, подождите еще 5-10 минут. Если вы все еще наблюдаете, введите еще 10% от предыдущего анестетика.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Увеличивайте дозу анестетика медленно с периодом ожидания между ними, чтобы избежать смерти животного от удушья.
   4. Убедитесь, что череп плоский, отрегулировав высоту зубного бруса и/или ушного планки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны при регулировке стержней, так как угол наклона головы изменится, а носовой конус/рычаг может сломать нос животного.
3. Нанесите глазные капли на каждый глаз (например, Liquigel), чтобы избежать их высыхания во время операции. Побрейте голову животного от глаз до ушей.
4. Продезинфицируйте операционную область с помощью 10% йодоповидона. Кроме того, введите местный анестетик (например, 0,5% лидокаин) внутрикожно в место разреза. Рекомендуется подождать 2-3 минуты, прежде чем продолжить.
5. С помощью скальпеля сделайте один непрерывный разрез от межглазных промежутков до межушных.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны и не режьте слишком далеко назад, так как порез мышц шеи усложнит восстановление.
6. Ватными наконечниками вскройте рану и очистите область от крови. Для крыс используйте гемостатические щипцы, чтобы держать рану открытой, зажимая их в подкожной клетчатке и позволяя им свисать с каждой стороны. Для мышей, при необходимости, используйте микроклипсы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это самая болезненная часть процедуры. Пережатие подкожной клетчатки вместо кожи ускорит заживление.
7. Переместите шприц/капилляр (Рисунок 1А 1) на 180° против часовой стрелки по оси Z (Рисунок 1А 2) и поднесите его над головой животного. Обязательно полностью закройте ручку, чтобы рычаг оси Z не колебался во время операции.
8. С помощью микроскопа и ручек на каждой стереотаксической руке (рис. 1А 3.-5.) переместите тупой конец стеклянного капилляра (прикрепленного к стеклянному шприцу Гамильтона; Рисунок 1А 1.) прямо поверх брегмы (касаясь, но не надавливая на кость). Установите все значения на цифровом дисплее в ноль (Рисунок 1А 8.).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Брегма (рис. 1B) – это точка, где встречаются сагиттальный и корональный швы теменной и лобной костей. Это и будет точкой отсчета.
9. Глядя в микроскоп, переместите тупой конец капилляра прямо поверх лямбды. Если значение оси z (дорсальная/вентральная = DV) находится в пределах +/-0,1 мм, голова животного выравнивается. Если он выше или ниже, используйте зубчатый стержень, чтобы отрегулировать головку соответствующим образом с точностью до +/-0,1 мм.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Лямбда (рис. 1B) определяется как точка, где встречаются сагиттальный и корональный швы теменной и затылочной костей. Этот метод также может быть использован для выравнивания левой и правой стороны черепа, если ушные планки можно регулировать индивидуально. Будьте осторожны при регулировке рулей, так как угол наклона головы изменится, а носовой обтекатель / рычаг может сломать нос животного.
10. Используйте атлас мозга Аллена (рис. 1C, D) для определения координат желаемой целевой области. Используйте оси y (передний/задний = AP) и оси x (медиальный/латеральный = ML) рычаги, чтобы переместить шприц/капилляр в правильное положение.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Инъекции красителя (Рисунок 2A-E) должны быть выполнены перед хирургическими процедурами на отдельных животных, чтобы убедиться, что координаты правильны для штамма/возраста используемых животных.
11. Посмотрите в микроскоп и приготовьтесь тщательно просверлить отверстие там, где тупой конец капилляра встречается с костью. Прежде чем начать, переместите капилляр вверх по оси Y, чтобы он не был поврежден во время сверления. Начинайте бурение по большему кругу и становитесь меньше по мере углубления. Во время сверления положите руку на ушную планку, чтобы она оставалась устойчивой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не сверлите полностью до тканей мозга. Оставьте тонкий слой кости, чтобы избежать повреждения твердой мозговой оболочки. Вместо этого с помощью пинцета осторожно удалите оставшийся тонкий слой кости.
12. С помощью микроскопа убедитесь, что тупой конец иглы может касаться твердой мозговой оболочки / мозговой ткани, не отвлекаясь на кусочки кости.
13. Очистите шприц/капилляр во избежание загрязнения раствора для инъекций.
    1. Переместите шприц/капилляр до упора вверх и опустите его в пробирку объемом 1,5 мл, содержащую 3% H₂O₂. Обязательно удалите весь мусор и кровь со стекла. Затем опустите капилляр в пробирку объемом 1,5 мл, содержащую H₂O, чтобы смыть H₂O₂.
    2. Извлеките металлический поршень из шприца Гамильтона и поместите марлю под шприц/капилляр на макушку головы животного. Используйте шприц объемом 1 мл, наполненный PBS, чтобы промыть шприц Hamilton, вставив иглу в верхнюю часть и выдавив PBS. После этого вставьте металлический поршень в шприц Гамильтона.
14. Наберите 1 мкл воздуха. Это предотвратит смешивание PBS в шприце Hamilton и раствора для инъекций в капилляре. Затем наберите нужное количество раствора для инъекций. Для мышей и крыс рекомендуется не более 1 мкл и 2 мкл на один слой соответственно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В общей сложности не следует превышать 3 мкл / 6 мкл на полушарие, так как давление в мозге будет слишком сильно повышаться. С помощью ручки можно очень аккуратно сделать небольшую отметку, где находится мениск раствора. Эта метка затем может быть использована в качестве точки отсчета для оценки того, попадает ли раствор в мозг.
15. Для крыс используйте иглу 25G для прокола твердой мозговой оболочки. Вставьте капилляр в мозг в нужную координату DV. Переместите шприц/капилляр на 0,1 мм глубже, чем предполагалось, и втяните его обратно, чтобы освободить место для раствора.
16. Вводите раствор вручную (0,1 мкл в 10-15 сек) или с помощью насоса (0,4-0,6 мкл/мин). Проверьте мениск, чтобы убедиться, что раствор полностью введен внутрь.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если раствор не проникает в мозг, переместите шприц/капилляр вверх и вниз на 0,2 мм. Если он все еще не внедряется, повторите шаги 2.13-2.14. Скорее всего игла забита остатками мозговой ткани.
17. Удерживайте шприц/капилляр на месте еще 5 минут, чтобы введенный раствор распределился и давление снизилось. В течение этого периода ожидания введите обезболивающее средство и при необходимости пометьте животное.
18. Переместите шприц/капилляр вверх на 0,2 мм и удерживайте на месте еще 2 минуты. Вытаскивайте шприц/иглу очень медленно, чтобы избежать вытягивания введенного раствора из-за отрицательного давления.
19. После того, как шприц/капилляр будет выведен из головного мозга, очистите его, как описано в шаге 2.13 , чтобы предотвратить высыхание ткани и закупорку капилляра.
20. Продолжайте вводить дополнительные участки мозга или завершите операцию.
21. Отодвиньте иглу шприца в сторону, повернув ее на 180° по оси z, чтобы избежать поломки при закрытии раны. Затем закройте рану либо зажимами, тканевым клеем, либо швами. Если применялась инъекционная анестезия, введите животному антидот.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Животные, которых не содержат поодиночке, как правило, чистят головы друг друга и, возможно, удаляют зажимы, клей или швы.
22. Извлеките животное из стереотаксической рамки и поместите его в чистую клетку поверх грелки. Следите за тем, чтобы животное проснулось без осложнений. Обеспечьте легкий доступ к еде и воде в течение первых 24 часов.

