Administration intracrânienne stéréotaxique de produits chimiques, de protéines ou de vecteurs viraux pour étudier la maladie de Parkinson

Résumé

Nous décrivons comment injecter avec succès des solutions dans des zones spécifiques du cerveau de rongeurs à l’aide d’un cadre stéréotaxique. Cette chirurgie de survie est une méthode bien établie utilisée pour imiter divers aspects de la maladie de Parkinson.

Résumé

La maladie de Parkinson (MP) est un trouble progressif traditionnellement défini par des tremblements au repos et une akinésie, principalement due à la perte de neurones dopaminergiques dans la substance noire. Les zones cérébrales touchées présentent des inclusions fibrillaires intraneuronales constituées principalement de protéines alpha-synucléine (asyne). Aucun modèle animal n’a jusqu’à présent récapitulé toutes les caractéristiques de cette maladie. Ici, nous décrivons l’utilisation de l’injection stéréotaxique pour administrer des produits chimiques, des protéines ou des vecteurs viraux par voie intracrânienne afin d’imiter divers aspects de la MP. Ces méthodes sont bien établies et largement utilisées dans le domaine de la DP. Les injections stéréotaxiques sont incroyablement flexibles ; Ils peuvent être ajustés en termes de concentration, d’âge de l’animal utilisé pour l’injection, de zone cérébrale ciblée et d’espèces animales utilisées. Les combinaisons de substances permettent des variations rapides pour évaluer les traitements ou modifier la gravité de la pathologie ou les déficits comportementaux. En injectant des toxines dans le cerveau, nous pouvons imiter l’inflammation et/ou une perte sévère de neurones dopaminergiques, ce qui entraîne des phénotypes moteurs substantiels. Les vecteurs viraux peuvent être utilisés pour transduire des cellules afin d’imiter des aspects génétiques ou mécanistes. Les injections asyniques fibrillaires préformées récapitulent le mieux le phénotype progressif sur une longue période de temps. Une fois ces méthodes établies, il peut être économique de générer un nouveau modèle par rapport à la création d’une nouvelle lignée transgénique. Cependant, cette méthode demande beaucoup de main-d’œuvre car elle nécessite de 30 minutes à quatre heures par animal selon le modèle utilisé. Chaque animal aura un ciblage légèrement différent et créera donc une cohorte diversifiée qui, d’une part, peut être difficile à interpréter ; D’autre part, aider à imiter une diversité plus réaliste trouvée chez les patients. Les animaux mal ciblés peuvent être identifiés à l’aide de lectures comportementales ou d’imagerie, ou seulement après avoir été sacrifiés, ce qui conduit à une cohorte plus petite une fois l’étude terminée. Dans l’ensemble, cette méthode est un moyen rudimentaire mais efficace d’évaluer un ensemble diversifié d’aspects de la MP.

Introduction

La maladie de Parkinson (MP) est une maladie neurodégénérative progressive relativement courante qui touche jusqu’à 1 % des personnes de plus de 60 ans¹. La MP est hétérogène mais cliniquement caractérisée principalement par des symptômes moteurs tels que le tremblement au repos, la bradykinésie, l’akinésie, la rigidité, les troubles de la marche et l’instabilité posturale. La majorité des symptômes moteurs apparaissent généralement lorsque 60 à 70 % de la dopamine striatale (DA) est perdue à la suite d’une neurodégénérescence progressive et distincte de la substance noire (SN) pars compacta ^2,3. Les neurones dopaminergiques survivants contiennent des inclusions intracellulaires connues sous le nom de corps de Lewy⁴. Ces agrégats sont principalement constitués d’alpha-synucléine (asyn), une protéine petite mais fortement exprimée dans les neurones du cerveau⁵.

