אספקה תוך גולגולתית סטריאוטקסית של כימיקלים, חלבונים או וקטורים נגיפיים לחקר מחלת פרקינסון

Summary

אנו מתארים כיצד להזריק בהצלחה פתרונות לאזורים ספציפיים במוח של מכרסמים באמצעות מסגרת סטריאוטקסית. ניתוח הישרדות זה הוא שיטה מבוססת המשמשת לחיקוי היבטים שונים של מחלת פרקינסון.

Abstract

מחלת פרקינסון (PD) היא הפרעה מתקדמת המוגדרת באופן מסורתי על ידי רעד במנוחה ואקינזיה, בעיקר עקב אובדן נוירונים דופמינרגיים בחומר השחור. אזורי המוח המושפעים מציגים תכלילים פיברילריים תוך-עצביים המורכבים בעיקר מחלבוני אלפא-סינוקלאין (אסין). אף מודל של בעלי חיים עד כה לא סיכם את כל המאפיינים של מחלה זו. כאן, אנו מתארים את השימוש בהזרקה סטריאוטקסית להעברת כימיקלים, חלבונים או וקטורים נגיפיים תוך גולגולתיים על מנת לחקות היבטים שונים של מחלת פרקינסון. שיטות אלו מבוססות היטב ונמצאות בשימוש נרחב בכל תחום PD. זריקות סטריאוטקסיות גמישות להפליא; ניתן להתאים אותם בריכוז, גיל החיה המשמשת להזרקה, אזור המוח הממוקד ובמיני בעלי חיים בשימוש. שילובים של חומרים מאפשרים וריאציות מהירות כדי להעריך טיפולים או לשנות את חומרת הפתולוגיה או הליקויים ההתנהגותיים. על ידי הזרקת רעלים למוח, אנו יכולים לחקות דלקת ו/או אובדן חמור של נוירונים דופמינרגיים וכתוצאה מכך פנוטיפים מוטוריים משמעותיים. ניתן להשתמש בווקטורים ויראליים כדי להמיר תאים כדי לחקות היבטים גנטיים או מכניסטיים. זריקות אסין פיברילריות מוכנות מראש מסכמות בצורה הטובה ביותר את הפנוטיפ המתקדם לאורך תקופה ממושכת. לאחר הקמת שיטות אלה, זה יכול להיות חסכוני ליצור מודל חדש בהשוואה ליצירת קו טרנסגני חדש. עם זאת, שיטה זו דורשת עבודה עתירת עבודה מכיוון שהיא דורשת 30 דקות עד ארבע שעות לכל בעל חיים בהתאם לדגם בו נעשה שימוש. לכל בעל חיים יהיה מיקוד מעט שונה ולכן תיצור קבוצה מגוונת שמצד אחד יכולה להיות מאתגרת לפרש את התוצאות; מצד שני, עזרו לחקות מגוון מציאותי יותר שנמצא בחולים. ניתן לזהות בעלי חיים שגויים באמצעות קריאות התנהגותיות או הדמיה, או רק לאחר הקרבה המובילה לגודל קטן יותר לאחר שהמחקר כבר הסתיים. בסך הכל, שיטה זו היא דרך בסיסית אך יעילה להעריך מערך מגוון של היבטים של מחלת פרקינסון.

Introduction

מחלת פרקינסון (PD) היא מחלה ניוונית מתקדמת שכיחה יחסית המשפיעה על עד 1% מהאנשים מעל גיל 60^. מחלת פרקינסון היא הטרוגנית, אך מאופיין קלינית בעיקר בתסמינים מוטוריים הכוללים רעד במנוחה, ברדיקינזיה, אקינזיה, נוקשות, הפרעה בהליכה וחוסר יציבות יציבה. רוב התסמינים המוטוריים מופיעים בדרך כלל כאשר 60-70% מהדופמין הסטריאטלי (DA) אובד כתוצאה מניוון עצבי מתקדם ומובהק בחומר השחור (SN) pars compacta ^2,3. נוירונים דופמינרגיים ששרדו מכילים תכלילים תוך-תאיים הידועים כגופי לוי⁴. אגרגטים אלה מורכבים בעיקר מאלפא-סינוקלאין (asyn), חלבון קטן אך מתבטא מאוד בתאי עצב במוח⁵.

