Administración intracraneal estereotáxica de sustancias químicas, proteínas o vectores virales para estudiar la enfermedad de Parkinson

Resumen

Describimos cómo inyectar soluciones con éxito en áreas específicas del cerebro de roedores utilizando un marco estereotáxico. Esta cirugía de supervivencia es un método bien establecido que se utiliza para imitar varios aspectos de la enfermedad de Parkinson.

Resumen

La enfermedad de Parkinson (EP) es un trastorno progresivo tradicionalmente definido por temblor en reposo y acinesia, principalmente debido a la pérdida de neuronas dopaminérgicas en la sustancia negra. Las áreas cerebrales afectadas muestran inclusiones fibrilares intraneuronales que consisten principalmente en proteínas alfa-sinucleína (asin). Hasta el momento, ningún modelo animal ha recapitulado todas las características de esta enfermedad. Aquí, describimos el uso de la inyección estereotáxica para administrar sustancias químicas, proteínas o vectores virales por vía intracraneal con el fin de imitar varios aspectos de la EP. Estos métodos están bien establecidos y se utilizan ampliamente en todo el campo de la DP. Las inyecciones estereotáxicas son increíblemente flexibles; Pueden ajustarse en la concentración, la edad del animal utilizado para la inyección, el área del cerebro objetivo y en las especies animales utilizadas. Las combinaciones de sustancias permiten variaciones rápidas para evaluar los tratamientos o alterar la gravedad de la patología o los déficits conductuales. Al inyectar toxinas en el cerebro, podemos imitar la inflamación y/o una pérdida severa de neuronas dopaminérgicas, lo que resulta en fenotipos motores sustanciales. Los vectores virales se pueden utilizar para transducir células para imitar aspectos genéticos o mecanicistas. Las inyecciones de asyn fibrilar preformado recapitulan mejor el fenotipo progresivo durante un período prolongado de tiempo. Una vez establecidos estos métodos, puede ser económico generar un nuevo modelo en comparación con la creación de una nueva línea transgénica. Sin embargo, este método requiere mucha mano de obra, ya que requiere de 30 minutos a cuatro horas por animal, dependiendo del modelo utilizado. Cada animal tendrá un objetivo ligeramente diferente y, por lo tanto, creará una cohorte diversa que, por un lado, puede ser difícil interpretar los resultados; Por otro lado, ayudar a imitar una diversidad más realista que se encuentra en los pacientes. Los animales mal seleccionados pueden identificarse utilizando lecturas de comportamiento o de imágenes, o solo después de haber sido sacrificados, lo que lleva a un tamaño de cohorte más pequeño después de que el estudio ya ha concluido. En general, este método es una forma rudimentaria pero eficaz de evaluar un conjunto diverso de aspectos de la EP.

Introducción

La enfermedad de Parkinson (EP) es una enfermedad neurodegenerativa progresiva relativamente frecuente que afecta hasta el 1 % de las personas mayores de 60 años¹. La EP es heterogénea, pero clínicamente se caracteriza principalmente por síntomas motores que incluyen temblor en reposo, bradicinesia, acinesia, rigidez, alteración de la marcha e inestabilidad postural. La mayoría de los síntomas motores suelen aparecer cuando el 60-70% de la dopamina estriada (DA) se pierde como resultado de una neurodegeneración progresiva y distinta en la sustancia negra (SN) pars compacta ^2,3. Las neuronas dopaminérgicas supervivientes contienen inclusiones intracelulares conocidas como cuerpos de Lewy⁴. Estos agregados consisten principalmente en alfa-sinucleína (asin), una proteína pequeña pero altamente expresada en las neuronas del cerebro⁵.

El mecanismo subyacente de la neurodegeneración en la EP aún se desconoce. El envejecimiento sigue siendo el mayor factor de riesgo para este trastorno⁶. Además, los humanos son la única especie que desarrolla la EP de forma natural. Por lo tanto, con el fin de investigar la patología de la EP y probar nuevos fármacos para prevenir la progresión de la enfermedad, se ha desarrollado una amplia gama de modelos animales⁷. Idealmente, los modelos animales de EP deberían mostrar una pérdida progresiva de neuronas DA en el SN dependiente de la edad, acompañada de inclusiones intracelulares seguidas de disfunción motora y responder a las terapias de reemplazo de DA. Ninguno de los modelos animales disponibles actualmente recapitula completamente todos los síntomas clínicos y la patología de la EP. Dado que cada modelo presenta diferentes aspectos de la enfermedad, es importante considerar cuidadosamente el modelo apropiado para usar en un experimento basado en las preguntas formuladas.

