Parkinson Hastalığını İncelemek için Kimyasalların, Proteinlerin veya Viral Vektörlerin Stereotaksik İntrakraniyal Verilmesi

Özet

Stereotaksik bir çerçeve kullanarak kemirgenlerin belirli beyin bölgelerine çözeltilerin nasıl başarılı bir şekilde enjekte edileceğini açıklıyoruz. Bu hayatta kalma ameliyatı, Parkinson hastalığının çeşitli yönlerini taklit etmek için kullanılan köklü bir yöntemdir.

Özet

Parkinson hastalığı (PH), geleneksel olarak istirahat tremoru ve akinezi ile tanımlanan, primer olarak substantia nigra'daki dopaminerjik nöronların kaybına bağlı ilerleyici bir hastalıktır. Etkilenen beyin bölgeleri, esas olarak alfa-sinüklein (asyn) proteinlerinden oluşan intranöronal fibriller inklüzyonlar gösterir. Şimdiye kadar hiçbir hayvan modeli bu hastalığın tüm özelliklerini özetlememiştir. Burada, PH'nin çeşitli yönlerini taklit etmek için intrakraniyal olarak kimyasallar, proteinler veya viral vektörler vermek için stereotaksik enjeksiyonun kullanımını açıklıyoruz. Bu yöntemler iyi bilinmektedir ve PD alanında yaygın olarak kullanılmaktadır. Stereotaksik enjeksiyonlar inanılmaz derecede esnektir; Konsantrasyon, enjeksiyon için kullanılan hayvanın yaşı, hedeflenen beyin bölgesi ve kullanılan hayvan türlerinde ayarlanabilirler. Madde kombinasyonları, tedavileri değerlendirmek veya patolojinin veya davranışsal eksikliklerin şiddetini değiştirmek için hızlı varyasyonlara izin verir. Beyne toksinler enjekte ederek, iltihabı ve / veya ciddi bir dopaminerjik nöron kaybını taklit edebilir ve bu da önemli motor fenotiplerle sonuçlanır. Viral vektörler, genetik veya mekanik yönleri taklit etmek için hücreleri dönüştürmek için kullanılabilir. Önceden oluşturulmuş fibriller asin enjeksiyonları, uzun bir süre boyunca ilerleyici fenotipi en iyi şekilde özetler. Bu yöntemler kurulduktan sonra, yeni bir transgenik hat oluşturmaya kıyasla yeni bir model oluşturmak ekonomik olabilir. Bununla birlikte, bu yöntem, kullanılan modele bağlı olarak hayvan başına 30 dakika ila dört saat gerektirdiğinden emek yoğundur. Her hayvanın biraz farklı bir hedeflemesi olacaktır ve bu nedenle, bir yandan sonuçları yorumlamak zor olabilecek çeşitli bir kohort oluşturacaktır; Öte yandan, hastalarda bulunan daha gerçekçi bir çeşitliliği taklit etmeye yardımcı olur. Yanlış hedeflenmiş hayvanlar, davranışsal veya görüntüleme okumaları kullanılarak veya ancak çalışma tamamlandıktan sonra daha küçük kohort boyutuna yol açan kurban edildikten sonra tanımlanabilir. Genel olarak, bu yöntem, çeşitli PD yönlerini değerlendirmenin ilkel ama etkili bir yoludur.

Giriş

Parkinson hastalığı (PH), 60 yaşın üzerindeki insanların %1'ini etkileyen nispeten yaygın bir ilerleyici nörodejeneratif hastalıktır¹. PH heterojen olmakla birlikte klinik olarak esas olarak istirahat tremoru, bradikinezi, akinezi, rijidite, yürüme bozukluğu ve postüral instabilite gibi motor semptomlarla karakterizedir. Motor semptomların çoğu tipik olarak, substantia nigra (SN) pars compacta ^2,3'teki ilerleyici ve belirgin nörodejenerasyonun bir sonucu olarak striatal dopaminin (DA) %60-70'i kaybedildiğinde ortaya çıkar. Hayatta kalan dopaminerjik nöronlar, Lewy^{cisimcikleri 4} olarak bilinen hücre içi inklüzyonlar içerir. Bu agregalar esas olarak beyindeki nöronlarda küçük ama yüksek oranda eksprese edilen bir protein olan alfa-sinükleinden (asyn) oluşur⁵.