המנגנון הבסיסי של ניוון עצבי במחלת פרקינסון עדיין אינו ידוע. הזדקנות היא עדיין גורם הסיכון הגדול ביותר להפרעה זו⁶. יתר על כן, בני אדם הם המין היחיד שמפתח מחלת פרקינסון באופן טבעי. לכן, על מנת לחקור את הפתולוגיה של מחלת פרקינסון ולבדוק תרופות חדשות למניעת התקדמות המחלה, פותחו מגוון רחב של מודלים של בעלי חיים⁷. באופן אידיאלי, מודלים של בעלי חיים של מחלת פרקינסון צריכים להציג אובדן מתקדם תלוי גיל של נוירוני DA ב-SN, מלווה בתכלילים תוך-תאיים ואחריהם תפקוד מוטורי לקוי ולהיות מגיבים לטיפולים תחליפיים של DA. אף אחד מהמודלים הקיימים כיום בבעלי חיים אינו מסכם באופן מלא את כל התסמינים הקליניים והפתולוגיה של מחלת פרקינסון. מכיוון שכל מודל מציג היבטים שונים של המחלה, חשוב לשקול היטב את המודל המתאים לשימוש בניסוי על סמך השאלות שנשאלו.

מבחינה היסטורית, מודלים של בעלי חיים התבססו על חומרים רעילים, כולל 6-הידרוקסידופמין (6-OHDA) ו-1-מתיל-4-פניל-1,2,3,6-טטרה-הידרופירידין (MPTP), וחומרי הדברה, כגון רוטנון ופרקווט⁸. לכל חומר רעיל יש מנגנון פעולה שונה והוא נע בין נוירון DA ספציפי למזיק בדרך כלל לתאי המוח. ניתן לתת רעלים דרך הפה, להזריק תוך צפקית או ישירות למוח באמצעות זריקות סטריאוטקסיות בהתאם לחדירות מחסום הדם-מוח. בניגוד למודלים אחרים, מודלים של רעלנים מבטיחים רמה גבוהה של אובדן תאים דופמינרגיים ניגרוסטריאטליים ופנוטיפים התנהגותיים. דגמים מסוימים עשויים אפילו להציג פתולוגיה עדינה. המאפיינים הללו הופכים את המודלים של פרקינסון לרעלן לכלי נהדר לחקר טיפולים חלופיים וההשפעות של רעלנים סביבתיים על הופעת מחלת פרקינסון ^9,10.

בנוסף, מודלים רבים של עכברים טרנסגניים נוצרו באמצעות מגוון מקדמים וגנים הקשורים למחלת פרקינסון¹¹. רוב העכברים מציגים פתולוגיה ניגרוסטריאטלית אך ללא עדות ברורה לניוון עצבי. למודלים טרנסגניים יש יתרון בכך שהם עקביים בין בעלי חיים וקבוצות וברגע שהם נוצרים הם קלים לתחזוקה ולהפצה. למרות שהם אינם גורמים לניוון עצבי, הם בכל זאת מודלים שימושיים לחקירת שינויים תאיים הנגרמים על ידי וריאנטים גנטיים ומועמדים אפשריים לתרופות במערכת קומפלקס in vivo¹².

בניגוד למודלים טרנסגניים, ביטוי בתיווך וקטור ויראלי של גנים הקשורים למחלת פרקינסון מציע גישה גמישה יותר¹³. הזרקות סטריאוטקסיות מאפשרות לבחור אזורי מוח, סוגי תאים ורמות ביטוי שונות עבור מגוון רחב של מיני בעלי חיים כגון עכברים, חולדות, חזירים ופרימטים שאינם אנושיים. בתחילה, וקטורים נגיפיים רקומביננטיים המקודדים לאסין שימשו להתמרת נוירונים הממוקמים ב-SN של החולדה. הצטברות חלבון ותפקוד לקוי של התאים קודמים לאובדן תאים דופמינרגי מתקדם וכתוצאה מכך ליקוי התנהגותי. הבדלים במיקוד יכולים להוביל לשונות גדולה של אובדן תאים בין בעלי חיים (30-80%), מה שאחראי לליקויים התנהגותיים משתנים שנצפו רק בכ-25% מהחולדות שהוזרקו^.