Históricamente, los modelos animales se basaban en tóxicos, como la 6-hidroxidopamina (6-OHDA) y la 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP), y pesticidas, como la rotenona y el paraquat⁸. Cada tóxico tiene un mecanismo de acción diferente y va desde la neurona DA específica hasta la generalmente dañina para las células cerebrales. Las toxinas pueden administrarse por vía oral, inyectarse por vía intraperitoneal o directamente en el cerebro mediante inyecciones estereotáxicas, dependiendo de la permeabilidad de la barrera hematoencefálica. A diferencia de otros modelos, los modelos de toxinas garantizan un alto grado de pérdida de células dopaminérgicas nigroestriadas y fenotipos conductuales. Algunos modelos pueden incluso presentar patología sutil. Estas características hacen que los modelos de EP con toxinas sean una gran herramienta para estudiar las terapias de reemplazo y los efectos de las toxinas ambientales en la aparición de la EP ^9,10.

Además, se han generado numerosos modelos de ratones transgénicos utilizando una variedad de promotores y genes relacionados con la EP¹¹. La mayoría de los ratones presentan patología nigroestriada, pero sin evidencia clara de neurodegeneración. Los modelos transgénicos tienen la ventaja de ser consistentes entre animales y cohortes y, una vez generados, son fáciles de mantener y distribuir. Si bien no dan lugar a neurodegeneración, son modelos útiles para investigar los cambios celulares causados por variantes genéticas y posibles candidatos a fármacos en un complejo sistema in vivo¹².

A diferencia de los modelos transgénicos, la expresión de genes relacionados con la EP mediada por vectores virales ofrece un enfoque más flexible¹³. Las inyecciones estereotáxicas permiten elegir varias áreas cerebrales, tipos de células y niveles de expresión para una amplia gama de especies animales como ratones, ratas, cerdos y primates no humanos. Inicialmente, se utilizaron vectores virales recombinantes que codifican para asyn para transducir neuronas ubicadas en el SN de rata. La acumulación de proteínas y la disfunción celular preceden a la pérdida progresiva de células dopaminérgicas, lo que resulta en un déficit conductual. Las diferencias en la focalización pueden conducir a una gran variación de la pérdida de células entre los animales (30-80%), lo que es responsable de los déficits de comportamiento variables observados en solo aproximadamente el 25% de las ratas inyectadas¹⁴.

Un modelo recientemente establecido es la inyección intracraneal de fibrillas de asin preformadas (PFF) o extractos agregados de tejido cerebral de ratón o paciente^15,16. Múltiples estudios indican que la inyección de PFFs o extractos da lugar a una patología asyn generalizada en el cerebro animal, así como a una pérdida de neuronas dopaminérgicas en el SN. La acumulación de asyn aparece dentro de las neuronas que inervan el área inyectada. A diferencia de los modelos basados en vectores virales, el modelo PFF se desarrolla lentamente a lo largo de varios meses, seguido de déficits motores a los 6 meses. Este modelo tiene un gran potencial para estudiar el mecanismo o la prevención de la patología asincrónica^17,18.

Todos los modelos mencionados anteriormente han sido bien establecidos y utilizados en numerosas ocasiones para estudiar diversos aspectos del trastorno humano. Las inyecciones estereotáxicas de sustancias directamente en el cerebro han desempeñado un papel importante en el desarrollo de estos modelos animales, no solo en el campo de la EP, sino también en otros trastornos neurológicos. Si bien es laboriosa, la cirugía estereotáxica tiene las ventajas de ser muy flexible en cuanto a la edad de los animales utilizados, la región del cerebro dirigida y la sustancia inyectada, y se puede ajustar según la pregunta de investigación realizada. Por ejemplo, las sustancias pueden inyectarse solas o en combinación (vector + fibrillas o tóxico + vector) para recapitular más aspectos de la enfermedad o evaluar tratamientos^19,20. Además, las sustancias se pueden inyectar unilateralmente dejando el lado no inyectado como un control interno para evaluar el comportamiento, así como la neurodegeneración. Por lo tanto, este manuscrito describirá los pasos detallados para generar modelos de DP utilizando inyecciones estereotáxicas.