Le mécanisme sous-jacent de la neurodégénérescence dans la MP est encore inconnu. Le vieillissement reste le plus grand facteur de risque de ce trouble⁶. De plus, les humains sont la seule espèce qui développe naturellement la MP. Par conséquent, afin d’étudier la pathologie de la MP et de tester de nouveaux médicaments pour prévenir la progression de la maladie, un large éventail de modèles animaux ont été développés⁷. Idéalement, les modèles animaux de la MP devraient présenter une perte progressive de neurones DA dans le SN en fonction de l’âge, accompagnée d’inclusions intracellulaires suivies d’un dysfonctionnement moteur, et être sensibles aux thérapies de remplacement de la DA. Aucun des modèles animaux actuellement disponibles ne récapitule complètement tous les symptômes cliniques et la pathologie de la MP. Comme chaque modèle présente différents aspects de la maladie, il est important d’examiner attentivement le modèle approprié à utiliser dans une expérience en fonction des questions posées.

Historiquement, les modèles animaux étaient basés sur des substances toxiques, notamment la 6-hydroxydopamine (6-OHDA) et la 1-méthyl-4-phényl-1,2,3,6-tétrahydropyridine (MPTP), et des pesticides, tels que la roténone et le paraquat⁸. Chaque toxique a un mécanisme d’action différent et va d’un neurone DA spécifique à généralement nocif pour les cellules cérébrales. Les toxines peuvent être administrées par voie orale, injectées par voie intrapéritonéale ou directement dans le cerveau à l’aide d’injections stéréotaxiques en fonction de la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique. Contrairement à d’autres modèles, les modèles de toxines garantissent un degré élevé de perte de cellules dopaminergiques nigrostriatales et de phénotypes comportementaux. Certains modèles peuvent même présenter une pathologie subtile. Ces caractéristiques font des modèles de DP de toxines un excellent outil pour étudier les thérapies de remplacement et les effets des toxines environnementales sur l’apparition de ^9,10.

De plus, de nombreux modèles de souris transgéniques ont été générés à l’aide d’une variété de promoteurs et de gènes liés à la MP¹¹. La plupart des souris présentent une pathologie nigrostriatale mais sans signe clair de neurodégénérescence. Les modèles transgéniques ont l’avantage d’être cohérents entre les animaux et les cohortes et, une fois générés, ils sont faciles à maintenir et à distribuer. Bien qu’ils n’entraînent pas de neurodégénérescence, ils constituent néanmoins des modèles utiles pour étudier les changements cellulaires causés par des variantes génétiques et d’éventuels candidats médicaments dans un système in vivo complexe¹².

Contrairement aux modèles transgéniques, l’expression des gènes liés à la MP par vecteur viral offre une approche plus souple¹³. Les injections stéréotaxiques permettent de choisir diverses zones du cerveau, types de cellules et niveaux d’expression pour un large éventail d’espèces animales telles que les souris, les rats, les porcs et les primates non humains. Initialement, des vecteurs viraux recombinants codant pour asyn ont été utilisés pour transduire les neurones situés dans le SN du rat. L’accumulation de protéines et le dysfonctionnement cellulaire précèdent la perte progressive de cellules dopaminergiques entraînant un déficit comportemental. Les différences de ciblage peuvent entraîner une grande variation de la perte de cellules entre les animaux (30 à 80 %), ce qui est responsable de déficits comportementaux variables observés chez seulement environ 25 % des rats injectés¹⁴.

Un modèle récemment établi est l’injection intracrânienne de fibrilles asyniques préformées (PFF) ou d’extraits agrégés de tissu cérébral de souris ou de patient^15,16. De multiples études indiquent que l’injection de PFF ou d’extraits entraîne une pathologie asynique largement répandue dans le cerveau animal ainsi qu’une perte de neurones dopaminergiques dans le SN. L’accumulation d’asyn apparaît dans les neurones, innervant la zone injectée. Contrairement aux modèles à vecteurs viraux, le modèle PFF se développe lentement sur plusieurs mois suivi de déficits moteurs à 6 mois. Ce modèle a un grand potentiel pour étudier le mécanisme ou la prévention de la pathologie asynique^17,18.

