Somministrazione intracranica stereotassica di sostanze chimiche, proteine o vettori virali per lo studio della malattia di Parkinson

Riepilogo

Descriviamo come iniettare con successo soluzioni in specifiche aree cerebrali dei roditori utilizzando un frame stereotassico. Questo intervento chirurgico di sopravvivenza è un metodo consolidato utilizzato per imitare vari aspetti del morbo di Parkinson.

Abstract

La malattia di Parkinson (PD) è una malattia progressiva tradizionalmente definita da tremore a riposo e acinesia, principalmente a causa della perdita di neuroni dopaminergici nella substantia nigra. Le aree cerebrali colpite presentano inclusioni fibrillari intraneuronali costituite principalmente da proteine alfa-sinucleina (asyn). Nessun modello animale finora ha ricapitolato tutte le caratteristiche di questa malattia. Qui, descriviamo l'uso dell'iniezione stereotassica per veicolare sostanze chimiche, proteine o vettori virali per via intracranica al fine di imitare vari aspetti del PD. Questi metodi sono ben consolidati e ampiamente utilizzati in tutto il campo della PD. Le iniezioni stereotassiche sono incredibilmente flessibili; Possono essere regolati in base alla concentrazione, all'età dell'animale utilizzato per l'iniezione, all'area cerebrale mirata e alle specie animali utilizzate. Le combinazioni di sostanze consentono variazioni rapide per valutare i trattamenti o alterare la gravità della patologia o i deficit comportamentali. Iniettando tossine nel cervello, possiamo imitare l'infiammazione e/o una grave perdita di neuroni dopaminergici con conseguente sostanziale fenotipo motorio. I vettori virali possono essere utilizzati per trasdurre le cellule per imitare aspetti genetici o meccanicistici. Le iniezioni preformate di asyn fibrillare ricapitolano al meglio il fenotipo progressivo per un lungo periodo di tempo. Una volta stabiliti questi metodi, può essere economico generare un nuovo modello rispetto alla creazione di una nuova linea transgenica. Tuttavia, questo metodo è laborioso in quanto richiede da 30 minuti a quattro ore per animale a seconda del modello utilizzato. Ogni animale avrà un targeting leggermente diverso e quindi creerà una coorte diversificata da cui da un lato può essere difficile interpretare i risultati; D'altra parte, aiuta a imitare una diversità più realistica che si trova nei pazienti. Gli animali bersaglio in modo errato possono essere identificati utilizzando letture comportamentali o di imaging, o solo dopo essere stati sacrificati, portando a una dimensione della coorte più piccola dopo che lo studio è già stato concluso. Nel complesso, questo metodo è un modo rudimentale ma efficace per valutare un insieme diversificato di aspetti della PD.

Introduzione

Il morbo di Parkinson (PD) è una malattia neurodegenerativa progressiva relativamente comune che colpisce fino all'1% delle persone di età superiore ai 60 anni¹. La malattia di Parkinson è eterogenea, ma clinicamente caratterizzata principalmente da sintomi motori che includono tremore a riposo, bradicinesia, acinesia, rigidità, disturbi dell'andatura e instabilità posturale. La maggior parte dei sintomi motori compare tipicamente quando il 60-70% della dopamina striatale (DA) viene persa a causa di una neurodegenerazione progressiva e distinta nella substantia nigra (SN) pars compacta ^2,3. I neuroni dopaminergici sopravvissuti contengono inclusioni intracellulari note come corpi di Lewy⁴. Questi aggregati sono costituiti principalmente da alfa-sinucleina (asyn), una proteina piccola ma altamente espressa nei neuroni del cervello⁵.