Protocolo

Todos los experimentos de este estudio se llevaron a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud y aprobados por los Comités de Cuidado y Uso de Animales del Instituto Nacional sobre el Envejecimiento de los Estados Unidos.

Antes de comenzar, asegúrese de haber adquirido la capacitación adecuada y la aprobación ética de su instituto necesaria para realizar este procedimiento. Además, los anestésicos (p. ej., ketamina y buprenorfina, o fentanilo y medetomidina) utilizados deben adquirirse y manejarse de acuerdo con las normas pertinentes de su institución.

1. Preparación (duración 1 hora)

1. Lleve a los animales a la sala de cirugía y deje que se aclimaten mientras preparan el área quirúrgica. Póngase el equipo de protección personal (EPP) adecuado.
   NOTA: Esto puede depender de las normas de seguridad locales y de la sustancia inyectada. Los vectores virales necesitan principalmente EPI de nivel 2 de bioseguridad. Por lo general, al menos use una mascarilla, guantes y bata de laboratorio desechable. En circunstancias específicas, se deben usar guantes y gafas adicionales.
2. Esterilice las herramientas quirúrgicas utilizando un autoclave o un esterilizador de perlas de vidrio. Para los roedores se necesita mango de bisturí, pinzas hemostáticas, pinzas Dumont, pinzas curvas, kit de cierre de heridas (clips) o tijeras y pinzas (para suturas) y un cabezal de perforación.
3. Desinfecte el área quirúrgica y el instrumento estereotáxico con etanol al 70%, y cubra el área junto al instrumento estereotáxico con toallas de papel limpias o una hoja absorbente estéril.
4. Coloque lo siguiente en toallas: gotas para los ojos (por ejemplo, Liquigel), recortador de cabello, hisopos de algodón, yodixanol diluido, cuchilla quirúrgica desechable, taladro quirúrgico con broca desinfectada, marcador o cortaorejas, H₂O estéril en un tubo de 1,5 mL, tubo de 1,5 mL con 3 % de H₂O₂ en H₂O estéril (1,35 mL de H₂O + 0,15 mL de 30 % H_{2O 2,} recién preparada), una jeringa de 1 mL con aguja 33G y PBS estéril o solución salina, jeringa con analgésico y antídoto si se utiliza anestesia inyectable (por ejemplo, atipamezol + buprenorfina/ketoprofeno; recién preparada y aprobada en el permiso ético) e instrumentos quirúrgicos esterilizados en autoclave.
5. Llene el isoflurano y controle las presiones de_O2 y_N2 , si utiliza anestesia gaseosa. Agregue una toalla de papel al fondo de la cámara de inhalación para mantenerla seca y limpia.
   Mezcle y prepare el anestésico (por ejemplo, fentanilo + medetomidina (para ratas) o ketamina + solución de xilacina (para ratones)) si usa anestesia inyectable y si está aprobado en el permiso ético.
6. Ensamble la jeringa de vidrio Hamilton y el capilar de vidrio (Figura 1A 1).
   1. Coloque el capilar de vidrio extraído sobre la mesa. Coloque el dedo índice donde el capilar se vuelve más delgado con el extremo de la uña donde se debe cortar el capilar.
      NOTA: Dependiendo de la profundidad de su inyección, entre 0,5 y 2 cm.
   2. Use el borde de una baldosa de cerámica para rascar cuidadosamente la parte de la aguja unas cuantas veces. Tome un capilar de vidrio en una mano y use el pulgar y el índice para agarrar la parte delgada de la aguja. Tire de la mitad hasta el extremo hasta que la aguja se rompa sin rojizo.
      NOTA: Si no funciona o la aguja se rompe con el borde, repita varias veces. Si aún no se rompe, repita el rasguño de las baldosas. Asegúrese de que la parte de la aguja no sea demasiado delgada (>50 μm de diámetro) y no se doble fácilmente.
7. Selle el capilar de vidrio a la jeringa Hamilton.
   1. Coloque un tubo retráctil de 1 cm sobre la aguja de metal romo unida a la jeringa de vidrio Hamilton. A continuación, coloque el extremo grueso del capilar de vidrio sobre la aguja metálica Hamilton.
   2. Coloque el tubo retráctil sobre la mitad del capilar de vidrio, asegurando al menos 1 cm de espacio entre el extremo de la aguja metálica Hamilton y la transición cónica del capilar. Este será el espacio que contendrá la solución inyectable deseada más adelante.
   3. Use un encendedor o un fósforo para calentar el tubo retráctil y sellar la aguja de inyección.
      NOTA: Hay varias opciones de soporte diferentes que le permiten fijar la jeringa Hamilton al brazo estereotáxico de la izquierda. Asegúrese de que aún puede leer los números de la jeringa Hamilton. Si usa una bomba para inyectar la solución, conecte la bomba al brazo estereotáxico y fije la jeringa Hamilton en la bomba.
8. Retire el émbolo de metal. Inserte una aguja de 27G conectada a una jeringa de 1 ml llena de solución salina o PBS en la parte superior de la jeringa Hamilton. Enjuague la jeringa Hamilton con PBS para verificar si está sellada y para eliminar todas las burbujas de aire.
   NOTA: Las burbujas de aire perturbarán la absorción e inyección de la solución, ya que el aire se comprime más que el líquido.
9. Una vez que todo esté verificado y listo, abra el pequeño tornillo en el brazo del eje z (Figura 1A 2.) del instrumento estereotáxico y gire el brazo en incrementos de 90° en el sentido de las agujas del reloj para mover la jeringa/capilar de vidrio fuera del camino (para evitar que el capilar se rompa mientras se fija el animal al instrumento estereotáxico).
   NOTA: Compruebe que todos los ángulos y ajustes de la estereotaxis estén ajustados a los parámetros deseados (normalmente 0°), que la barra de dientes y las barras de los oídos estén ajustadas a las coordenadas deseadas y que la jeringa/capilar Hamilton esté recta.
10. Encienda la almohadilla térmica en la plataforma estereotax, usando un acolchado adicional en la parte superior si está demasiado caliente. Coloque una jaula vacía y limpia con una almohadilla térmica adicional junto al área quirúrgica.