PH'de nörodejenerasyonun altında yatan mekanizma hala bilinmemektedir. Yaşlanma hala bu bozukluk için en büyük risk faktörüdür⁶. Ayrıca, insanlar doğal olarak PH geliştiren tek türdür. Bu nedenle, PH patolojisini araştırmak ve hastalığın ilerlemesini önlemek için yeni ilaçları test etmek için çok çeşitli hayvan modelleri geliştirilmiştir⁷. İdeal olarak, PH'nin hayvan modelleri, SN'de yaşa bağlı, ilerleyici bir DA nöron kaybı göstermeli, hücre içi inklüzyonlar ve ardından motor disfonksiyon ile birlikte DA replasman tedavilerine yanıt vermelidir. Şu anda mevcut olan hayvan modellerinin hiçbiri PH'nin tüm klinik semptomlarını ve patolojisini tam olarak özetlememektedir. Her model hastalığın farklı yönlerini ortaya koyduğundan, sorulan sorulara dayanarak bir deneyde kullanılacak uygun modeli dikkatlice düşünmek önemlidir.

Tarihsel olarak, hayvan modelleri, 6-hidroksidopamin (6-OHDA) ve 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridin (MPTP) dahil olmak üzere toksik maddelere ve rotenon ve paraquat⁸ gibi pestisitlere dayanıyordu. Her toksik maddenin farklı bir etki mekanizması vardır ve DA nöronuna özgü olandan genel olarak beyin hücrelerine zararlı olana kadar değişir. Toksinler, kan beyin bariyeri geçirgenliğine bağlı olarak ağızdan verilebilir, intraperitoneal olarak enjekte edilebilir veya stereotaksik enjeksiyonlar kullanılarak doğrudan beyne enjekte edilebilir. Diğer modellerden farklı olarak, toksin modelleri yüksek derecede nigrostriatal dopaminerjik hücre kaybını ve davranışsal fenotipleri garanti eder. Bazı modeller ince patoloji ile bile ortaya çıkabilir. Bu özellikler, toksin PD modellerini, replasman tedavilerini ve çevresel toksinlerin PD^9,10'un başlangıcı üzerindeki etkilerini incelemek için harika bir araç haline getirir.

Ek olarak, çeşitli promotörler ve PD ile ilgili genler kullanılarak çok sayıda transgenik fare modeli oluşturulmuştur¹¹. Çoğu fare nigrostriatal patoloji ile ortaya çıkar, ancak nörodejenerasyonun net bir kanıtı yoktur. Transgenik modeller, hayvanlar ve kohortlar arasında tutarlı olma avantajına sahiptir ve bir kez oluşturulduktan sonra bakımı ve dağıtılması kolaydır. Nörodejenerasyona yol açmasalar da, yine de bir kompleks in vivo sistemde genetik varyantların ve olası ilaç adaylarının neden olduğu hücresel değişiklikleri araştırmak için yararlı modellerdir¹².

Transgenik modellerin aksine, PD ile ilişkili genlerin viral vektör aracılı ekspresyonu daha esnek bir yaklaşım sunar¹³. Stereotaksik enjeksiyonlar, fareler, sıçanlar, domuzlar ve insan olmayan primatlar gibi çok çeşitli hayvan türleri için çeşitli beyin bölgelerinin, hücre tiplerinin ve ekspresyon seviyelerinin seçilmesine izin verir. Başlangıçta, sıçan SN'sinde bulunan nöronları dönüştürmek için asini kodlayan rekombinant viral vektörler kullanıldı. Protein birikimi ve hücresel disfonksiyon, ilerleyici dopaminerjik hücre kaybından önce gelir ve davranışsal eksikliğe neden olur. Hedeflemedeki farklılıklar, hayvanlar arasında (% 30-80) büyük bir hücre kaybı varyasyonuna yol açabilir, bu da enjekte edilen sıçanların sadece yaklaşık% 25'inde görülen değişken davranış eksikliklerinden sorumludur¹⁴.

Yakın zamanda kurulan bir model, fare veya hasta beyin dokusundan önceden oluşturulmuş asin fibrillerin (PFF'ler) veya agrega ekstraktlarının intrakraniyal enjeksiyonudur^15,16. Birden fazla çalışma, PFF'lerin veya ekstraktların enjeksiyonunun, hayvan beyninde geniş çaplı bir asin patolojisine ve ayrıca SN'de dopaminerjik nöron kaybına yol açtığını göstermektedir. Asyn birikimi, enjekte edilen bölgeyi innerve eden nöronlar içinde ortaya çıkar. Viral vektör tabanlı modellerin aksine, PFF modeli birkaç ay içinde yavaş yavaş gelişir ve ardından 6 ayda motor eksiklikler ortaya çıkar. Bu model, asin patolojisinin mekanizmasını veya önlenmesini incelemek için büyük bir potansiyele sahiptir^17,18.