Il meccanismo alla base della neurodegenerazione nella malattia di Parkinson è ancora sconosciuto. L'invecchiamento è ancora il principale fattore di rischio per questo^disturbo. Inoltre, gli esseri umani sono l'unica specie che sviluppa il Parkinson in modo naturale. Pertanto, al fine di studiare la patologia del Parkinson e testare nuovi farmaci per prevenire la progressione della malattia, è stata sviluppata un'ampia gamma di modelli animali⁷. Idealmente, i modelli animali di PD dovrebbero mostrare una perdita progressiva e dipendente dall'età di neuroni DA nel SN, accompagnata da inclusioni intracellulari seguite da disfunzione motoria ed essere responsivi alle terapie sostitutive DA. Nessuno dei modelli animali attualmente disponibili riassume completamente tutti i sintomi clinici e la patologia del Parkinson. Poiché ogni modello presenta aspetti diversi della malattia, è importante considerare attentamente il modello appropriato da utilizzare in un esperimento in base alle domande poste.

Storicamente, i modelli animali si basavano su sostanze tossiche, tra cui la 6-idrossidopamina (6-OHDA) e l'1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetraidropiridina (MPTP), e pesticidi, come il rotenone e il paraquat⁸. Ogni tossico ha un diverso meccanismo d'azione e varia dal neurone DA specifico al generalmente dannoso per le cellule cerebrali. Le tossine possono essere somministrate per via orale, iniettate per via intraperitoneale o direttamente nel cervello utilizzando iniezioni stereotassiche a seconda della permeabilità della barriera ematoencefalica. A differenza di altri modelli, i modelli di tossine garantiscono un alto grado di perdita di cellule dopaminergiche nigrostriatali e fenotipi comportamentali. Alcuni modelli possono anche presentare una patologia sottile. Queste caratteristiche rendono i modelli di tossina PD un ottimo strumento per studiare le terapie sostitutive e gli effetti delle tossine ambientali sull'insorgenza di PD ^9,10.

Inoltre, numerosi modelli murini transgenici sono stati generati utilizzando una varietà di promotori e geni correlati al PD¹¹. La maggior parte dei topi presenta patologia nigrostriatale ma senza una chiara evidenza di neurodegenerazione. I modelli transgenici hanno il vantaggio di essere coerenti tra animali e coorti e, una volta generati, sono facili da mantenere e distribuire. Sebbene non provochino neurodegenerazione, sono comunque modelli utili per studiare i cambiamenti cellulari causati da varianti genetiche e possibili candidati farmaci in un complesso sistema in vivo¹².

A differenza dei modelli transgenici, l'espressione mediata da vettori virali di geni correlati al PD offre un approccio più flessibile¹³. Le iniezioni stereotassiche consentono di scegliere varie aree cerebrali, tipi di cellule e livelli di espressione per un'ampia gamma di specie animali come topi, ratti, maiali e primati non umani. Inizialmente, vettori virali ricombinanti che codificano per asyn sono stati utilizzati per trasdurre i neuroni localizzati nel SN di ratto. L'accumulo di proteine e la disfunzione cellulare precedono la progressiva perdita di cellule dopaminergiche con conseguente deficit comportamentale. Le differenze nel targeting possono portare a una grande variazione della perdita di cellule tra gli animali (30-80%), che è responsabile di deficit comportamentali variabili osservati solo in circa il 25% dei ratti iniettati¹⁴.

Un modello di recente istituzione è l'iniezione intracranica di fibrille asyn preformate (PFF) o estratti aggregati da tessuto cerebrale di topo o paziente^15,16. Diversi studi indicano che l'iniezione di PFF o estratti provoca una patologia asincrona diffusa nel cervello animale e una perdita di neuroni dopaminergici nel SN. L'accumulo di asyn appare all'interno dei neuroni che innervano l'area iniettata. A differenza dei modelli basati su vettori virali, il modello PFF si sviluppa lentamente nell'arco di diversi mesi, seguito da deficit motori a 6 mesi. Questo modello ha un grande potenziale per lo studio del meccanismo o della prevenzione della patologia asincrona^17,18.