2. Cirugía (duración media 1 hora por animal)

1. Para anestesia con gases
   1. Encienda el isoflurano al 5% con un flujo de aire N₂ + O₂ (aproximadamente 1 L/min) y abra la válvula de la cámara de inhalación. Coloque el animal en la cámara y asegúrese de que esté bien sellada. Observe la respiración hasta que se haya ralentizado considerablemente (respiración profunda).
   2. Una vez que el animal esté inconsciente, abra la válvula del instrumento estereotáxico y cierre la válvula de la cámara. Ajuste el isoflurano al 2%.
   3. Abra la cámara y saque al animal sujetándolo por el cuello, abra su boca con las pinzas y coloque al animal en la barra de dientes (Figura 1A 6.) con los dientes superiores frontales encajando en el orificio.
      NOTA: Este paso es sensible al tiempo, ya que el animal puede despertar de nuevo al no inhalar isoflurano.
   4. Coloque el cono de la nariz sobre el hocico y observe la respiración para asegurar un ritmo constante sin respiración forzada. Asegúrese de que el animal esté profundamente anestesiado comprobando la ausencia de los reflejos de retirada del pedal de las extremidades traseras antes de continuar.
      NOTA: Siga revisando durante todo el procedimiento para que el animal no deje de respirar ni se despierte. Si es necesario, ajuste el porcentaje de isoflurano en pequeños incrementos. Para probar el reflejo de retirada del pedal de las extremidades traseras, utilice un par de pinzas y pellizque la pata trasera. Si el animal retrae la extremidad (reflejo para eliminar los estímulos dolorosos) la anestesia es demasiado baja.
   5. Fije la cabeza del animal en su lugar usando las dos orejeras (Figura 1A 7). Cuando se hace correctamente, las orejas deben apuntar hacia los lados sobre las barras de las orejas. Si la cabeza aún se mueve, ajuste las barras de la oreja o el cono de la nariz para fijar la cabeza más firmemente en su lugar.
      NOTA: Sea amable para evitar romper los tímpanos de los animales insertando las orejeras demasiado profundas. Las ratas tienden a parpadear cuando la barra auricular se inserta correctamente.
2. Para la anestesia inyectable:
   1. Inyecte al animal una dosis adecuada/recomendada de anestesia i.p. (300 μg/kg de fentanilo y 300 μg/kg de medetomidina para ratas; 100 mg/kg de ketamina y 10 mg/kg de xilacina para ratones) y colóquelo de nuevo en la jaula doméstica.
   2. Compruebe los reflejos de retirada del pedal de los animales 5 minutos después de la inyección. Si está ausente, fije la cabeza del animal en su lugar usando las dos orejeras (Figura 1A 7.). Cuando se hace correctamente, las orejas deben apuntar hacia los lados sobre las barras de las orejas. A continuación, coloque el animal en la barra de dientes (Figura 1A 6.) y atornille la palanca. Si la cabeza todavía se mueve, ajuste las barras de los oídos o el cono de la palanca para fijar la cabeza más firmemente en su lugar.
      NOTA: Es posible romper el seardrum de un animal cuando las orejeras se insertan demasiado profundas. No atornille la palanca demasiado fuerte. Puede romper la nariz de los animales.
   3. Si se observan los reflejos de retirada del pedal, espere otros 5-10 minutos. Si aún se observa, inyecte otro 10% del anestésico anterior.
      NOTA: Aumente la dosis de anestésico lentamente con un período de espera entre medias para evitar la muerte del animal por asfixia.
   4. Asegúrese de que el cráneo esté plano ajustando la altura de la barra de dientes y/o la barra de la oreja.
      NOTA: Tenga cuidado al ajustar las barras, ya que la cabeza cambiará de ángulo y el cono/palanca de la nariz puede romper la nariz de los animales.
