الاحتواء المناعي لشبكية العين الكاملة مع طريقة إزالة الأنسجة الوضوح

Elizabeth J. Alessio; Dao-Qi Zhang

doi:10.3791/62178

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

هنا نقدم بروتوكولا لتكييف طريقة وضوح أنسجة الدماغ لشبكية العين كاملة جبل لتحسين نوعية تلطيخ المناعية القياسية والتصوير عالي الدقة من الخلايا العصبية الشبكية وهياكلها دون الخلوية.

Abstract

تم تعديل طريقة التهذير الهيدروجيل الأنسجة (CLARITY)، التي وضعت أصلا من قبل مختبر Deisseroth، وتستخدم على نطاق واسع لاحتواء المناعة والتصوير لعينات الدماغ سميكة. ومع ذلك، لم يتم استخدام هذه التكنولوجيا المتقدمة بعد لشبكية العين كاملة التركيب. على الرغم من أن شبكية العين شفافة جزئيا، إلا أن سمكها البالغ حوالي 200 ميكرومتر (في الفئران) لا يزال يحد من اختراق الأجسام المضادة للأنسجة العميقة وكذلك الحد من اختراق الضوء للتصوير عالي الدقة. هنا، قمنا بتكييف طريقة CLARITY لشبكية العين الماوس جبل كامل عن طريق البلمرة لهم مع مونومر الأكريلاميد لتشكيل هيدروجيل نانوبري ومن ثم تطهيرها في كبريتات دودسيل الصوديوم للحد من فقدان البروتين وتجنب تلف الأنسجة. كانت شبكية العين المجهزة بالوضوح ملطخة بالمناعة بأجسام مضادة للخلايا العصبية الشبكية والخلايا الدبقية والبروتينات المتشابكة ، مثبتة في محلول مطابق لمؤشر الانكسار ، وصورت. تظهر بياناتنا أن CLARITY يمكن أن يحسن جودة تلطيخ المناعة الكيميائية القياسية والتصوير للخلايا العصبية الشبكية والخلايا الدبقية في إعداد التركيب الكامل. على سبيل المثال ، تم تحسين الدقة ثلاثية الأبعاد للهياكل الدقيقة الشبيهة بالفأس والتشجرات لخلايا amacrine الدوبامين بشكل كبير من خلال CLARITY. بالمقارنة مع شبكية العين غير المصنعة كاملة التركيب ، يمكن أن يكشف CLARITY عن وجود مناعة للبروتينات المتشابكة مثل بروتين الكثافة بعد المتشابك 95. تظهر نتائجنا أن CLARITY يجعل شبكية العين أكثر شفافية بصريا بعد إزالة الدهون ويحافظ على الهياكل الدقيقة للخلايا العصبية الشبكية وبروتيناتها ، والتي يمكن استخدامها بشكل روتيني للحصول على تصوير عالي الدقة للخلايا العصبية الشبكية وهياكلها دون الخلوية في إعداد التركيب الكامل.

Introduction

قد تكون الشبكية الفقارية هي الجزء الأكثر سهولة في الجهاز العصبي المركزي (CNS)، وهي بمثابة نموذج ممتاز لدراسة تطور الدماغ وبنيته ووظيفته. يتم توزيع خمس فئات من الخلايا العصبية في شبكية العين في ثلاث طبقات نووية مفصولة طبقتين شكلية. تتكون الطبقة النووية الخارجية (ONL) من مستقبلات ضوئية كلاسيكية (قضبان ومخاريط) تحول الضوء إلى إشارات كهربائية. تتم معالجة الإشارات الكهربائية بواسطة الخلايا العصبية في الطبقة النووية الداخلية (INL)، بما في ذلك الخلايا ثنائية القطب والأفقية والأماكرين، ثم تنتقل إلى خلايا العقدة الشبكية (RGCs) في طبقة خلايا العقدة (GCL). RGCs هي الخلايا العصبية الناتجة من شبكية العين، مع محاور عصبية إسقاط إلى الدماغ للمساهمة في تشكيل الصورة وغير تشكيل الصورة وظيفة بصرية. بالإضافة إلى ذلك، توفر ثلاثة أنواع من الخلايا الدبقية (خلايا مولر، والأستروغليا، والميكروجليا) العناصر الغذائية للخلايا العصبية وتحمي الخلايا العصبية من التغيرات الضارة في بيئتها خارج الخلية.