Yukarıda bahsedilen tüm modeller iyi kurulmuş ve insan bozukluğunun çeşitli yönlerini incelemek için defalarca kullanılmıştır. Maddelerin doğrudan beyne stereotaksik enjeksiyonları, bu hayvan modellerinin geliştirilmesinde sadece PH alanında değil, aynı zamanda diğer nörolojik bozukluklarda da büyük rol oynamıştır. Emek yoğun olmasına rağmen, stereotaksik cerrahi, kullanılan hayvanların yaşı, hedeflenen beyin bölgesi ve enjekte edilen madde konusunda oldukça esnek olma avantajlarına sahiptir ve sorulan araştırma sorusuna bağlı olarak ayarlanabilir. Örneğin, hastalığın daha fazla yönünü özetlemek veya tedavileri değerlendirmek için maddeler tek tek veya kombinasyon halinde (vektör + fibriller veya toksik madde + vektör) enjekte edilebilir^19,20. Ek olarak, maddeler tek taraflı olarak enjekte edilmeden bırakılabilir, bu da davranışı ve nörodejenerasyonu değerlendirmek için bir iç kontrol olarak enjekte edilmez. Bu nedenle, bu el yazması, stereotaksik enjeksiyonlar kullanarak PD modelleri oluşturmak için ayrıntılı adımları özetleyecektir.

Protokol

Bu çalışmadaki tüm deneyler, Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'ndaki tavsiyelere sıkı sıkıya bağlı olarak yürütülmüş ve ABD Ulusal Yaşlanma Enstitüsü Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komiteleri tarafından onaylanmıştır.

Başlamadan önce, lütfen bu prosedürü gerçekleştirmek için gerekli olan enstitünüzden uygun eğitimi ve etik onayı aldığınızdan emin olun. Ek olarak, kullanılan anestezikler (örneğin, ketamin ve buprenorfin veya fentanil ve medetomidin) kurumunuzun ilgili kurallarına göre edinilmeli ve ele alınmalıdır.