3. Aplique gotas para los ojos en cada ojo (por ejemplo, Liquigel) para evitar que se sequen durante la cirugía. Afeita la cabeza del animal desde los ojos hasta las orejas.
4. Desinfectar el área quirúrgica con yodopovidona al 10%. Además, inyecte un anestésico local (por ejemplo, lidocaína al 0,5%) por vía intradérmica en el sitio de la incisión. Se recomienda esperar 2-3 min para que actúe antes de continuar.
5. Con el bisturí, haga una incisión continua desde entre los ojos hasta entre las orejas.
   NOTA: Tenga cuidado de no cortar demasiado hacia atrás, ya que cortar los músculos del cuello complicará la recuperación.
6. Use las puntas de algodón para abrir la herida y limpiar el área de sangre. En el caso de las ratas, utilice las pinzas hemostáticas para mantener la herida abierta, sujetándolas en el tejido subcutáneo y dejándolas colgar a cada lado. Para ratones, si es necesario, use micro clips.
   NOTA: Esta es la parte más dolorosa del procedimiento. Pinzar el tejido subcutáneo en lugar de la piel aumentará la cicatrización.
7. Mueva la jeringa/capilar (Figura 1A, 1) 180° en sentido contrario a las agujas del reloj en el eje z (Figura 1A, 2.) y colóquela sobre la cabeza del animal. Asegúrese de cerrar la perilla completamente para que el brazo del eje z no se tambalee durante la cirugía.
8. Utilice el microscopio y las perillas de cada brazo estereotáxico (Figura 1A 3.-5.) para mover el extremo romo del capilar de vidrio (conectado a la jeringa de vidrio Hamilton; Figura 1A 1.) justo encima del bregma (tocando pero sin presionar el hueso). Ajuste todos los valores de la pantalla digital a cero (Figura 1A 8).
   NOTA: El bregma (Figura 1B) es el punto donde se unen las suturas sagital y coronal de los huesos parietal y frontal. Este será el punto de origen.
9. Mirando a través del microscopio, mueva el extremo romo del capilar justo encima de la lambda. Si el valor del eje z (dorsal/ventral = DV) está dentro de +/-0,1 mm, la cabeza del animal se nivela. Si es más alto o más bajo, use la barra de dientes para ajustar la cabeza en consecuencia hasta que esté dentro de +/- 0,1 mm.
   NOTA: Lambda (Figura 1B) se define como el punto donde se unen las suturas sagital y coronal de los huesos parietal y occipital. Este método también podría usarse para nivelar el lado izquierdo y derecho del cráneo si las barras de las orejas se pueden ajustar individualmente. Tenga cuidado al ajustar las barras, ya que la cabeza cambiará de ángulo y el cono / palanca de la nariz puede romper la nariz de los animales.
10. Utilice el atlas cerebral de Allen (Figura 1C, D) para identificar las coordenadas de la región objetivo deseada. Utilice los brazos del eje y (anterior/posterior = AP) y del eje x (medial/lateral = ML) para mover la jeringa/capilar a la posición correcta.
    NOTA: Las inyecciones de tinte (Figura 2A-E) deben realizarse antes de los procedimientos quirúrgicos en animales separados para asegurarse de que las coordenadas sean correctas para la cepa/edad de los animales utilizados.
11. Mire a través del microscopio y prepárese para perforar cuidadosamente un orificio donde el extremo romo del capilar se encuentra con el hueso. Antes de comenzar, mueva el capilar lo suficiente hacia arriba en el eje Y para que no se dañe mientras perfora. Comience a perforar en un círculo más grande y hágase más pequeño a medida que perfore más profundamente. Mientras perfora, apoye la mano en una barra para la oreja para mantenerla firme.