Tous les modèles mentionnés ci-dessus ont été bien établis et utilisés à de nombreuses reprises pour étudier divers aspects du désordre humain. Les injections stéréotaxiques de substances directement dans le cerveau ont joué un rôle important dans le développement de ces modèles animaux, non seulement dans le domaine de la MP, mais aussi dans d’autres troubles neurologiques. Bien qu’elle demande beaucoup de main-d’œuvre, la chirurgie stéréotaxique présente l’avantage d’être très flexible en termes d’âge des animaux utilisés, de région du cerveau ciblée et de substance injectée, et peut être ajustée en fonction de la question de recherche posée. Par exemple, les substances peuvent être injectées seules ou en combinaison (vecteur + fibrilles ou toxique + vecteur) pour récapituler davantage d’aspects de la maladie ou évaluer les traitements^19,20. De plus, des substances peuvent être injectées unilatéralement, laissant le côté non injecté comme contrôle interne pour évaluer le comportement ainsi que la neurodégénérescence. Par conséquent, ce manuscrit décrira en détail les étapes à suivre pour générer des modèles de DP à l’aide d’injections stéréotaxiques.

Protocole

Toutes les expériences de cette étude ont été menées en stricte conformité avec les recommandations du Guide for the Care and Use of Laboratory Animals des National Institutes of Health et approuvées par les comités de protection et d’utilisation des animaux du National Institute on Aging des États-Unis.

Avant de commencer, assurez-vous d’avoir acquis la formation appropriée et l’approbation éthique de votre institut nécessaire pour effectuer cette procédure. De plus, les anesthésiques (p. ex., kétamine et buprénorphine, ou fentanyl et médétomidine) utilisés doivent être acquis et manipulés conformément aux règles pertinentes de votre établissement.