1. Hazırlık (süre 1 saat)

1. Hayvanları ameliyathaneye getirin ve cerrahi alanı kurarken iklime alışmalarına izin verin. Uygun kişisel koruma ekipmanı (KKD) giyin.
   NOT: Bu, yerel güvenlik düzenlemelerine ve enjekte edilen maddeye bağlı olabilir. Viral vektörler çoğunlukla biyogüvenlik seviyesi 2 KKD'ye ihtiyaç duyar. Genel olarak, en azından bir maske, eldiven ve tek kullanımlık laboratuvar önlüğü giyin. Özel durumlarda ek eldiven ve gözlük kullanılmalıdır.
2. Cerrahi aletleri bir otoklav veya cam boncuk sterilizatörü kullanarak sterilize edin. Kemirgenler için neşter sapı, hemostatik forseps, Dumont cımbız, kavisli forseps, yara kapatma kiti (klipsler) veya makas ve forseps (dikişler için) ve bir matkap kafasına ihtiyacınız vardır.
3. Cerrahi alanı ve stereotaksik aleti %70 etanol ile dezenfekte edin ve stereotaksik aletin yanındaki alanı temiz kağıt havlu veya steril emici bir örtü ile örtün.
4. Havluların üzerine aşağıdakileri yerleştirin: göz damlası (örn., Liquigel), saç düzeltici, pamuklu çubuklar, seyreltilmiş iyodiksanol, tek kullanımlık cerrahi bıçak, dezenfekte edilmiş matkap uçlu cerrahi matkap, işaretleyici veya kulak kesme makinesi, 1,5 mL'lik tüpte steril H₂O,_{steril H2}O'da %3 H 2 O₂ olan 1,5 mL tüp (1,35 mL H₂O + 0,15 mL % 30 H₂O_2, taze hazırlanmış), 33G iğneli ve steril PBS veya tuzlu su ile 1 mL'lik bir şırınga, enjekte edilebilir anestezi kullanılıyorsa analjezik ve panzehir içeren şırınga (ör., atipamezol + buprenorfin / ketoprofen; taze hazırlanmış ve etik izinde onaylanmış) ve otoklavlanmış cerrahi aletler.
5. İzofluranı doldurun ve gaz anestezisi kullanıyorsanız O₂ ve N₂ basınçlarını kontrol edin. Kuru ve temiz tutmak için inhalasyon odasının dibine bir kağıt havlu ekleyin.
   Anestezik maddeyi karıştırın ve taze olarak hazırlayın (ör., fentanil + medetomidin (sıçanlar için) veya ketamin + ksilazin çözeltisi (fareler için)) enjekte edilebilir anestezi kullanılıyorsa ve etik izinde onaylanmışsa.
6. Hamilton cam şırıngayı ve cam kılcal damarı monte edin (Şekil 1A 1.).
   1. Çekilen cam kılcal damarı masanın üzerine yerleştirin. İşaret parmağınızı kılcal damarın inceldiği yerlere, tırnak ucunu kılcal damarın kesilmesi gereken yere yerleştirin.
      NOT: Enjeksiyonunuzun derinliğine bağlı olarak 0,5 - 2 cm arasında herhangi bir yerde.
   2. İğne kısmını birkaç kez dikkatlice çizmek için seramik bir karonun kenarını kullanın. Bir elinize cam bir kılcal damar alın ve ince iğne kısmını tutmak için baş parmağınızı ve işaret parmağınızı kullanın. İğne künt bir şekilde kırılana kadar ortadan uca doğru çekin.
      NOT: Çalışmazsa veya iğne kenarlarından koparsa, birkaç kez tekrarlayın. Hala kırılmazsa, fayans çizme işlemini tekrarlayın. İğne kısmının çok ince olmadığından (>50 μm çapında) ve kolay bükülmediğinden emin olun.
7. Cam kılcal damarı Hamilton şırıngasına kapatın.
   1. Hamilton cam şırıngaya takılı künt metal iğnenin üzerine 1 cm'lik shrink makaron takın. Daha sonra cam kılcal damarın kalın ucunu Hamilton metal iğnenin üzerine koyun.
   2. Hamilton metal iğnesinin ucu ile kılcal damarın konik geçişi arasında en az 1 cm boşluk kalacak şekilde daralan makaronu cam kılcal damarın yarısına yerleştirin. Bu, daha sonra istenen enjekte edilebilir çözeltiyi tutan alan olacaktır.
   3. Çekme makaronunu ısıtmak ve enjeksiyon iğnesini kapatmak için bir çakmak veya kibrit kullanın.
      NOT: Hamilton şırıngasını soldaki stereotaksik kola sabitlemenize izin veren birkaç farklı tutucu seçeneği vardır. Hamilton şırıngasındaki numaraları hala okuyabildiğinizden emin olun. Solüsyonu enjekte etmek için bir pompa kullanıyorsanız, pompayı stereotaksik kola takın ve Hamilton şırıngasını pompaya sabitleyin.
8. Metal pistonu çıkarın. Hamilton şırıngasının üst kısmına salin veya PBS ile doldurulmuş 27 mL'lik bir şırıngaya bağlı 1G'lik bir iğne yerleştirin. Sızdırmaz olup olmadığını kontrol etmek ve tüm hava kabarcıklarını temizlemek için Hamilton şırıngasını PBS ile yıkayın.
   NOT: Hava kabarcıkları, hava sıvıdan daha fazla sıkıştırdığı için çözeltinizin alınmasını ve enjeksiyonunu bozacaktır.
9. Her şey kontrol edildikten ve hazır olduktan sonra, stereotaksik aletin z ekseni kolundaki (Şekil 1A 2.) küçük vidayı açın ve cam şırıngayı/kılcal damarı yoldan çekmek için kolu saat yönünde 90°'lik artışlarla döndürün (hayvanı stereotaksik alete sabitlerken kılcal damarın kırılmasını önlemek için).
   NOT: Tüm stereotax açılarının ve ayarlarının istenen parametrelere (normalde 0°) ayarlandığını, diş çubuğu ve kulak çubuklarının istenen koordinatlara ayarlandığını ve Hamilton şırınga/kılcal damarın düz olduğunu kontrol edin.
10. Stereotax platformundaki ısı yastığını açın, çok sıcaksa üstüne ek dolgu kullanın. Cerrahi alanın yanına ek bir ısı yastığı ile boş, temiz bir kafes yerleştirin.