    NOTA: No perfore todo el camino hasta el tejido cerebral. Deje una capa delgada de hueso para evitar daños en la duramadre. En su lugar, use una pinza para eliminar con cuidado la capa delgada restante de hueso.
12. Con el microscopio, compruebe que el extremo romo de la aguja pueda tocar la duramadre / tejido cerebral sin ser desviado por las piezas óseas.
13. Limpie la jeringa / capilar para evitar la contaminación de la solución inyectable.
    1. Mueva la jeringa/capilar completamente hacia arriba y sumérjala en el tubo de 1,5 ml que contiene 3% de H₂O₂. Asegúrate de eliminar todos los residuos y la sangre del vidrio. A continuación, sumerja el capilar en el tubo de 1,5 ml que contiene H₂O para lavar el H₂O₂.
    2. Retire el émbolo metálico de la jeringa Hamilton y coloque una gasa debajo de la jeringa/capilar, encima de la cabeza del animal. Use la jeringa de 1 mL llena de PBS para lavar la jeringa Hamilton insertando la aguja en la parte superior y expulsando PBS. Después de esto, inserte el émbolo de metal en la jeringa Hamilton.
14. Aspire 1 μL de aire. Esto evitará que el PBS en la jeringa Hamilton y la solución inyectable se mezclen en el capilar. A continuación, extraiga la cantidad deseada de solución inyectable. Se recomienda un máximo de 1 μL y 2 μL por depósito para ratones y ratas, respectivamente.
    NOTA: No se debe exceder un total de 3 μL / 6 μL por hemisferio, ya que la presión en el cerebro aumentará demasiado. Con un bolígrafo, se puede hacer una pequeña marca con mucho cuidado donde está el menisco de la solución. Esta marca se puede utilizar como punto de referencia para medir si la solución entra en el cerebro.
15. En el caso de las ratas, utilice una aguja de 25 g para perforar la duramadre. Inserte el capilar en el cerebro hasta la coordenada DV deseada. Mueva la jeringa/capilar 0,1 mm más profundo de lo previsto y retírela para dejar espacio para la solución.
16. Inyecte la solución a mano (0,1 μL por 10-15 seg) o con una bomba (0,4-0,6 μL/min). Revise el menisco para asegurarse de que la solución esté completamente inyectada.
    NOTA: Si la solución no se mueve hacia el cerebro, mueva la jeringa/capilar hacia arriba y hacia abajo 0,2 mm. Si aún no se inyecta, repita los pasos 2.13-2.14. Lo más probable es que la aguja esté obstruida con restos de tejido cerebral.
17. Mantenga la jeringa/capilar en su lugar durante otros 5 minutos para permitir que la solución inyectada se distribuya y la presión baje. Durante este período de espera, inyecte el analgésico y marque al animal si es necesario.
18. Mueva la jeringa/capilar hacia arriba 0,2 mm y manténgala en su lugar durante otros 2 minutos. Extraiga la jeringa/aguja muy lentamente para evitar que la solución inyectada se levante debido a la presión negativa.
19. Una vez que la jeringa/capilar esté fuera del cerebro, límpiela como se describe en el paso 2.13 para evitar que el tejido se seque y obstruya el capilar.
20. Continúe inyectando más áreas del cerebro o termine la cirugía.
21. Mueva la aguja de la jeringa a un lado girándola 180° en el eje z para evitar roturas mientras cierra la herida. Luego, cierre la herida con clips, pegamento para tejidos o suturas. Si se utilizó anestesia inyectable, inyecte el antídoto al animal.
    NOTA: Los animales que no están alojados solos tienden a limpiarse la cabeza unos a otros y posiblemente a quitarse las pinzas, el pegamento o los puntos de sutura.
22. Retire al animal del marco estereotáxico y colóquelo en la jaula limpia encima de la almohadilla térmica. Vigila al animal para asegurarte de que se despierta sin complicaciones. Proporcionar fácil acceso a alimentos y agua durante las primeras 24 horas.