מודל שהוקם לאחרונה הוא הזרקה תוך גולגולתית של סיבי אסין מוכנים מראש (PFFs) או תמציות מצטברות מרקמת מוח של עכבר או מטופל^15,16. מחקרים מרובים מצביעים על כך שהזרקת PFFs או תמציות גורמת לפתולוגיה אסינית נרחבת במוח החי כמו גם לאובדן נוירונים דופמינרגיים ב-SN. הצטברות של אסין מופיעה בתוך נוירונים המעצבנים את האזור המוזרק. בניגוד למודלים מבוססי וקטור ויראלי, מודל ה-PFF מתפתח לאט במשך מספר חודשים ואחריו ליקויים מוטוריים לאחר 6 חודשים. למודל זה יש פוטנציאל רב לחקר המנגנון או המניעה של פתולוגיה אסינית^17,18.

כל המודלים שהוזכרו לעיל היו מבוססים היטב ושימשו פעמים רבות לחקר היבטים שונים של ההפרעה האנושית. הזרקות סטריאוטקסיות של חומרים ישירות למוח מילאו תפקיד גדול בפיתוח מודלים של בעלי חיים אלה לא רק בתחום מחלת פרקינסון אלא גם בהפרעות נוירולוגיות אחרות. למרות שהוא עתיר עבודה, לניתוח סטריאוטקסי יש יתרונות בכך שהוא גמיש מאוד בגיל בעלי החיים המשמשים, אזור המוח הממוקד והחומר המוזרק, וניתן להתאים אותו בהתאם לשאלת המחקר שנשאלה. לדוגמה, ניתן להזריק חומרים בנפרד או בשילוב (וקטור + סיבים או רעיל + וקטור) כדי לסכם היבטים נוספים של המחלה או להעריך טיפולים ^19,20. בנוסף, ניתן להזריק חומרים באופן חד צדדי ולהשאיר את הצד הלא מוזרק כבקרה פנימית להערכת התנהגות כמו גם ניוון עצבי. לכן, כתב יד זה יתאר שלבים מפורטים ליצירת מודלים של מחלת פרקינסון באמצעות הזרקות סטריאוטקסיות.

Protocol

כל הניסויים במחקר זה נערכו בהתאם להמלצות המדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה של המכונים הלאומיים לבריאות ואושרו על ידי ועדות הטיפול והשימוש בבעלי חיים של המכון הלאומי להזדקנות בארה"ב.

לפני שמתחילים, אנא ודא שרכשת את ההכשרה המתאימה והאישור האתי מהמכון שלך הדרושים לביצוע הליך זה. בנוסף, יש לרכוש חומרי הרדמה (למשל, קטמין ובופרנורפין, או פנטניל ומדטומידין) המשמשים ולטפל בהם בהתאם לכללים הרלוונטיים של המוסד שלך.

1. הכנה (משך שעה)