2. Ameliyat (süre her hayvan başına ortalama 1 saat)

1. Gaz anestezisi için
   1. N₂ + O₂ hava akışı (yaklaşık 1 L / dak) ile izofluranı% 5'e getirin ve valfi inhalasyon odasına açın. Hayvanı hazneye yerleştirin ve iyice kapatıldığından emin olun. Solunumu önemli ölçüde yavaşlayana kadar gözlemleyin (derin nefes alma).
   2. Hayvan bilinçsiz hale geldiğinde, stereotaksik alete giden valfi açın ve hazne valfini kapatın. İzofluranı% 2'ye ayarlayın.
   3. Hazneyi açın ve boynundan tutarak hayvanı çıkarın, forseps ile ağzını açın ve hayvanı ön üst dişleri deliğe oturacak şekilde diş çubuğunun üzerine yerleştirin (Şekil 1A 6.).
      NOT: Hayvan izofluran solumayarak tekrar uyanabileceğinden bu adım zamana duyarlıdır.
   4. Burun konisini burnun üzerine yerleştirin ve zorla nefes almadan sabit bir ritim sağlamak için nefes almayı gözlemleyin. Devam etmeden önce arka ayakların pedal çekme reflekslerinin olmadığını kontrol ederek hayvanın derin bir şekilde uyuşturulduğundan emin olun.
      NOT: Hayvanın nefes almayı bırakmaması veya uyanmaması için prosedür boyunca kontrol etmeye devam edin. Gerekirse, izofluranın% 'sini küçük artışlarla ayarlayın. Arka ayakların pedal çekme refleksini test etmek için bir cımbız kullanın ve arka pençeyi sıkıştırın. Hayvan uzuvları geri çekerse (ağrı uyaranlarından kurtulma refleksi) anestezi çok düşüktür.
   5. İki kulak çubuğunu kullanarak hayvanın kafasını yerine sabitleyin (Şekil 1A 7.). Doğru yapıldığında, kulaklar kulak çubuklarının üzerinde yanlara doğru bakmalıdır. Kafa hala hareket ediyorsa, kafayı yerine daha sıkı sabitlemek için kulak çubuklarını veya burun konisini ayarlayın.
      NOT: Kulak çubuklarını çok derine sokarak hayvanların kulak zarlarını kırmaktan kaçınmak için nazik olun. Kulak çubuğu doğru şekilde yerleştirildiğinde fareler göz kırpma eğilimindedir.
2. Enjekte edilebilir anestezi için:
   1. Hayvana uygun / önerilen bir anestezi dozu i.p. (sıçanlar için 300 μg / kg fentanil ve 300 μg / kg medetomidin; fareler için 100 mg / kg ketamin ve 10 mg / kg ksilazin) ve tekrar ev kafesine yerleştirin.
   2. Enjeksiyondan 5 dakika sonra hayvanların pedal çekme reflekslerini kontrol edin. Yoksa, iki kulak çubuğunu kullanarak hayvanın başını yerine sabitleyin (Şekil 1A, 7.). Doğru yapıldığında, kulaklar kulak çubuklarının üzerinde yanlara doğru bakmalıdır. Daha sonra hayvanı diş çubuğunun üzerine yerleştirin (Şekil 1A 6.) ve kolu aşağı doğru vidalayın. Kafa hala hareket ediyorsa, kafayı yerine daha sıkı sabitlemek için kulak çubuklarını veya kol konisini ayarlayın.
      NOT: Kulak çubukları çok derine yerleştirildiğinde bir hayvanın kulak zarını kırmak mümkündür. Kolu çok sıkı vidalamayın. Hayvanların burnunu kırabilir.
   3. Pedal çekme refleksleri gözlenirse 5-10 dakika daha bekleyin. Hala gözlenirse, önceki anestezikten% 10 daha enjekte edin.
      NOT: Hayvanın boğulma nedeniyle ölümünü önlemek için anestezik dozu arada bir bekleme süresi ile yavaşça artırın.
   4. Diş çubuğu ve/veya kulak çubuğu yüksekliklerini ayarlayarak kafatasının düz olduğundan emin olun.
      NOT: Kafa açısını değiştireceğinden ve burun konisi/kolu hayvanların burnunu kırabileceğinden, çubukları ayarlarken dikkatli olun.
3. Ameliyat sırasında kurumasını önlemek için her göze göz damlası (örneğin Liquigel) damla damlası koyun. Hayvanın başını gözlerden kulaklara kadar tıraş edin.