3. Cuidados postoperatorios (duración 3-7 días)

1. Compruebe el peso (se acepta una pérdida de peso del 10%), el pelaje, las heces y la ingesta de alimentos/agua del animal durante los próximos 2-3 días (hasta 10 días para la inyección de tóxicos) para garantizar una recuperación adecuada. Si es necesario, aísle al animal y proporciónele comida húmeda, inyecciones de solución salina y una almohadilla térmica, esencial para algunas inyecciones de tóxicos, ya que los animales pueden tener problemas sistémicos adicionales.
2. Inyecte analgésico a los animales durante otros 1-2 días después de la cirugía para garantizar el alivio del dolor de acuerdo con las regulaciones locales. Si las suturas, clips o pegamento no se desprenden por sí solos, use isoflurano para anestesiar al animal y retire las suturas, los clips o el pegamento 1 semana después de la operación.

Resultados

Para evitar la orientación errónea, antes de cada experimento, verifique las coordenadas mediante inyecciones de tinte. A los animales se les inyectó azul de triptófano 0,2-0,5 μL utilizando el mismo protocolo, el capilar se retiró rápidamente después de la inyección y el cerebro se congeló rápidamente para evitar la difusión. Después de seccionar el micrótomo, el sitio de inyección se puede ver en azul (Figura 2 C,E). Para ga...

Discusión

La inyección estereotáxica, como cualquier procedimiento quirúrgico, tiene la principal dificultad para garantizar el bienestar y la supervivencia del animal. Por lo tanto, es fundamental vigilar de cerca al animal durante todo el procedimiento. El objetivo principal debe ser estar atento a las irregularidades respiratorias, la pérdida de la respiración o la recurrencia de reflejos y movimientos, especialmente para los cirujanos sin experiencia. Además, la aplicación de analgésic...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Allen brain atlas	Allen Institute	mouse brain - reference atlas
analgesic: ketoprofin OR buprenorphine
anesthetic: Isoflurane OR ketamine / xylazine OR fentanyl / medetomidine
blades - surgical sterile	Oasis Medical	No 10
capillaries - glass	Stoelting	50811
capillary puller	Sutter Instruments	P-97
cotton-tipped applicators	Stoelting	50975
drill - dental	Foredom	MH-170
Ethanol 70%
eye drops (Liquigel)	CVS	NDC 0023-9205-02	Carboxymethylcellulose Sodium (1%), Boric acid; calcium chloride; magnesium chloride; potassium chloride; purified water; PURITE® (stabilized oxychloro complex); sodium borate; and sodium chloride
forceps - full curved	Stoelting	52102-38P
forceps - hemostatic delicate	Stoelting	52110-13
gauze - cotton absorbent
H2O - sterile
H2O2 30%	Sigma Aldrich	216763
Hamilton 5ul syringe	Hamilton Company	7634-01
Hamilton blunt metal needle	Hamilton Company	7770-01
heat pad - far infrared	Kent Scientific	2665967
Iodine solution (Dynarex) 10%	Indemedical	102538
isoflurane	Baxter	1001936040
lidocaine 0.5%
lighter / matches
microscope (Stemi 508 Boom stand)	Zeiss	435064-9000-000
PBS sterile	Gibco - Thermo Fischer	10010-023
pump (injector)	Stoelting	53311
scalpel handle	Stoelting	52171P
shaver - electrical	andis	64800
solution to inject / material to implant
stereotax - small animal digital	Kopf	Model 940
sterilizer - glass bead	BT Lab Systems	BT1703
tubing - heat-shrink	Nelco	NP221-3/64
tweezers - dumont fine curved	Roboz	RS-5045A
underpad - absorbent
vaporizer for isoflurane (package)	Scivena Scientific	M3000
wound clips and applier / remover	Stoelting	59040
wound glue (Vetbond)	3M corporation	1469SB