1. הביאו בעלי חיים לחדר הניתוח ותנו להם להתאקלם תוך כדי הקמת אזור הניתוח. לבש ציוד מגן אישי מתאים (PPE).
   הערה: זה יכול להיות תלוי בתקנות הבטיחות המקומיות ובחומר המוזרק. וקטורים נגיפיים זקוקים בעיקר ל-PPE ברמת בטיחות ביולוגית 2. באופן כללי, לפחות ללבוש מסכה, כפפות וחלוק מעבדה חד פעמי. בנסיבות ספציפיות יש להשתמש בכפפות ומשקפי מגן נוספים.
2. עקר את כלי הניתוח באמצעות חיטוי או מעקר חרוזי זכוכית. למכרסמים אתה צריך ידית אזמל, מלקחיים המוסטטיים, פינצטה של דומונט, מלקחיים מעוקלים, ערכת סגירת פצעים (קליפסים) או מספריים ומלקחיים (לתפרים) וראש מקדחה.
3. יש לחטא את אזור הניתוח והמכשיר הסטריאוטקסי באתנול 70%, ולכסות את האזור הסמוך למכשיר הסטריאוטקסי במגבות נייר נקיות או בסדין סופג סטרילי.
4. הניחו את הדברים הבאים על מגבות: טיפות עיניים (למשל, Liquigel), גוזם שיער, צמר גפן, יודיקסאנול מדולל, להב כירורגי חד פעמי, מקדחה כירורגית עם מקדח מחוטא, טוש או קוצץ אוזניים, H₂O סטרילי בשפופרת של 1.5 מ"ל, צינור 1.5 מ"ל עם 3% H₂O₂ בסטרילי H₂O (1.35 מ"ל של H₂O + 0.15 מ"ל של 30% H₂O_2, הוכן טרי), מזרק של 1 מ"ל עם מחט 33G ו-PBS סטרילי או מי מלח, מזרק עם משכך כאבים ותרופת נגד אם נעשה שימוש בהרדמה להזרקה (למשל, אטיפמזול + בופרנורפין/קטופרופן; הוכן ואושר טרי בהיתר האתי) וכלי ניתוח חיטוי.
5. מלא איזופלורן ובדוק את הלחצים O₂ ו-N₂ , אם אתה משתמש בהרדמה בגז. הוסף מגבת נייר לתחתית תא השאיפה כדי לשמור עליו יבש ונקי.
   מערבבים ומכינים טרי את חומר ההרדמה (למשל, פנטניל + מדטומידין (לחולדות) או תמיסת קטמין + קסילזין (לעכברים)) אם משתמשים בהרדמה בהזרקה ואם אושר בהיתר האתי.
6. הרכיבו את מזרק הזכוכית של המילטון ונימי הזכוכית (איור 1A 1.).
   1. הניחו את נימי הזכוכית הנמשכים על השולחן. הנח את האצבע המורה במקום שבו הנימים נעשים דקים יותר עם קצה הציפורן במקום שבו יש לחתוך את הנימים.
      הערה: תלוי בעומק ההזרקה שלך בכל מקום בין 0.5 - 2 ס"מ.
   2. השתמש בקצה אריח קרמיקה כדי לגרד בזהירות את חלק המחט כמה פעמים. קח נימי זכוכית ביד אחת והשתמש באגודל ובאצבע המורה כדי לתפוס את חלק המחט הדק. משוך מהאמצע עד הסוף עד שהמחט מתנתקת בצורה בוטה.
      הערה: אם זה לא עובד או שהמחט מתנתקת מהקצה, חזור על הפעולה מספר פעמים. אם הוא עדיין לא מתנתק, חזור על גירוד אריחים. ודא שחלק המחט אינו דק מדי (קוטר >50 מיקרומטר) ואינו מתכופף בקלות.
7. אטום את נימי הזכוכית למזרק המילטון.
   1. חבר צינור כיווץ של 1 ס"מ מעל מחט המתכת הקהה המחוברת למזרק הזכוכית של המילטון. לאחר מכן הניחו את הקצה העבה של נימי הזכוכית מעל מחט המתכת של המילטון.
   2. הנח צינורות כיווץ מעל מחצית נימי הזכוכית, והבטיח מרווח של לפחות 1 ס"מ בין קצה מחט המתכת של המילטון למעבר החרוטי של הנימים. זה יהיה החלל המכיל את תמיסת ההזרקה הרצויה מאוחר יותר.
   3. השתמש במצית או בגפרור כדי לחמם את צינור הכיווץ ולאטום את מחט ההזרקה.
      הערה: ישנן מספר אפשרויות מחזיקים שונות המאפשרות לך לקבע את מזרק המילטון לזרוע הסטריאוטקסית משמאל. ודא שאתה עדיין יכול לקרוא את המספרים על מזרק המילטון. אם אתה משתמש במשאבה כדי להזריק את התמיסה, חבר את המשאבה לזרוע הסטריאוטקסית וקבע את מזרק המילטון על המשאבה.
8. הסר את בוכנת המתכת. הכנס מחט 27G המחוברת למזרק של 1 מ"ל מלא במי מלח או PBS בחלקו העליון של מזרק המילטון. שטפו את מזרק המילטון עם PBS כדי לבדוק אם הוא אטום ולשטוף את כל בועות האוויר.
   הערה: בועות אוויר יפריעו לקליטה והזרקה של התמיסה שלך מכיוון שהאוויר דוחס יותר מנוזל.
9. לאחר שהכל נבדק ומוכן, פתח את הבורג הקטן בזרוע ציר ה-z (איור 1A 2.) של המכשיר הסטריאוטקסי וסובב את הזרוע במרווחים של 90 מעלות בכיוון השעון כדי להזיז מזרק זכוכית/נימי מהדרך (כדי למנוע מהנימים להישבר בזמן קיבוע החיה למכשיר הסטריאוטקסי).
   הערה: בדוק שכל הזוויות וההגדרות של הסטריאוטקס מוגדרות לפרמטרים הרצויים (בדרך כלל 0°), מוט השיניים והאוזניות מוגדרים לקואורדינטות הרצויות והמזרק/נימי המילטון כולם ישרים.
10. הפעל את כרית החום בפלטפורמת הסטריאוטקס והשתמש בריפוד נוסף למעלה אם הוא חם מדי. הנח כלוב ריק ונקי עם כרית חום נוספת ליד אזור הניתוח.