4. Cerrahi alanı% 10 iyodopovidon kullanarak dezenfekte edin. Ek olarak, lokal anestezik enjekte edin (ör., in.% 0.5 lidokain) intradermal olarak insizyon bölgesinde. Devam etmeden önce etki etmesi için 2-3 dakika beklemeniz önerilir.
5. Neşteri kullanarak, gözlerin arasından kulakların arasına kadar sürekli bir kesi yapın.
   NOT: Boyun kaslarını kesmek iyileşmeyi zorlaştıracağından çok geriye doğru kesmemeye dikkat edin.
6. Yarayı açmak ve bölgeyi kandan temizlemek için pamuk uçlarını kullanın. Sıçanlar için, yarayı açık tutmak için hemostatik forsepsleri kullanın, onları deri altı dokuya sıkıştırarak ve her iki tarafa sarkmalarına izin vererek. Fareler için gerekirse mikro klipsler kullanın.
   NOT: Bu, işlemin en acı verici kısmıdır. Cilt yerine cilt altı dokusunun klemplenmesi iyileşmeyi artıracaktır.
7. Şırıngayı/kılcal damarı (Şekil 1A 1.), z ekseninde saat yönünün tersine 180° hareket ettirin (Şekil 1A 2.), ve hayvanın başının üzerine getirin. Ameliyat sırasında z ekseni kolunun sallanmaması için düğmeyi tamamen kapattığınızdan emin olun.
8. Cam kılcal damarın (Hamilton cam şırıngaya bağlı) kör ucunu hareket ettirmek için mikroskobu ve her stereotaksik kolun düğmelerini (Şekil 1A 3.-5.) kullanın; Şekil 1A 1.) Bregma'nın tam üstünde (kemiğe dokunmak ama bastırmamak). Dijital ekrandaki tüm değerleri sıfıra ayarlayın (Şekil 1A 8.).
   NOT: Bregma (Şekil 1B), parietal ve frontal kemiklerin sagital ve koronal sütürlerinin birleştiği noktadır. Bu başlangıç noktası olacaktır.
9. Mikroskoptan bakarak, kılcal damarın kör ucunu lambdanın tam üzerine hareket ettirin. Z ekseni (dorsal / ventral = DV) değeri +/- 0.1 mm içindeyse, hayvanın başı düzleştirilir. Daha yüksek veya daha düşükse, kafayı +/- 0.1 mm içine kadar uygun şekilde ayarlamak için diş çubuğunu kullanın.
   NOT: Lambda (Şekil 1B), parietal ve oksipital kemiklerin sagital ve koronal sütürlerinin birleştiği nokta olarak tanımlanır. Bu yöntem, kulak çubukları ayrı ayrı ayarlanabiliyorsa, kafatasının sol ve sağ tarafını düzleştirmek için de kullanılabilir. Çubukları ayarlarken dikkatli olun, çünkü kafa açısını değiştirecek ve burun konisi / kolu hayvanların burnunu kırabilir.
10. İstediğiniz hedef bölgenin koordinatlarını belirlemek için Allen beyin atlasını (Şekil 1C, D) kullanın. Şırıngayı/kılcal damarı doğru konuma hareket ettirmek için y ekseni (ön/arka = AP) ve x ekseni (medial/lateral = ML) kollarını kullanın.
    NOT: Boya enjeksiyonları (Şekil 2A-E), kullanılan hayvanların türü / yaşı için koordinatların doğru olduğundan emin olmak için ayrı hayvanlarda cerrahi prosedürlerden önce yapılmalıdır.
11. Mikroskoptan bakın ve kılcal damarın künt ucunun kemikle buluştuğu yerde dikkatlice bir delik açmaya hazırlanın. Başlamadan önce, delme sırasında hasar görmemesi için kılcal damarı y ekseninde yeterince yukarı hareket ettirin. Daha büyük bir daire içinde delmeye başlayın ve daha derine indikçe küçülün. Delme sırasında, sabit tutmak için elinizi bir kulak çubuğunun üzerine koyun.
    NOT: Beyin dokusuna kadar delmeyin. Duraya zarar vermemek için ince bir kemik tabakası bırakın. Bunun yerine, kalan ince kemik tabakasını dikkatlice çıkarmak için bir cımbız kullanın.