Tutti i modelli sopra menzionati sono stati ben consolidati e utilizzati numerose volte per studiare vari aspetti del disturbo umano. Le iniezioni stereotassiche di sostanze direttamente nel cervello hanno svolto un ruolo importante nello sviluppo di questi modelli animali non solo nel campo del Parkinson, ma anche in altri disturbi neurologici. Sebbene sia ad alta intensità di lavoro, la chirurgia stereotassica ha i vantaggi di essere altamente flessibile in base all'età degli animali utilizzati, alla regione del cervello mirata e alla sostanza iniettata e può essere regolata a seconda della domanda di ricerca posta. Ad esempio, le sostanze possono essere iniettate singolarmente o in combinazione (vettore + fibrille o tossico + vettore) per ricapitolare più aspetti della malattia o valutare i trattamenti^19,20. Inoltre, le sostanze possono essere iniettate unilateralmente lasciando il lato non iniettato come controllo interno per la valutazione del comportamento e della neurodegenerazione. Pertanto, questo manoscritto delineerà i passaggi dettagliati per generare modelli di PD utilizzando iniezioni stereotassiche.

Protocollo

Tutti gli esperimenti di questo studio sono stati condotti in stretta conformità con le raccomandazioni della Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio del National Institutes of Health e approvati dai comitati per la cura e l'uso degli animali del National Institute on Aging degli Stati Uniti.

Prima di iniziare, assicurati di aver acquisito la formazione appropriata e l'approvazione etica dal tuo istituto necessarie per eseguire questa procedura. Inoltre, gli anestetici (ad esempio, ketamina e buprenorfina, o fentanil e medetomidina) utilizzati devono essere acquistati e maneggiati secondo le regole pertinenti del proprio istituto.