1. Préparation (durée 1 heure)

1. Amenez les animaux dans la salle d’opération et laissez-les s’acclimater pendant la mise en place de la zone chirurgicale. Mettez un équipement de protection individuelle (EPI) approprié.
   REMARQUE : Cela peut dépendre des réglementations de sécurité locales et de la substance injectée. Les vecteurs viraux ont principalement besoin d’un EPI de biosécurité de niveau 2. En règle générale, portez au moins un masque, des gants et une blouse de laboratoire jetable. Dans des circonstances spécifiques, des gants et des lunettes supplémentaires doivent être utilisés.
2. Stérilisez les outils chirurgicaux à l’aide d’un autoclave ou d’un stérilisateur à billes de verre. Pour les rongeurs, vous avez besoin d’un manche de scalpel, d’une pince hémostatique, d’une pince Dumont, d’une pince incurvée, d’un kit de fermeture de plaie (clips) ou de ciseaux et de pinces (pour les sutures) et d’une tête de forage.
3. Désinfectez la zone chirurgicale et l’instrument stéréotaxique avec de l’éthanol à 70 %, et couvrez la zone à côté de l’instrument stéréotaxique avec des serviettes en papier propres ou une feuille absorbante stérile.
4. Placez les éléments suivants sur des serviettes : gouttes ophtalmiques (p. ex. Liquigel), tondeuse à cheveux, cotons-tiges, iodixanol dilué, lame chirurgicale jetable, foret chirurgical avec foret désinfecté, marqueur ou coupe-oreilles,_H2O stérile dans un tube de 1,5 mL, tube de 1,5 mL avec 3 % de H₂O₂ dans du H₂O stérile (1,35 mL de H₂O + 0,15 mL de 30 % H₂O_2, fraîchement préparée), une seringue de 1 mL avec une aiguille 33G et du PBS stérile ou une solution saline, une seringue avec un analgésique et un antidote si une anesthésie injectable est utilisée (p. ex., atipamézole + buprénorphine/kétoprofène ; fraîchement préparée et approuvée dans le permis éthique) et des outils chirurgicaux autoclavés.
5. Faites le plein d’isoflurane et vérifiez les pressions O₂ et N₂ , si vous utilisez une anesthésie gazeuse. Ajoutez une serviette en papier au fond de la chambre d’inhalation pour la garder sèche et propre.
   Mélangez et préparez fraîchement l’anesthésique (p. ex., fentanyl + médétomidine (pour les rats) ou solution de kétamine + xylazine (pour les souris)) si vous utilisez un anesthésique injectable et si le permis éthique l’approuve.
6. Assemblez la seringue en verre Hamilton et le capillaire en verre (Figure 1A 1.).
   1. Placez le capillaire en verre tiré sur la table. Placez votre index là où le capillaire s’amincit avec l’extrémité de l’ongle où le capillaire doit être coupé.
      REMARQUE : Selon la profondeur de votre injection, n’importe où entre 0,5 et 2 cm.
   2. Utilisez le bord d’un carreau de céramique pour gratter soigneusement la partie de l’aiguille à quelques reprises. Prenez un capillaire en verre dans une main et utilisez votre pouce et votre index pour saisir la partie fine de l’aiguille. Tirez du milieu à l’extrémité jusqu’à ce que l’aiguille se brise brusquement.
      REMARQUE : Si cela ne fonctionne pas ou si l’aiguille se casse sur le bord, répétez plusieurs fois. S’il ne se casse toujours pas, répétez le grattage des carreaux. Assurez-vous que la partie de l’aiguille n’est pas trop fine (>50 μm de diamètre) et qu’elle ne se plie pas facilement.
7. Scellez le capillaire en verre sur la seringue Hamilton.
   1. Fixez une gaine thermorétractable de 1 cm sur l’aiguille métallique émoussée fixée à la seringue en verre Hamilton. Ensuite, placez l’extrémité épaisse du capillaire en verre sur l’aiguille métallique Hamilton.
   2. Placez la gaine rétractable sur la moitié du capillaire de verre, en veillant à ce qu’il y ait un espace d’au moins 1 cm entre l’extrémité de l’aiguille métallique Hamilton et la transition conique du capillaire. Ce sera l’espace contenant la solution injectable souhaitée plus tard.
   3. Utilisez un briquet ou une allumette pour chauffer la gaine thermorétractable et sceller l’aiguille d’injection.
      REMARQUE : Il existe plusieurs options de support différentes qui vous permettent de fixer la seringue Hamilton au bras stéréotaxique sur la gauche. Assurez-vous que vous pouvez toujours lire les chiffres sur la seringue Hamilton. Si vous utilisez une pompe pour injecter la solution, fixez la pompe au bras stéréotaxique et fixez la seringue Hamilton sur la pompe.
8. Retirez le piston métallique. Insérez une aiguille de 27 G attachée à une seringue de 1 mL remplie de solution saline ou de PBS sur la partie supérieure de la seringue Hamilton. Rincez la seringue Hamilton avec du PBS pour vérifier si elle est scellée et pour éliminer toutes les bulles d’air.
   REMARQUE : Les bulles d’air perturberont votre absorption et l’injection de votre solution car l’air se comprime plus que le liquide.
9. Une fois que tout est vérifié et prêt, ouvrez la petite vis sur le bras de l’axe z (Figure 1A 2.) de l’instrument stéréotaxique et tournez le bras par incréments de 90° dans le sens des aiguilles d’une montre pour écarter la seringue en verre/le capillaire (pour éviter que le capillaire ne se brise pendant la fixation de l’animal à l’instrument stéréotaxique).
   REMARQUE : Vérifiez que tous les angles et paramètres stéréoélectriques sont réglés sur les paramètres souhaités (normalement 0°), que la barre dentaire et les barres d’oreille sont réglées sur les coordonnées souhaitées et que la seringue/capillaire Hamilton sont toutes droites.
10. Allumez le coussin chauffant sur la plate-forme stéréotaxe, en utilisant un rembourrage supplémentaire sur le dessus s’il fait trop chaud. Placez une cage vide et propre avec un coussin chauffant supplémentaire à côté de la zone chirurgicale.