12. Mikroskobu kullanarak, iğnenin künt ucunun kemik parçaları tarafından yönlendirilmeden dura / beyin dokusuna temas edip etmediğini kontrol edin.
13. Enjeksiyon çözeltisinin kirlenmesini önlemek için şırıngayı / kılcal damarı temizleyin.
    1. Şırıngayı / kılcal damarı tamamen yukarı doğru hareket ettirin ve% 3 H₂O₂ içeren 1.5 mL tüpe batırın. Camdaki tüm kalıntıları ve kanı temizlediğinizden emin olun. Daha sonra, H_2O 2'yi yıkamak için kılcal damarı H₂O içeren 1.5 mL tüpe batırın.
    2. Metal pistonu Hamilton şırıngasından çıkarın ve şırınganın/kılcal damarın altına, hayvanın başının üstüne bir gazlı bez yerleştirin. Hamilton şırıngasını yıkamak için PBS ile doldurulmuş 1 mL şırıngayı, iğneyi üstüne sokarak ve PBS'yi dışarı fışkırtarak kullanın. Bundan sonra, metal pistonu Hamilton şırıngasına yerleştirin.
14. 1 μL hava çekin. Bu, Hamilton şırıngasındaki PBS'nin ve enjeksiyon çözeltisinin kılcal damarda karışmasını önleyecektir. Ardından istenen miktarda enjeksiyon çözeltisi hazırlayın. Fareler ve sıçanlar için sırasıyla tortu başına maksimum 1 μL ve 2 μL önerilir.
    NOT: Beyindeki basınç çok yükseleceği için yarım küre başına toplam 3 μL /6 μL aşılmamalıdır. Bir kalem kullanarak, çözeltinin menisküsünün olduğu yerde çok dikkatli bir şekilde küçük bir işaret yapılabilir. Bu işaret daha sonra çözeltinin beyne girip girmediğini ölçmek için bir referans noktası olarak kullanılabilir.
15. Sıçanlar için, dura'yı delmek için 25G'lik bir iğne kullanın. Kılcal damarı beyne istenen DV koordinatına yerleştirin. Şırıngayı/kılcal damarı amaçlanandan 0.1 mm daha derine hareket ettirin ve çözelti için yer açmak için geri çekin.
16. Çözeltiyi elle (10-15 saniyede 0.1 μL) veya bir pompa ile (0.4-0.6 μL / dak) enjekte edin. Solüsyonun tam olarak enjekte edildiğinden emin olmak için menisküsü kontrol edin.
    NOT: Solüsyon beyne girmezse, şırıngayı/kılcal damarı 0,2 mm yukarı ve aşağı hareket ettirin. Hala enjekte etmiyorsa, 2.13-2.14 adımlarını tekrarlayın. Büyük olasılıkla iğne beyin dokusu kalıntıları ile tıkanmıştır.
17. Enjekte edilen solüsyonun dağılmasını ve basıncın düşmesini sağlamak için şırıngayı/kılcal damarı 5 dakika daha yerinde tutun. Bu bekleme süresi boyunca analjezik enjekte edin ve gerekirse hayvanı işaretleyin.
18. Şırıngayı/kılcal damarı 0.2 mm yukarı hareket ettirin ve 2 dakika daha yerinde tutun. Negatif basınç nedeniyle enjekte edilen herhangi bir çözeltiyi çekmemek için şırıngayı/iğneyi çok yavaş bir şekilde dışarı çekin.
19. Şırınga/kılcal damar beyinden çıktıktan sonra, dokunun kurumasını ve kılcal damarın tıkanmasını önlemek için adım 2.13'te anlatıldığı gibi temizleyin.
20. Daha fazla beyin bölgesi enjekte etmeye devam edin veya ameliyatı bitirin.
21. Yarayı kapatırken kırılmayı önlemek için şırınga iğnesini z ekseni üzerinde 180° çevirerek kenara çekin. Daha sonra yarayı klips, doku yapıştırıcısı veya dikişlerle kapatın. Enjekte edilebilir anestezi kullanılmışsa, hayvana panzehir enjekte edin.
    NOT: Tek başına barındırılmayan hayvanlar birbirlerinin kafasını temizleme ve muhtemelen klipsleri, yapıştırıcıları veya dikişleri çıkarma eğilimindedir.
22. Hayvanı stereotaksik çerçeveden çıkarın ve ısı yastığının üstündeki temiz kafese yerleştirin. Komplikasyon olmadan uyandığından emin olmak için hayvanı izleyin. İlk 24 saat boyunca yiyecek ve suya kolay erişim sağlayın.