واحد السكان الفرعية المتخصصة من خلايا الاماكرين تنتج وتطلق الدوبامين, neuromodulator هامة في الجهاز العصبي المركزي, إعادة تكوين الدوائر العصبية الشبكية خلال التكيف مع الضوء¹^,². خلايا الدوبامين amacrine (DACs) لديها ميزة فريدة من ملامح مورفولوجية. وتقع سوماتا بهم في INL القريبة مع dendrites ramifying في الجزء الأكثر قاصرة من طبقة plexiform الداخلية (IPL). عمليات تشبه أكسون من DACs هي unmyelinated، رقيقة وطويلة، متفرعة بشكل متفرق، وتحمل الدوالي (مواقع إطلاق الدوبامين). أنها تشكل الضفيرة الكثيفة مع dendrites في IPL، بما في ذلك هياكل تشبه حلقة حول سوماتا من خلايا AII amacrine. المحاور أيضا تشغيل من خلال INL نحو OPL, تشكيل مسار الطرد المركزي عبر شبكية العين³. لقد أثبتنا أن عمليات DAC تعبر عن المستقبلات استجابة لإطلاق الغلوتامات من الخلايا العصبية presynaptic، بما في ذلك الخلايا ثنائية القطب وخلايا العقدة الشبكية الحساسة للضوء في جوهرها (ipRGCs)⁴^،⁵^،⁶. ومع ذلك، فمن غير الواضح ما إذا كانت مستقبلات الغلوتامات تعبر عن محاور الفأس، التشعبات، أو كليهما لأنها مقطوعة في أقسام الشبكية الرأسية ولا يمكن تمييزها عن بعضها البعض⁵^،⁶. يجب إجراء التلطخ المناعي في شبكية العين الكاملة للكشف عن تفريع ثلاثي الأبعاد ل DACs ووجود مستقبلات الغلوتامات على المقصورات دون الخلوية. على الرغم من أن شبكية العين شفافة نسبيا، إلا أن سمك شبكية العين ذات التركيب الكامل للفأر يبلغ حوالي 200 ميكرومتر، مما يحد من اختراق الأجسام المضادة للأنسجة العميقة، فضلا عن تقليل اختراق الضوء للتصوير عالي الدقة بسبب تشتت الأنسجة الخفيفة. للتغلب على هذه القيود، قمنا بتكييف طريقة التهذييل الهيدروجيل الأنسجة المتوافقة (CLARITY) التي تم تطويرها مؤخرا لأقسام الدماغ السميكة إلى شبكية العين الماوس جبل كامل⁷.

تم تطوير طريقة CLARITY في الأصل من قبل مختبر Deisseroth لاحتواء المناعة وتصوير عينات الدماغ السميكة⁷. ويستخدم المنظفات القوية، كبريتات دودسيل الصوديوم (SDS) والكهربائية لإزالة مكونات الدهون (التي تسبب تشتت الضوء الأنسجة)، وترك البروتينات والأحماض النووية في مكانها. يتم استبدال الدهون إزالتها مع سقالة شفافة تتكون من مونومرات هيدروجيل مثل الأكريلاميد لدعم بنية البروتين المتبقية. يمكن تسمية الأنسجة المطهية عن طريق الكيمياء المناعية وصورت مع زيادة كبيرة في عمق اختراق الضوء من خلال الأنسجة (تصل إلى عدة ملليمترات تحت سطح الأنسجة). ومنذ ذلك الحين، تم تحسين طريقة CLARITY وتبسيطها من قبل العديد من مجموعات البحث⁸^و⁹^و¹⁰. يستخدم بروتوكول CLARITY المعدل تقنية إزالة سلبية لتجنب تلف الأنسجة المحتمل الناتج عن الكهتروفورسيس لتطهير الدماغ كله والأعضاء الأخرى السليمة^11. ومع ذلك، لم يتم تطبيق هذه الطريقة بعد على شبكية العين كاملة التركيب. هنا، قمنا بتكييف تقنية CLARITY السلبية لشبكية العين الكاملة لجعلها أكثر شفافية للكيمياء المناعية والتصوير. وجدنا أن غالبية بروتينات الشبكية التي تم اختبارها تم الحفاظ عليها خلال هذه العملية للكيمياء المناعية. باستخدام معامل الانكسار مطابقة الحل، كنا قادرين على صورة الخلايا العصبية الشبكية عبر سمك ما يقرب من 200 ميكرومتر من ONL إلى GCL في شبكية العين جبل كامل.