2. ניתוח (משך הניתוח בממוצע שעה לבעל חיים)

1. להרדמת גז
   1. הפעל איזופלורן ל-5% עם זרימת אוויר N₂ + O₂ (כ-1 ליטר לדקה) ופתח את השסתום לתא השאיפה. הכניסו את החיה לתא וודאו שהיא אטומה היטב. התבוננו בנשימה עד שהיא האטה במידה ניכרת (נשימה עמוקה).
   2. לאחר שהחיה מחוסרת הכרה, פתחו את השסתום למכשיר סטריאוטקסי וסגרו את שסתום החדר. הגדר איזופלורן ל-2%.
   3. פתחו את התא והוציאו את החיה שמחזיקה אותה בצוואר, פתחו את פיה עם המלקחיים והניחו את החיה על מוט השיניים (איור 1A 6.) כשהשיניים העליונות הקדמיות נכנסות לתוך החור.
      הערה: שלב זה רגיש לזמן מכיוון שהחיה יכולה להתעורר שוב על ידי אי נשימה של איזופלורן.
   4. הניחו את חרוט האף על החוטם והתבוננו בנשימה כדי להבטיח קצב קבוע ללא נשימה מאולצת. ודא שהחיה מורדמת עמוק על ידי בדיקת היעדר רפלקסים של נסיגת הדוושה של הגפיים האחוריות לפני שתמשיך.
      הערה: המשיכו לבדוק לאורך כל ההליך כדי שהחיה לא תפסיק לנשום או תתעורר. במידת הצורך, התאם את % האיזופלורן במרווחים קטנים. כדי לבדוק את רפלקס נסיגת הדוושה של הגפיים האחוריות, השתמש בזוג פינצטה וצבט את כף הרגל האחורית. אם החיה מושכת את הגפה (רפלקס להסרת גירויי כאב) ההרדמה נמוכה מדי.
   5. קבע את ראש החיה במקומו באמצעות שני מוטות האוזניים (איור 1A 7.). כאשר עושים זאת כהלכה, האוזניים צריכות להצביע הצידה מעל מוטות האוזניים. אם הראש עדיין זז, כוונן את מוטות האוזניים או חרוט האף כדי לקבע את הראש חזק יותר במקומו.
      הערה: היה עדיןכדי להימנע משבירת עור התוף של בעלי החיים על ידי הכנסת מוטות האוזניים עמוק מדי. חולדות נוטות למצמץ כאשר האוזן מוכנסת כהלכה.
2. להרדמה בהזרקה:
   1. יש להזריק לבעל החיים מינון מתאים/מומלץ של הרדמה (300 מיקרוגרם/ק"ג פנטניל ו-300 מיקרוגרם/ק"ג מדטומידין לחולדות; 100 מ"ג/ק"ג קטמין ו-10 מ"ג/ק"ג קסילזין לעכברים) ולהחזיר אותו לכלוב הביתי.
   2. בדוק את רפלקסי נסיגת הדוושה של בעלי חיים 5 דקות לאחר ההזרקה. אם נעדר, קבע את ראש החיה במקומו באמצעות שני מוטות האוזניים (איור 1A 7.). כאשר עושים זאת כהלכה, האוזניים צריכות להצביע הצידה מעל מוטות האוזניים. לאחר מכן, הנח את החיה על מוט השיניים (איור 1A 6.) והברג את הידית. אם הראש עדיין זז, כוונן את מוטות האוזניים או חרוט הידית כדי לקבע את הראש חזק יותר במקומו.
      הערה: אפשר לשבור את עור התוף של בעל חיים כאשר מוטות האוזניים מוכנסים עמוק מדי. אל תבריג את הידית חזק מדי. זה יכול לשבור את האף של החיות.
   3. אם נצפים רפלקסים של נסיגת הדוושה, המתן עוד 5-10 דקות. אם עדיין נצפה, יש להזריק עוד 10% מההרדמה הקודמת.
      הערה: הגדילו את מינון ההרדמה לאט עם תקופת המתנה בין לבין כדי למנוע מוות של בעל החיים עקב חנק.
   4. ודא שהגולגולת שטוחה על ידי התאמת גובה מוט השיניים ו/או מוט האוזניים.
      הערה: היזהר בעת כוונון הסורגים מכיוון שהראש ישנה זווית וחרוט/ידית האף עלולים לשבור את האף של בעלי החיים.