3. Ameliyat sonrası bakım (süre 3-7 gün)

1. Uygun iyileşmeyi sağlamak için önümüzdeki 2-3 gün içinde (toksik madde enjeksiyonu için 10 güne kadar) hayvanın ağırlığını (% 10 kilo kaybı kabul edilebilir), kürkünü, dışkısını ve yiyecek / su alımını kontrol edin. Gerekirse, hayvanı izole edin ve hayvanlarda ek sistemik sorunlar olabileceğinden, bazı toksik madde enjeksiyonları için gerekli olan ıslak yiyecek, salin enjeksiyonları ve bir ısıtma yastığı sağlayın.
2. Yerel düzenlemelere göre ağrının giderilmesini sağlamak için ameliyattan sonra hayvanlara 1-2 gün daha analjezik enjekte edin. Dikişler, klipsler veya yapıştırıcı kendi kendine çıkmazsa, hayvanı uyuşturmak için izofluran kullanın ve ameliyattan 1 hafta sonra dikişleri, klipsleri veya yapıştırıcıyı çıkarın.

Sonuçlar

Yanlış hedeflemeyi önlemek için, her deneyden önce boya enjeksiyonları kullanarak koordinatları doğrulayın. Hayvanlara aynı protokol kullanılarak 0.2-0.5 μL triptofan mavisi enjekte edildi, enjeksiyondan sonra kılcal damar hızla geri çekildi ve difüzyonu önlemek için beyin hızla donduruldu. Mikrotom üzerinde kesit alındıktan sonra, enjeksiyon bölgesi mavi renkte görülebilir (Şekil 2 C,E). Etkili hedeflemeyi sağlama...

Tartışmalar

Stereotaksik enjeksiyon, herhangi bir cerrahi prosedür gibi, hayvanın refahını ve hayatta kalmasını garanti altına almak için temel zorluğa sahiptir. Bu nedenle, prosedür boyunca hayvanı yakından izlemek önemlidir. Solunum düzensizlikleri, solunum kaybı veya reflekslerin ve hareketlerin yeniden ortaya çıkması, özellikle deneyimsiz cerrahlar için ana odak noktası olmalıdır. Ek olarak, analjeziklerin uygulanması iyileşme sürecine yardımcı olmak için çok öneml...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Allen brain atlas	Allen Institute	mouse brain - reference atlas
analgesic: ketoprofin OR buprenorphine
anesthetic: Isoflurane OR ketamine / xylazine OR fentanyl / medetomidine
blades - surgical sterile	Oasis Medical	No 10
capillaries - glass	Stoelting	50811
capillary puller	Sutter Instruments	P-97
cotton-tipped applicators	Stoelting	50975
drill - dental	Foredom	MH-170
Ethanol 70%
eye drops (Liquigel)	CVS	NDC 0023-9205-02	Carboxymethylcellulose Sodium (1%), Boric acid; calcium chloride; magnesium chloride; potassium chloride; purified water; PURITE® (stabilized oxychloro complex); sodium borate; and sodium chloride
forceps - full curved	Stoelting	52102-38P
forceps - hemostatic delicate	Stoelting	52110-13
gauze - cotton absorbent
H2O - sterile
H2O2 30%	Sigma Aldrich	216763
Hamilton 5ul syringe	Hamilton Company	7634-01
Hamilton blunt metal needle	Hamilton Company	7770-01
heat pad - far infrared	Kent Scientific	2665967
Iodine solution (Dynarex) 10%	Indemedical	102538
isoflurane	Baxter	1001936040
lidocaine 0.5%
lighter / matches
microscope (Stemi 508 Boom stand)	Zeiss	435064-9000-000
PBS sterile	Gibco - Thermo Fischer	10010-023
pump (injector)	Stoelting	53311
scalpel handle	Stoelting	52171P
shaver - electrical	andis	64800
solution to inject / material to implant
stereotax - small animal digital	Kopf	Model 940
sterilizer - glass bead	BT Lab Systems	BT1703
tubing - heat-shrink	Nelco	NP221-3/64
tweezers - dumont fine curved	Roboz	RS-5045A
underpad - absorbent
vaporizer for isoflurane (package)	Scivena Scientific	M3000
wound clips and applier / remover	Stoelting	59040
wound glue (Vetbond)	3M corporation	1469SB