2. Chirurgie (durée moyenne 1 heure par animal)

1. Pour l’anesthésie gazeuse
   1. Allumez l’isoflurane à 5 % avec un débit d’air N₂ + O₂ (environ 1 L/min) et ouvrez la valve de la chambre d’inhalation. Placez l’animal dans la chambre et assurez-vous qu’elle est bien scellée. Observez la respiration jusqu’à ce qu’elle ait considérablement ralenti (respiration profonde).
   2. Une fois que l’animal est inconscient, ouvrez la valve de l’instrument stéréotaxique et fermez la valve de la chambre. Réglez l’isoflurane à 2 %.
   3. Ouvrez la chambre et sortez l’animal qui le tient par le cou, ouvrez sa bouche avec la pince et placez l’animal sur la barre de dent (Figure 1A 6.) avec les dents supérieures de devant insérées dans le trou.
      REMARQUE : Cette étape est sensible au temps, car l’animal peut se réveiller à nouveau en ne respirant pas d’isoflurane.
   4. Placez le cône nasal sur le museau et observez la respiration pour assurer un rythme régulier sans respiration forcée. Assurez-vous que l’animal est profondément anesthésié en vérifiant l’absence des réflexes de retrait de la pédale des membres postérieurs avant de procéder.
      REMARQUE : Continuez à vérifier tout au long de la procédure afin que l’animal n’arrête pas de respirer ou ne se réveille pas. Si nécessaire, ajustez le % d’isoflurane par petits incréments. Pour tester le réflexe de retrait de la pédale des membres postérieurs, utilisez une pince à épiler et pincez la patte arrière. Si l’animal rétracte le membre (réflexe pour retirer des stimuli de la douleur), l’anesthésie est trop basse.
   5. Fixez la tête de l’animal en place à l’aide des deux barres d’oreille (Figure 1A 7.). Lorsque cela est fait correctement, les oreilles doivent être pointées latéralement au-dessus des barres d’oreille. Si la tête bouge toujours, ajustez les barres d’oreille ou le cône de nez pour fixer la tête plus fermement en place.
      REMARQUE : Soyez douxpour éviter de casser les tympans des animaux en insérant les barres d’oreille trop profondément. Les rats ont tendance à cligner des yeux lorsque la barre d’oreille est correctement insérée.
2. Pour l’anesthésie injectable :
   1. Injectez à l’animal une dose appropriée / recommandée d’anesthésie i.p. (300 μg/kg de fentanyl et 300 μg/kg de médétomidine pour les rats ; 100 mg/kg de kétamine et 10 mg/kg de xylazine pour les souris) et remettez-le dans la cage domestique.
   2. Vérifiez les réflexes de sevrage de la pédale des animaux 5 minutes après l’injection. En cas d’absence, fixez la tête de l’animal en place à l’aide des deux barres d’oreille (Figure 1A 7.). Lorsque cela est fait correctement, les oreilles doivent être pointées latéralement au-dessus des barres d’oreille. Ensuite, placez l’animal sur la barre dentée (Figure 1A 6.) et vissez le levier. Si la tête est toujours en mouvement, ajustez les barres d’oreille ou le cône du levier pour fixer la tête plus fermement en place.
      REMARQUE : Il est possible de briser le tympan d’un animal lorsque les barres d’oreille sont insérées trop profondément. Ne vissez pas trop fort le levier. Il peut casser le nez des animaux.
   3. Si les réflexes de retrait de la pédale sont observés, attendez encore 5 à 10 min. Si vous observez toujours, injectez 10 % de l’anesthésique précédent.
      REMARQUE : Augmentez lentement la dose d’anesthésique avec une période d’attente entre les deux pour éviter la mort de l’animal par asphyxie.
   4. Assurez-vous que le crâne est plat en ajustant la hauteur de la barre de dent et/ou de la barre d’oreille.
      REMARQUE : Soyez prudent lors du réglage des barres car la tête changera d’angle et le cône/levier de nez peut casser le nez de l’animal.