3. יש למרוח טיפות עיניים על כל עין (למשל, Liquigel) כדי למנוע התייבשות במהלך הניתוח. לגלח את ראש החיה מהעיניים לאוזניים.
4. חיטוי אזור הניתוח באמצעות 10% יודופובידון. בנוסף, יש להזריק חומר הרדמה מקומי (למשל, 0.5% לידוקאין) תוך עורית במקום החתך. מומלץ להמתין 2-3 דקות עד שהוא יפעל לפני שממשיכים.
5. בעזרת האזמל יש לבצע חתך רציף אחד מבין העיניים לבין האוזניים.
   הערה: היזהר לא לחתוך יותר מדי לאחור מכיוון שקיצוץ שרירי הצוואר יסבך את ההתאוששות.
6. השתמש בקצות הכותנה כדי לפתוח את הפצע ולנקות את האזור מדם. עבור חולדות, השתמש במלקחיים ההמוסטטיים כדי לשמור על הפצע פתוח, על ידי הצמדתם לרקמה התת עורית ולתת להם לתלות בכל צד. עבור עכברים, במידת הצורך, השתמש במיקרו קליפסים.
   הערה: זהו החלק הכואב ביותר בהליך. הידוק הרקמה התת עורית במקום העור יגביר את הריפוי.
7. הזיזו את המזרק/נימי (איור 1A 1.) 180 מעלות נגד כיוון השעון על ציר ה-z (איור 1A 2.) והביאו אותו מעל ראשו של בעל החיים. הקפד לסגור את הכפתור לחלוטין כדי שזרוע ציר ה-z לא תתנדנד במהלך הניתוח.
8. השתמש במיקרוסקופ ובכפתורים בכל זרוע סטריאוטקסית (איור 1A 3.-5.) כדי להזיז את הקצה הקהה של נימי הזכוכית (המחובר למזרק הזכוכית של המילטון; איור 1א 1.) ממש על גבי ברגמה (נוגע אך לא לוחץ על העצם). הגדר את כל הערכים בתצוגה הדיגיטלית לאפס (איור 1A 8.).
   הערה: ברגמה (איור 1B) היא הנקודה שבה נפגשים התפרים הסגיטאליים והעטרתיים של העצמות הקודקודיות והקדמיות. זו תהיה נקודת המוצא.
9. במבט דרך המיקרוסקופ, הזז את הקצה הקהה של הנימים ימינה על גבי הלמבדה. אם ערך ציר ה-z (גבי/גחון = DV) נמצא בטווח של +/-0.1 מ"מ, ראש החיה מפולס. אם הוא גבוה או נמוך יותר, השתמש במוט השן כדי לכוונן את הראש בהתאם עד לטווח של +/- 0.1 מ"מ.
   הערה: למבדה (איור 1B) מוגדרת כנקודה שבה נפגשים התפרים הסגיטליים והעטרתיים של העצמות הקודקודיות והעורפיות. ניתן להשתמש בשיטה זו גם כדי ליישר את הצד השמאלי והימני של הגולגולת אם ניתן לכוונן את מוטות האוזניים בנפרד. היזהר בעת כוונון הסורגים מכיוון שהראש ישנה זווית וחרוט / ידית האף עלולים לשבור את האף של בעלי החיים.
10. השתמשו באטלס המוח של אלן (איור 1C, D) כדי לזהות את הקואורדינטות עבור אזור המטרה הרצוי שלכם. השתמש בזרועות ציר ה-y (קדמי/אחורי = AP) וציר ה-x (מדיאלי/רוחבי = ML) כדי להזיז את המזרק/הנימים למיקום הנכון.
    הערה: יש לבצע הזרקות צבע (איור 2A-E) לפני פרוצדורות כירורגיות בבעלי חיים נפרדים כדי להבטיח שהקואורדינטות נכונות לזן/גיל של בעלי החיים שבהם נעשה שימוש.
11. הסתכל דרך המיקרוסקופ והתכונן לקדוח בזהירות חור שבו הקצה הקהה של הנימים פוגש את העצם. לפני שמתחילים, הזיזו את הנימים מספיק על ציר ה-y כדי שלא ייפגע בזמן הקידוח. התחל לקדוח במעגל גדול יותר וקטן ככל שאתה קודח עמוק יותר. בזמן הקידוח, הנח את היד על מוט אוזניים כדי לשמור על יציבותה.