1. Preparazione (durata 1 ora)

1. Porta gli animali in sala operatoria e lasciali acclimatare mentre allestisci l'area chirurgica. Indossare dispositivi di protezione individuale (DPI) adeguati.
   NOTA: Ciò può dipendere dalle norme di sicurezza locali e dalla sostanza iniettata. I vettori virali necessitano principalmente di DPI di livello 2 di biosicurezza. In generale, indossa almeno una maschera, guanti e camice da laboratorio usa e getta. In circostanze specifiche, è necessario utilizzare guanti e occhiali aggiuntivi.
2. Sterilizzare gli strumenti chirurgici utilizzando un'autoclave o uno sterilizzatore a microsfere di vetro. Per i roditori sono necessari manico di bisturi, pinza emostatica, pinzette Dumont, pinze curve, kit di chiusura delle ferite (clip) o forbici e pinze (per suture) e una testa di trapano.
3. Disinfettare l'area chirurgica e lo strumento stereotassico con etanolo al 70% e coprire l'area accanto allo strumento stereotassico con salviette di carta pulite o un foglio assorbente sterile.
4. Applicare sugli asciugamani: collirio (ad es. Liquigel), tagliacapelli, cotton fioc, iodixanolo diluito, lama chirurgica monouso, trapano chirurgico con punta disinfettata, pennarello o tagliaorecchie, H₂O sterile in una provetta da 1,5 mL, provetta da 1,5 mL con 3 % H₂O₂ in H₂O sterile (1,35 mL di H₂O + 0,15 mL di 30 % H₂O_2, appena preparata), una siringa da 1 ml con ago da 33 G e PBS sterile o soluzione fisiologica, siringa con analgesico e antidoto se si utilizza l'anestesia iniettabile (ad esempio, atipamezolo + buprenorfina/ketoprofene; appena preparata e approvata nel permesso etico) e strumenti chirurgici autoclavati.
5. Riempire l'isoflurano e controllare le pressioni di O₂ e N₂ , se si utilizza l'anestesia gassosa. Aggiungi un tovagliolo di carta sul fondo della camera di inalazione per mantenerla asciutta e pulita.
   Mescolare e preparare nuovamente l'anestetico (ad es. fentanil + medetomidina (per i ratti) o ketamina + soluzione di xilazina (per topi)) se si utilizza l'anestesia iniettabile e se approvato nel permesso etico.
6. Assemblare la siringa di vetro Hamilton e il capillare di vetro (Figura 1A 1.).
   1. Posizionare il capillare di vetro estratto sul tavolo. Posiziona il dito indice dove il capillare si assottiglia con l'estremità dell'unghia dove il capillare dovrebbe essere tagliato.
      NOTA: A seconda della profondità dell'iniezione, è compresa tra 0,5 e 2 cm.
   2. Usa il bordo di una piastrella di ceramica per graffiare accuratamente la parte dell'ago alcune volte. Prendi un capillare di vetro in una mano e usa il pollice e l'indice per afferrare la parte sottile dell'ago. Tirare dal centro alle estremità fino a quando l'ago si rompe in modo smussato.
      NOTA: Se non funziona o l'ago si rompe con i bordi, ripetere alcune volte. Se ancora non si rompe, ripetere il graffio delle piastrelle. Assicurarsi che la parte dell'ago non sia troppo sottile (>50 μm di diametro) e non si pieghi facilmente.
7. Sigillare il capillare di vetro alla siringa di Hamilton.
   1. Fissare un tubo termoretraibile di 1 cm sull'ago metallico smussato attaccato alla siringa di vetro Hamilton. Quindi mettere l'estremità spessa del capillare di vetro sopra l'ago metallico di Hamilton.
   2. Posizionare il tubo termoretraibile su metà del capillare di vetro, assicurando uno spazio di almeno 1 cm tra l'estremità dell'ago metallico di Hamilton e la transizione conica del capillare. Questo sarà lo spazio che conterrà la soluzione iniettabile desiderata in seguito.
   3. Utilizzare un accendino o un fiammifero per riscaldare il tubo termoretraibile e sigillare l'ago di iniezione.
      NOTA: Esistono diverse opzioni di supporto che consentono di fissare la siringa Hamilton al braccio stereotassico a sinistra. Assicurati di poter ancora leggere i numeri sulla siringa Hamilton. Se si utilizza una pompa per iniettare la soluzione, collegare la pompa al braccio stereotassico e fissare la siringa di Hamilton sulla pompa.
8. Rimuovere lo stantuffo di metallo. Inserire un ago da 27 G collegato a una siringa da 1 ml riempita con soluzione fisiologica o PBS sulla parte superiore della siringa Hamilton. Sciacquare la siringa di Hamilton con PBS per verificare se è sigillata e per eliminare tutte le bolle d'aria.
   NOTA: Le bolle d'aria disturberanno l'assorbimento e l'iniezione della soluzione poiché l'aria si comprime più del liquido.
9. Una volta che tutto è controllato e pronto, aprire la piccola vite sul braccio dell'asse z (Figura 1A 2.) dello strumento stereotassico e ruotare il braccio con incrementi di 90° in senso orario per spostare la siringa/capillare di vetro (per evitare che il capillare si rompa durante il fissaggio dell'animale allo strumento stereotassico).
   NOTA: Verificare che tutti gli angoli e le impostazioni stereofiscali siano impostati sui parametri desiderati (normalmente 0°), che la barra dei denti e le barre auricolari siano impostate sulle coordinate desiderate e che la siringa/capillare di Hamilton sia tutta diritta.
10. Accendi il termoforo sulla piattaforma stereofiscale, utilizzando un'imbottitura aggiuntiva sulla parte superiore se è troppo caldo. Posizionare una gabbia vuota e pulita con un cuscinetto termico aggiuntivo accanto all'area chirurgica.