3. Mettez des gouttes ophtalmiques sur chaque œil (par ex. Liquigel) pour éviter qu’ils ne se dessèchent pendant la chirurgie. Rasez la tête de l’animal des yeux aux oreilles.
4. Désinfectez la zone chirurgicale avec de l’iodopovidone à 10 %. De plus, injectez un anesthésique local (par exemple, 0,5 % de lidocaïne) par voie intradermique au site de l’incision. Il est recommandé d’attendre 2-3 min qu’il agisse avant de continuer.
5. À l’aide du scalpel, faites une incision continue entre les yeux jusqu’entre les oreilles.
   REMARQUE : Attention à ne pas couper trop en arrière car couper les muscles du cou compliquera la récupération.
6. Utilisez les cotons-tiges pour ouvrir la plaie et nettoyer la zone du sang. Pour les rats, utilisez la pince hémostatique pour maintenir la plaie ouverte, en les serrant dans le tissu sous-cutané et en les laissant pendre de chaque côté. Pour les souris, si nécessaire, utilisez des micro-clips.
   REMARQUE : C’est la partie la plus douloureuse de la procédure. Clamper le tissu sous-cutané au lieu de la peau augmentera la cicatrisation.
7. Déplacez la seringue/capillaire (Figure 1A 1.) de 180° dans le sens inverse des aiguilles d’une montre sur l’axe z (Figure 1A 2.) et amenez-la au-dessus de la tête de l’animal. Assurez-vous de fermer complètement le bouton afin que le bras de l’axe z ne vacille pas pendant l’opération.
8. À l’aide du microscope et des boutons de chaque bras stéréotaxique (figure 1A, 3.-5), on peut déplacer l’extrémité émoussée du capillaire en verre (fixé à la seringue en verre Hamilton ; Figure 1A 1.) Juste au-dessus du bregma (en touchant mais sans appuyer sur l’os). Réglez toutes les valeurs sur l’affichage numérique sur zéro (Figure 1A 8.).
   REMARQUE : Bregma (Figure 1B) est le point de rencontre des sutures sagittales et coronales des os pariétals et frontaux. Ce sera le point d’origine.
9. En regardant à travers le microscope, déplacez l’extrémité émoussée du capillaire vers la droite au-dessus du lambda. Si la valeur de l’axe z (dorsale/ventrale = DV) est inférieure à +/-0,1 mm, la tête de l’animal est nivelée. S’il est plus haut ou plus bas, utilisez la barre de dent pour ajuster la tête en conséquence jusqu’à +/- 0,1 mm.
   REMARQUE : Le lambda (Figure 1B) est défini comme le point où les sutures sagittales et coronales des os pariétal et occipital se rencontrent. Cette méthode pourrait également être utilisée pour niveler les côtés gauche et droit du crâne si les barres d’oreille peuvent être ajustées individuellement. Soyez prudent lors de l’ajustement des barres car la tête changera d’angle et le cône / levier du nez peut casser le nez de l’animal.
10. Utilisez l’atlas cérébral Allen (figures 1C, D) pour identifier les coordonnées de la région cible souhaitée. Utilisez les bras de l’axe des y (antérieur/postérieur = AP) et de l’axe des x (médial/latéral = ML) pour déplacer la seringue/le capillaire dans la bonne position.
    REMARQUE : Les injections de colorant (figure 2A-E) doivent être effectuées avant les interventions chirurgicales sur des animaux distincts afin de s’assurer que les coordonnées sont correctes pour la souche et l’âge des animaux utilisés.
11. Regardez au microscope et préparez-vous à percer soigneusement un trou à l’endroit où l’extrémité émoussée du capillaire rencontre l’os. Avant de commencer, déplacez le capillaire suffisamment vers le haut sur l’axe des y pour qu’il ne soit pas endommagé pendant le perçage. Commencez à forer dans un cercle plus grand et réduisez au fur et à mesure que vous creusez plus profondément. Pendant l’exercice, posez la main sur une barre d’oreille pour la maintenir stable.
    REMARQUE : Ne percez pas jusqu’au tissu cérébral. Laissez une fine couche d’os pour éviter d’endommager la dure-mère. Utilisez plutôt une pince à épiler pour retirer soigneusement la fine couche d’os restante.