    הערה: אין לקדוח עד לרקמת המוח. השאירו שכבה דקה של עצם כדי למנוע נזק לדורה. במקום זאת, השתמש בפינצטה כדי להסיר בזהירות את שכבת העצם הדקה שנותרה.
12. בעזרת המיקרוסקופ, בדוק שהקצה הקהה של המחט יכול לגעת ברקמת הדורה / המוח מבלי להיות מוסט על ידי חתיכות עצם.
13. נקה את המזרק / הנימים כדי למנוע זיהום של תמיסת ההזרקה.
    1. הזיזו את המזרק/הנימים עד הסוף, וטבלו אותו בצינור של 1.5 מ"ל המכיל 3% H₂O₂. הקפד להסיר את כל הפסולת והדם מהזכוכית. לאחר מכן, טבלו את הנימים בצינור ה-1.5 מ"ל המכיל H₂O כדי לשטוף את ה-H₂O₂.
    2. הסר את בוכנת המתכת ממזרק המילטון והנח גזה מתחת למזרק/נימי, על גבי ראש החיה. השתמש במזרק 1 מ"ל מלא ב-PBS כדי לשטוף את מזרק המילטון על ידי הכנסת המחט בחלק העליון והתזת PBS החוצה. לאחר מכן, הכנס את בוכנת המתכת למזרק המילטון.
14. שאב 1 מיקרוליטר אוויר. זה ימנע מה-PBS במזרק המילטון ומתמיסת ההזרקה להתערבב בנימי. לאחר מכן ערוך את הכמות הרצויה של תמיסת ההזרקה. מקסימום 1 מיקרוליטר ו-2 מיקרוליטר לכל פיקדון מומלץ לעכברים וחולדות בהתאמה.
    הערה: אין לחרוג מ-3 מיקרוליטר / 6 מיקרוליטר לחצי כדור מכיוון שהלחץ במוח יעלה יותר מדי. בעזרת עט ניתן לסמן מעט בזהירות רבה היכן נמצא המניסקוס של התמיסה. סימן זה יכול לשמש כנקודת ייחוס כדי לאמוד אם התמיסה נכנסת למוח.
15. עבור חולדות, השתמש במחט 25G כדי לנקב את הדורה. הכנס את הנימים למוח לקואורדינטת ה-DV הרצויה. הזיזו את המזרק/הנימים בעומק של 0.1 מ"מ מהמתוכנן ומשכו חזרה למעלה כדי לפנות מקום לתמיסה.
16. הזרקת תמיסה ביד (0.1 מיקרוליטר לכל 10-15 שניות) או עם משאבה (0.4-0.6 מיקרוליטר לדקה). בדוק את המניסקוס כדי לוודא שהתמיסה מוזרקת במלואה.
    הערה: אם התמיסה לא עוברת למוח, הזיזו את המזרק/הנימים למעלה ולמטה 0.2 מ"מ. אם הוא עדיין לא מזריק, חזור על שלבים 2.13-2.14. סביר להניח שהמחט סתומה בפסולת רקמת מוח.
17. החזיקו את המזרק/הנימים במקומם למשך 5 דקות נוספות כדי לאפשר לתמיסה המוזרקת להתפזר והלחץ לרדת. במהלך תקופת המתנה זו, הזריק את משכך הכאבים וסמן את בעל החיים במידת הצורך.
18. הזיזו את המזרק/הנימים כלפי מעלה ב-0.2 מ"מ והחזיקו במקומו למשך 2 דקות נוספות. משוך את המזרק/מחט החוצה לאט מאוד כדי להימנע ממשיכת תמיסה מוזרקת עקב הלחץ השלילי.
19. לאחר שהמזרק/הנימים יוצאים מהמוח, נקו אותו כמתואר בשלב 2.13 כדי למנוע מהרקמה להתייבש ולסתום את הנימים.
20. המשך להזריק אזורים נוספים במוח או סיים את הניתוח.
21. הזז את מחט המזרק הצידה על ידי סיבובה ב-180 מעלות על ציר ה-z כדי למנוע שבירה בזמן סגירת הפצע. לאחר מכן, סגור את הפצע בעזרת קליפסים, דבק רקמות או תפרים. אם נעשה שימוש בהרדמה להזרקה, הזריק לבעל החיים את התרופה.
    הערה: בעלי חיים שאינם שוכנים לבד נוטים לנקות זה את ראשו של זה ואולי להסיר קליפסים, דבק או תפרים.
22. הסר את החיה מהמסגרת הסטריאוטקסית והנח אותה בכלוב הנקי על גבי כרית החום. עקוב אחר החיה כדי לוודא שהיא מתעוררת ללא סיבוכים. ספק גישה נוחה למזון ומים במשך 24 השעות הראשונות.