3. Послеоперационный уход (продолжительность 3-7 дней)

1. Проверьте вес (допустима потеря 10% веса), шерсть, фекалии и потребление пищи/воды животным в течение следующих 2-3 дней (до 10 дней для введения токсиканта), чтобы обеспечить надлежащее восстановление. При необходимости изолируйте животное и дайте ему влажный корм, физраствор и грелку, что необходимо для некоторых инъекций токсикантов, поскольку у животных могут быть дополнительные системные проблемы.
2. Вводите животным анальгетик в течение еще 1-2 дней после операции, чтобы обеспечить облегчение боли в соответствии с местными правилами. Если швы, клипсы или клей не сходят сами по себе, используйте изофлуран для обезболивания животного и удалите швы, клипсы или клей через 1 неделю после операции.

Результаты

Чтобы избежать неправильного нацеливания, перед каждым экспериментом проверяйте координаты с помощью инъекций красителя. Животным вводили 0,2-0,5 мкл триптофана синего по тому же протоколу, капилляры быстро удалялись после инъекции, а мозг быстро замораживался, чтобы ?...

Обсуждение

Стереотаксическая инъекция, как и любая хирургическая процедура, имеет основную сложность – гарантировать благополучие и выживание животного. Поэтому очень важно внимательно следить за животным на протяжении всей процедуры. Основное внимание должно уделяться нере...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Allen brain atlas	Allen Institute	mouse brain - reference atlas
analgesic: ketoprofin OR buprenorphine
anesthetic: Isoflurane OR ketamine / xylazine OR fentanyl / medetomidine
blades - surgical sterile	Oasis Medical	No 10
capillaries - glass	Stoelting	50811
capillary puller	Sutter Instruments	P-97
cotton-tipped applicators	Stoelting	50975
drill - dental	Foredom	MH-170
Ethanol 70%
eye drops (Liquigel)	CVS	NDC 0023-9205-02	Carboxymethylcellulose Sodium (1%), Boric acid; calcium chloride; magnesium chloride; potassium chloride; purified water; PURITE® (stabilized oxychloro complex); sodium borate; and sodium chloride
forceps - full curved	Stoelting	52102-38P
forceps - hemostatic delicate	Stoelting	52110-13
gauze - cotton absorbent
H2O - sterile
H2O2 30%	Sigma Aldrich	216763
Hamilton 5ul syringe	Hamilton Company	7634-01
Hamilton blunt metal needle	Hamilton Company	7770-01
heat pad - far infrared	Kent Scientific	2665967
Iodine solution (Dynarex) 10%	Indemedical	102538
isoflurane	Baxter	1001936040
lidocaine 0.5%
lighter / matches
microscope (Stemi 508 Boom stand)	Zeiss	435064-9000-000
PBS sterile	Gibco - Thermo Fischer	10010-023
pump (injector)	Stoelting	53311
scalpel handle	Stoelting	52171P
shaver - electrical	andis	64800
solution to inject / material to implant
stereotax - small animal digital	Kopf	Model 940
sterilizer - glass bead	BT Lab Systems	BT1703
tubing - heat-shrink	Nelco	NP221-3/64
tweezers - dumont fine curved	Roboz	RS-5045A
underpad - absorbent
vaporizer for isoflurane (package)	Scivena Scientific	M3000
wound clips and applier / remover	Stoelting	59040
wound glue (Vetbond)	3M corporation	1469SB