12. À l’aide du microscope, vérifiez que l’extrémité émoussée de l’aiguille peut toucher la dure-mère / tissu cérébral sans être déviée par des morceaux d’os.
13. Nettoyez la seringue / capillaire pour éviter la contamination de la solution d’injection.
    1. Déplacez la seringue/capillaire jusqu’en haut et trempez-la dans le tube de 1,5 mL contenant 3 % de H₂O₂. Assurez-vous d’enlever tous les débris et le sang du verre. Ensuite, trempez le capillaire dans le tube de 1,5 mL contenant_H2O pour laver le H₂O₂.
    2. Retirez le piston métallique de la seringue Hamilton et placez une gaze sous la seringue/capillaire, sur le dessus de la tête de l’animal. Utilisez la seringue de 1 ml remplie de PBS pour laver la seringue Hamilton en insérant l’aiguille dans le haut et en faisant jaillir du PBS. Après cela, insérez le piston métallique dans la seringue Hamilton.
14. Aspirez 1 μL d’air. Cela empêchera le PBS dans la seringue Hamilton et la solution d’injection de se mélanger dans le capillaire. Prélevez ensuite la quantité souhaitée de solution injectable. Un maximum de 1 μL et 2 μL par dépôt est recommandé pour les souris et les rats respectivement.
    REMARQUE : Un total de 3 μL / 6 μL par hémisphère ne doit pas être dépassé car la pression dans le cerveau augmentera trop. À l’aide d’un stylo, une petite marque peut être faite très soigneusement à l’endroit où se trouve le ménisque de la solution. Cette marque peut ensuite être utilisée comme point de référence pour évaluer si la solution pénètre dans le cerveau.
15. Pour les rats, utilisez une aiguille 25G pour percer la dure-mère. Insérez le capillaire dans le cerveau à la coordonnée DV souhaitée. Déplacez la seringue/le capillaire de 0,1 mm plus profondément que prévu et tirez vers le haut pour faire de la place pour la solution.
16. Injecter la solution à la main (0,1 μL par 10-15 sec) ou à l’aide d’une pompe (0,4-0,6 μL/min). Vérifiez le ménisque pour vous assurer que la solution est complètement injectée.
    REMARQUE : Si la solution ne se déplace pas dans le cerveau, déplacez la seringue/le capillaire de haut en bas de 0,2 mm. S’il n’injecte toujours pas, répétez les étapes 2.13-2.14. Il est fort probable que l’aiguille soit obstruée par des débris de tissu cérébral.
17. Maintenez la seringue/le capillaire en place pendant encore 5 minutes pour laisser la solution injectée se répartir et la pression diminuer. Pendant cette période d’attente, injectez l’analgésique et marquez l’animal si nécessaire.
18. Déplacez la seringue/capillaire vers le haut de 0,2 mm et maintenez-la en place pendant encore 2 min. Tirez la seringue/l’aiguille très lentement pour éviter de tirer vers le haut toute solution injectée en raison de la pression négative.
19. Une fois que la seringue ou le capillaire est sorti du cerveau, nettoyez-le comme décrit à l’étape 2.13 pour éviter que les tissus ne se dessèchent et n’obstruent le capillaire.
20. Continuez à injecter plus de zones cérébrales ou terminez la chirurgie.
21. Écartez l’aiguille de la seringue en la tournant de 180° sur l’axe z pour éviter de la casser tout en refermant la plaie. Ensuite, fermez la plaie avec des clips, de la colle tissulaire ou des sutures. Si une anesthésie injectable a été utilisée, injectez l’antidote à l’animal.
    REMARQUE : Les animaux qui ne sont pas logés individuellement ont tendance à se nettoyer la tête et éventuellement à retirer les pinces, la colle ou les points de suture.
22. Retirez l’animal du cadre stéréotaxique et placez-le dans la cage propre sur le dessus du coussin chauffant. Surveillez l’animal pour vous assurer qu’il se réveille sans complications. Fournir un accès facile à la nourriture et à l’eau pendant les premières 24 heures.