2. Intervento chirurgico (durata media 1 ora per animale)

1. Per anestesia gassosa
   1. Attivare l'isoflurano al 5% con un flusso d'aria N₂ + O₂ (circa 1 L/min) e aprire la valvola della camera di inalazione. Metti l'animale nella camera e assicurati che sia ben sigillata. Osservare la respirazione fino a quando non è notevolmente rallentata (respirazione profonda).
   2. Una volta che l'animale è incosciente, aprire la valvola dello strumento stereotassico e chiudere la valvola della camera. Impostare l'isoflurano al 2%.
   3. Aprire la camera ed estrarre l'animale tenendolo per il collo, aprire la bocca con la pinza e posizionare l'animale sulla barra dentale (Figura 1A 6.) con i denti superiori anteriori inseriti nel foro.
      NOTA: Questo passaggio è sensibile al tempo in quanto l'animale può svegliarsi di nuovo non respirando isoflurano.
   4. Posiziona il cono nasale sul muso e osserva la respirazione per garantire un ritmo costante senza forzare la respirazione. Assicurarsi che l'animale sia profondamente anestetizzato controllando l'assenza dei riflessi di ritiro del pedale degli arti posteriori prima di procedere.
      NOTA: Continua a controllare durante la procedura in modo che l'animale non smetta di respirare o si svegli. Se necessario, regolare la % di isoflurano con piccoli incrementi. Per testare il riflesso di ritiro del pedale degli arti posteriori utilizzare un paio di pinzette e pizzicare la zampa posteriore. Se l'animale ritrae l'arto (riflesso per rimuovere dal dolore gli stimoli) l'anestesia è troppo bassa.
   5. Fissare la testa dell'animale in posizione utilizzando i due auricolari (Figura 1A 7.). Se fatto correttamente, le orecchie dovrebbero essere rivolte lateralmente sopra le barre auricolari. Se la testa è ancora in movimento, regolare le barre auricolari o il cono del naso per fissare la testa più saldamente in posizione.
      NOTA: Prestare attenzione per evitare di rompere i timpani degli animali inserendo le barre auricolari troppo in profondità. I ratti tendono a sbattere le palpebre quando l'auricolare è inserito correttamente.
2. Per l'anestesia iniettabile:
   1. Iniettare all'animale una dose appropriata/raccomandata di anestesia i.p. (300 μg/kg di fentanil e 300 μg/kg di medetomidina per i ratti; 100 mg/kg di ketamina e 10 mg/kg di xilazina per i topi) e rimetterlo nella gabbia domestica.
   2. Controllare i riflessi di ritiro del pedale degli animali 5 minuti dopo l'iniezione. In caso di assenza, fissare la testa dell'animale in posizione utilizzando i due auricolari (Figura 1A, 7.). Se fatto correttamente, le orecchie dovrebbero essere rivolte lateralmente sopra le barre auricolari. Successivamente, posizionare l'animale sulla barra dentata (Figura 1A 6.) e avvitare la leva. Se la testa è ancora in movimento, regolare le barre auricolari o il cono della leva per fissare la testa più saldamente in posizione.
      NOTA: È possibile rompere il timpano di un animale quando le barre auricolari sono inserite troppo in profondità. Non avvitare la leva troppo stretta. Può rompere il naso degli animali.
   3. Se si osservano i riflessi di ritiro del pedale, attendere altri 5-10 minuti. Se ancora osservato, iniettare un altro 10% dell'anestetico precedente.
      NOTA: Aumentare la dose di anestetico lentamente con un periodo di attesa intermedio per evitare la morte dell'animale per asfissia.
   4. Assicurati che il cranio sia piatto regolando l'altezza della barra dei denti e/o della barra dell'orecchio.
      NOTA: Fare attenzione durante la regolazione delle barre poiché la testa cambierà angolo e il cono/leva del naso può rompere il naso degli animali.