3. טיפול לאחר OP (משך 3-7 ימים)

1. בדוק את המשקל (ירידה של 10% במשקל מקובלת), פרווה, צואה וצריכת מזון/מים של בעל החיים במהלך 2-3 הימים הבאים (עד 10 ימים להזרקת חומרים רעילים) כדי להבטיח התאוששות תקינה. במידת הצורך, בודדו את בעל החיים וספקו מזון רטוב, זריקות מי מלח וכרית חימום, החיוניים לזריקות רעילות מסוימות מכיוון שלבעלי חיים עלולות להיות בעיות מערכתיות נוספות.
2. יש להזריק לבעלי חיים משכך כאבים למשך 1-2 ימים נוספים לאחר הניתוח כדי להבטיח הקלה בכאב בהתאם לתקנות המקומיות. אם תפרים, קליפסים או דבק אינם יורדים מעצמם, השתמשו באיזופלורן כדי להרדים את החיה ולהסיר תפרים, קליפסים או דבק שבוע לאחר הניתוח.

תוצאות

כדי למנוע מיקוד שגוי, לפני כל ניסוי, ודא את הקואורדינטות באמצעות הזרקות צבע. לבעלי חיים הוזרקו 0.2-0.5 מיקרוליטר טריפטופן כחול באותו פרוטוקול, הנימים הוסרו במהירות לאחר ההזרקה והמוח הוקפא במהירות כדי למנוע דיפוזיה. אחרי החיתוך על המיקרוטום, אפשר לראות את אתר ההזרקה בכחול (

Discussion

להזרקה סטריאוטקסית, כמו לכל הליך כירורגי, יש את הקושי העיקרי להבטיח את רווחתו והישרדותו של בעל החיים. לכן, חיוני לעקוב מקרוב אחר בעל החיים לאורך כל ההליך. שמירה על אי סדרים בנשימה, אובדן נשימה או הישנות של רפלקסים ותנועות צריכה להיות המוקד העיקרי, במיוחד עבור מנתחים חסרי נ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Allen brain atlas	Allen Institute	mouse brain - reference atlas
analgesic: ketoprofin OR buprenorphine
anesthetic: Isoflurane OR ketamine / xylazine OR fentanyl / medetomidine
blades - surgical sterile	Oasis Medical	No 10
capillaries - glass	Stoelting	50811
capillary puller	Sutter Instruments	P-97
cotton-tipped applicators	Stoelting	50975
drill - dental	Foredom	MH-170
Ethanol 70%
eye drops (Liquigel)	CVS	NDC 0023-9205-02	Carboxymethylcellulose Sodium (1%), Boric acid; calcium chloride; magnesium chloride; potassium chloride; purified water; PURITE® (stabilized oxychloro complex); sodium borate; and sodium chloride
forceps - full curved	Stoelting	52102-38P
forceps - hemostatic delicate	Stoelting	52110-13
gauze - cotton absorbent
H2O - sterile
H2O2 30%	Sigma Aldrich	216763
Hamilton 5ul syringe	Hamilton Company	7634-01
Hamilton blunt metal needle	Hamilton Company	7770-01
heat pad - far infrared	Kent Scientific	2665967
Iodine solution (Dynarex) 10%	Indemedical	102538
isoflurane	Baxter	1001936040
lidocaine 0.5%
lighter / matches
microscope (Stemi 508 Boom stand)	Zeiss	435064-9000-000
PBS sterile	Gibco - Thermo Fischer	10010-023
pump (injector)	Stoelting	53311
scalpel handle	Stoelting	52171P
shaver - electrical	andis	64800
solution to inject / material to implant
stereotax - small animal digital	Kopf	Model 940
sterilizer - glass bead	BT Lab Systems	BT1703
tubing - heat-shrink	Nelco	NP221-3/64
tweezers - dumont fine curved	Roboz	RS-5045A
underpad - absorbent
vaporizer for isoflurane (package)	Scivena Scientific	M3000
wound clips and applier / remover	Stoelting	59040
wound glue (Vetbond)	3M corporation	1469SB