3. Soins post-opératoires (durée 3-7 jours)

1. Vérifiez le poids (une perte de poids de 10 % est acceptable), la fourrure, les excréments et la consommation de nourriture et d’eau de l’animal au cours des 2 à 3 prochains jours (jusqu’à 10 jours pour l’injection de substances toxiques) pour assurer une bonne récupération. Si nécessaire, isolez l’animal et fournissez-lui de la nourriture humide, des injections de solution saline et un coussin chauffant, essentiels pour certaines injections de substances toxiques, car les animaux pourraient avoir des problèmes systémiques supplémentaires.
2. Injectez un analgésique aux animaux pendant 1 à 2 jours supplémentaires après l’opération pour assurer un soulagement de la douleur conformément aux réglementations locales. Si les sutures, les clips ou la colle ne se détachent pas d’eux-mêmes, utilisez de l’isoflurane pour anesthésier l’animal et retirez les sutures, les clips ou la colle 1 semaine après l’opération.

Résultats

Pour éviter les erreurs de ciblage, avant chaque expérience, vérifiez les coordonnées à l’aide d’injections de colorant. Des animaux ont reçu une injection de bleu de tryptophane de 0,2 à 0,5 μL en utilisant le même protocole, le capillaire a été rapidement retiré après l’injection et le cerveau a été rapidement congelé pour éviter la diffusion. Après coupe sur le microtome, le site d’injection est visible en bleu (Figure 2 ...

Discussion

L’injection stéréotaxique, comme toute intervention chirurgicale, présente la principale difficulté pour garantir le bien-être et la survie de l’animal. Par conséquent, il est essentiel de surveiller de près l’animal tout au long de la procédure. La recherche d’irrégularités respiratoires, de perte de respiration ou de récurrence des réflexes et des mouvements doit être l’objectif principal, en particulier pour les chirurgiens inexpérimentés. De plus, l’applica...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Allen brain atlas	Allen Institute	mouse brain - reference atlas
analgesic: ketoprofin OR buprenorphine
anesthetic: Isoflurane OR ketamine / xylazine OR fentanyl / medetomidine
blades - surgical sterile	Oasis Medical	No 10
capillaries - glass	Stoelting	50811
capillary puller	Sutter Instruments	P-97
cotton-tipped applicators	Stoelting	50975
drill - dental	Foredom	MH-170
Ethanol 70%
eye drops (Liquigel)	CVS	NDC 0023-9205-02	Carboxymethylcellulose Sodium (1%), Boric acid; calcium chloride; magnesium chloride; potassium chloride; purified water; PURITE® (stabilized oxychloro complex); sodium borate; and sodium chloride
forceps - full curved	Stoelting	52102-38P
forceps - hemostatic delicate	Stoelting	52110-13
gauze - cotton absorbent
H2O - sterile
H2O2 30%	Sigma Aldrich	216763
Hamilton 5ul syringe	Hamilton Company	7634-01
Hamilton blunt metal needle	Hamilton Company	7770-01
heat pad - far infrared	Kent Scientific	2665967
Iodine solution (Dynarex) 10%	Indemedical	102538
isoflurane	Baxter	1001936040
lidocaine 0.5%
lighter / matches
microscope (Stemi 508 Boom stand)	Zeiss	435064-9000-000
PBS sterile	Gibco - Thermo Fischer	10010-023
pump (injector)	Stoelting	53311
scalpel handle	Stoelting	52171P
shaver - electrical	andis	64800
solution to inject / material to implant
stereotax - small animal digital	Kopf	Model 940
sterilizer - glass bead	BT Lab Systems	BT1703
tubing - heat-shrink	Nelco	NP221-3/64
tweezers - dumont fine curved	Roboz	RS-5045A
underpad - absorbent
vaporizer for isoflurane (package)	Scivena Scientific	M3000
wound clips and applier / remover	Stoelting	59040
wound glue (Vetbond)	3M corporation	1469SB