3. Applicare un collirio su ciascun occhio (ad es. Liquigel) per evitare che si secchino durante l'intervento. Radere la testa dell'animale dagli occhi alle orecchie.
4. Disinfettare l'area chirurgica utilizzando iodopovidone al 10%. Inoltre, iniettare un anestetico locale (ad es. lidocaina allo 0,5%) per via intradermica nel sito di incisione. Si consiglia di attendere 2-3 minuti affinché agisca prima di continuare.
5. Usando il bisturi, praticare un'incisione continua tra gli occhi e tra le orecchie.
   NOTA: Fare attenzione a non tagliare troppo indietro poiché tagliare i muscoli del collo complicherà il recupero.
6. Usa le punte di cotone per aprire la ferita e pulire l'area dal sangue. Per i ratti, utilizzare le pinze emostatiche per mantenere aperta la ferita, bloccandole nel tessuto sottocutaneo e lasciandole pendere da ogni lato. Per i topi, se necessario, utilizzare micro clip.
   NOTA: Questa è la parte più dolorosa della procedura. Bloccare il tessuto sottocutaneo invece della pelle aumenterà la guarigione.
7. Muovere la siringa/capillare (Figura 1A 1.) di 180° in senso antiorario sull'asse z (Figura 1A 2.) e portarla sopra la testa dell'animale. Assicurarsi di chiudere completamente la manopola in modo che il braccio dell'asse z non oscilli durante l'intervento chirurgico.
8. Utilizzare il microscopio e le manopole su ciascun braccio stereotassico (Figura 1A 3.-5.) per spostare l'estremità smussata del capillare di vetro (attaccato alla siringa di vetro di Hamilton; Figura 1A 1.) proprio sopra il bregma (toccando ma non premendo sull'osso). Azzerare tutti i valori sul display digitale (Figura 1A 8.).
   NOTA: Bregma (Figura 1B) è il punto in cui si incontrano le suture sagittali e coronali delle ossa parietali e frontali. Questo sarà il punto di origine.
9. Guardando attraverso il microscopio, sposta l'estremità smussata del capillare proprio sopra la lambda. Se il valore dell'asse z (dorsale/ventrale = DV) è compreso tra +/-0,1 mm, la testa dell'animale viene livellata. Se è più alto o più basso, utilizzare la barra dentata per regolare la testa di conseguenza fino a +/- 0,1 mm.
   NOTA: La lambda (Figura 1B) è definita come il punto in cui si incontrano le suture sagittale e coronale delle ossa parietale e occipitale. Questo metodo potrebbe essere utilizzato anche per livellare il lato sinistro e destro del cranio se le barre auricolari possono essere regolate individualmente. Fare attenzione durante la regolazione delle barre poiché la testa cambierà angolo e il cono / leva del muso può rompere il naso degli animali.
10. Usa l'atlante cerebrale di Allen (Figura 1C, D) per identificare le coordinate per la regione target desiderata. Utilizzare i bracci dell'asse y (anteriore/posteriore = AP) e dell'asse x (mediale/laterale = ML) per spostare la siringa/capillare nella posizione corretta.
    NOTA: Le iniezioni di colorante (Figura 2A-E) devono essere eseguite prima delle procedure chirurgiche su animali separati per garantire che le coordinate siano corrette per il ceppo/età degli animali utilizzati.
11. Guarda attraverso il microscopio e preparati a praticare con cura un foro nel punto in cui l'estremità smussata del capillare incontra l'osso. Prima di iniziare, spostare il capillare verso l'alto quanto basta sull'asse y in modo che non si danneggi durante la perforazione. Inizia a perforare in un cerchio più grande e diventa più piccolo man mano che fori più in profondità. Durante la perforazione, appoggiare la mano su una barra auricolare per mantenerla ferma.
    NOTA: Non perforare fino al tessuto cerebrale. Lasciare un sottile strato di osso per evitare danni alla dura. Usa invece una pinzetta per rimuovere con cura il sottile strato di osso rimanente.
12. Utilizzando il microscopio, verificare che l'estremità smussata dell'ago possa toccare la dura madre / tessuto cerebrale senza essere deviata da pezzi di osso.
13. Pulire la siringa/capillare per evitare la contaminazione della soluzione iniettabile.
    1. Spostare la siringa/capillare fino in fondo e immergerla nella provetta da 1,5 ml contenente il 3% di H₂O₂. Assicurati di rimuovere tutti i detriti e il sangue dal vetro. Quindi, immergere il capillare nella provetta da 1,5 ml contenente H₂O per lavare via l'H₂O₂.
    2. Rimuovere lo stantuffo di metallo dalla siringa di Hamilton e posizionare una garza sotto la siringa/capillare, sopra la testa dell'animale. Utilizzare la siringa da 1 ml riempita di PBS per lavare la siringa di Hamilton inserendo l'ago nella parte superiore e spruzzando fuori il PBS. Successivamente, inserire lo stantuffo metallico nella siringa di Hamilton.
14. Aspirare 1 μL di aria. Ciò impedirà al PBS nella siringa di Hamilton e alla soluzione iniettabile di mescolarsi nel capillare. Quindi aspirare la quantità desiderata di soluzione iniettabile. Si raccomanda un massimo di 1 μl e 2 μl per deposito, rispettivamente per topi e ratti.
    NOTA: Non superare un totale di 3 μL/6 μL per emisfero poiché la pressione nel cervello aumenterà troppo. Usando una penna, si può fare un piccolo segno con molta attenzione dove si trova il menisco della soluzione. Questo segno può quindi essere utilizzato come punto di riferimento per valutare se la soluzione entra nel cervello.
15. Per i ratti, utilizzare un ago da 25 G per perforare la dura. Inserire il capillare nel cervello fino alla coordinata DV desiderata. Spostare la siringa/capillare di 0,1 mm più in profondità del previsto e tirarla indietro per fare spazio alla soluzione.
16. Iniettare la soluzione a mano (0,1 μl per 10-15 sec) o con una pompa (0,4-0,6 μl/min). Controllare il menisco per assicurarsi che la soluzione sia completamente iniettata.
    NOTA: Se la soluzione non si muove nel cervello, muovere la siringa/capillare su e giù di 0,2 mm. Se ancora non inietta, ripetere i passaggi 2.13-2.14. Molto probabilmente l'ago è ostruito da detriti di tessuto cerebrale.
17. Tenere la siringa/capillare in posizione per altri 5 minuti per consentire alla soluzione iniettata di distribuirsi e alla pressione di diminuire. Durante questo periodo di attesa, iniettare l'analgesico e marcare l'animale se necessario.
18. Spostare la siringa/capillare verso l'alto di 0,2 mm e tenerla in posizione per altri 2 minuti. Estrarre la siringa/ago molto lentamente per evitare di sollevare la soluzione iniettata a causa della pressione negativa.
19. Una volta che la siringa/capillare è fuori dal cervello, pulirla come descritto al punto 2.13 per evitare che i tessuti si secchino e ostruiscano il capillare.
20. Continua a iniettare più aree cerebrali o termina l'intervento chirurgico.
21. Spostare l'ago della siringa da parte ruotandolo di 180° sull'asse z per evitare rotture durante la chiusura della ferita. Quindi, chiudere la ferita con clip, colla per tessuti o punti di sutura. Se è stata utilizzata l'anestesia iniettabile, iniettare l'antidoto all'animale.
    NOTA: Gli animali non alloggiati singolarmente tendono a pulirsi la testa a vicenda ed eventualmente a rimuovere fermagli, colla o punti di sutura.
22. Rimuovi l'animale dal telaio stereotassico e posizionalo nella gabbia pulita sopra il termoforo. Monitora l'animale per assicurarti che si svegli senza complicazioni. Fornire un facile accesso a cibo e acqua per le prime 24 ore.

3. Assistenza post-operatoria (durata 3-7 giorni)

1. Controlla il peso (è accettabile una perdita di peso del 10%), il pelo, le feci e l'assunzione di cibo/acqua dell'animale nei prossimi 2-3 giorni (fino a 10 giorni per l'iniezione di sostanze tossiche) per garantire un corretto recupero. Se necessario, isolare l'animale e fornire cibo umido, iniezioni di soluzione salina e un termoforo, essenziali per alcune iniezioni di sostanze tossiche poiché gli animali potrebbero avere ulteriori problemi sistemici.
2. Iniettare agli animali analgesico per altri 1-2 giorni dopo l'intervento chirurgico per garantire sollievo dal dolore secondo le normative locali. Se i punti di sutura, le clip o la colla non si staccano da soli, utilizzare l'isoflurano per anestetizzare l'animale e rimuovere i punti di sutura, le clip o la colla 1 settimana dopo l'intervento.

Risultati

Per evitare errori di targeting, prima di ogni esperimento, verificare le coordinate utilizzando iniezioni di colorante. Agli animali è stato iniettato 0,2-0,5 μL di triptofano blu utilizzando lo stesso protocollo, il capillare è stato rapidamente ritirato dopo l'iniezione e il cervello è stato rapidamente congelato per evitare la diffusione. Dopo il sezionamento sul microtomo, il sito di iniezione può essere visto in blu (Figura 2 C,E)...

Discussione

L'iniezione stereotassica, come ogni procedura chirurgica, ha la principale difficoltà a garantire il benessere e la sopravvivenza dell'animale. Pertanto, è essenziale monitorare attentamente l'animale durante tutta la procedura. L'attenzione alle irregolarità respiratorie, alla perdita di respiro o alla ricorrenza di riflessi e movimenti dovrebbe essere l'obiettivo principale, soprattutto per i chirurghi inesperti. Inoltre, l'applicazione di analgesici è fondamentale per aiutare il ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Allen brain atlas	Allen Institute	mouse brain - reference atlas
analgesic: ketoprofin OR buprenorphine
anesthetic: Isoflurane OR ketamine / xylazine OR fentanyl / medetomidine
blades - surgical sterile	Oasis Medical	No 10
capillaries - glass	Stoelting	50811
capillary puller	Sutter Instruments	P-97
cotton-tipped applicators	Stoelting	50975
drill - dental	Foredom	MH-170
Ethanol 70%
eye drops (Liquigel)	CVS	NDC 0023-9205-02	Carboxymethylcellulose Sodium (1%), Boric acid; calcium chloride; magnesium chloride; potassium chloride; purified water; PURITE® (stabilized oxychloro complex); sodium borate; and sodium chloride
forceps - full curved	Stoelting	52102-38P
forceps - hemostatic delicate	Stoelting	52110-13
gauze - cotton absorbent
H2O - sterile
H2O2 30%	Sigma Aldrich	216763
Hamilton 5ul syringe	Hamilton Company	7634-01
Hamilton blunt metal needle	Hamilton Company	7770-01
heat pad - far infrared	Kent Scientific	2665967
Iodine solution (Dynarex) 10%	Indemedical	102538
isoflurane	Baxter	1001936040
lidocaine 0.5%
lighter / matches
microscope (Stemi 508 Boom stand)	Zeiss	435064-9000-000
PBS sterile	Gibco - Thermo Fischer	10010-023
pump (injector)	Stoelting	53311
scalpel handle	Stoelting	52171P
shaver - electrical	andis	64800
solution to inject / material to implant
stereotax - small animal digital	Kopf	Model 940
sterilizer - glass bead	BT Lab Systems	BT1703
tubing - heat-shrink	Nelco	NP221-3/64
tweezers - dumont fine curved	Roboz	RS-5045A
underpad - absorbent
vaporizer for isoflurane (package)	Scivena Scientific	M3000
wound clips and applier / remover	Stoelting	59040
wound glue (Vetbond)	3M corporation	1469SB