Protocol

وقد أجريت رعاية الفئران وجميع الإجراءات التجريبية وفقا للمبادئ التوجيهية للمعاهد الوطنية للصحة للحيوانات المختبرية ووافقت عليها اللجان المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة أوكلاند (البروتوكول رقم 18071).

ملاحظة: يتم سرد أسماء الحلول والتركيبات الخاصة بهم في الجدول 1.

1. إعداد الأنسجة

قتل الفأر بجرعة زائدة من ثاني أكسيد الكربون_،يليه خلع عنق الرحم.
احث العينين بالملقط المنحني ونقلها إلى طبق بتري صغير مع 0.1 M PBS (الجدول 1). تحت مجهر تشريح، كزة حفرة صغيرة على طول تقاطع القرنية تصلب مع إبرة. نقل إلى 4٪ بارافورمالديهايد (PFA) لمدة ساعة واحدة.
نقل العين مرة أخرى إلى طبق مع برنامج تلفزيوني. تحت مجهر تشريح، استخدم مقص التشريح لقطع كل الطريق حول تقاطع القرنية والكليرا. إزالة القرنية والعدسة. قطع في قاعدة العصب البصري وتقشير بعناية تصلب قبالة مع ملقط لعزل شبكية العين.
جعل أربعة تخفيضات صغيرة بالتساوي حول شبكية العين واستخدام فرشاة تلميح غرامة انخفض في برنامج تلفزيوني لوضعها مسطحة (GCL الجانب إلى أسفل) في شكل يشبه البرسيم على قطع مربع صغير من ورقة تصفية النيتروسليلوز لتحقيق الاستقرار في شبكية العين.
نقل شبكية العين باستخدام ملقط لعقد زاوية ورقة النيتروسليلوز (دون لمس شبكية العين التي شنت) ووضعها في لوحة 48 جيدا مع 4٪ PFA لمدة 1 ساعة.
نقل ورقة تصفية وشبكية العين إلى بئر مع برنامج تلفزيوني وغسل (3x لمدة 5 دقائق لكل منهما).
نقل إلى A4P0 (الجدول 1) واحتضان بين عشية وضحاها في 4 °C مع التحريض لطيف.
زيت نباتي ماصة في البئر لتغطية تماما حل A4P0. احتضان في حمام مائي في 40 درجة مئوية لمدة 3 ساعات مع عدم وجود اهتزاز.
غسل (3x لمدة 5 دقائق لكل منهما) في برنامج تلفزيوني، والتأكد من أن جميع النفط قد تم شطف قبالة. إذا لزم الأمر، استخدم ماصة لإزالة الزيت المتبقي بعناية من أعلى البئر قبل الشطف الأخير.
احتضان في 10٪ SDS في 40 درجة مئوية لمدة يومين مع اهتزاز لطيف. استبدال SDS مع حل جديد في اليوم الثاني.
نقل ورقة تصفية وشبكية العين إلى برنامج تلفزيوني مع تريتون-X-100 (PBST، الجدول 1)وغسل (5x ل 1.5 ساعة لكل منهما).
تخزين في 4 درجة مئوية في PBST مع 0.01٪ azide الصوديوم (NaN₃₎أو الانتقال مباشرة إلى نقص المناعة.

2. مطابقة مؤشر التخزين الانكساري والمناعة

إزالة شبكية العين من ورقة التصفية عن طريق تقشير بلطف تشغيله مع فرشاة تلميح غرامة في PBST.
احتضان شبكية العين في الأجسام المضادة الأولية (الجدول 2) المخفف في حل الحجب (الجدول 1) لمدة يومين عند 40 درجة مئوية مع اهتزاز لطيف.
غسل (5x، 1.5 ساعة لكل منهما) في PBST.
احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية المناسبة (الجدول 3) المخفف في حل حجب لمدة 2 أيام في 40 درجة مئوية مع اهتزاز لطيف وحماية من الضوء من خلال ما تبقى من الإجراء.
اغسل (5x، 1.5 ساعة لكل منهما) في 0.02 متر من الفوسفات (انظر الجدول 1).
احتضان في معامل الانكسار القائم على سوربيتول مطابقة الحل (sRIMS، انظر الجدول 1)في 40 درجة مئوية بين عشية وضحاها مع اهتزاز لطيف.

3. تصاعد

قم بوضع مخطط تفصيلي لشريحة زجاجية مقاس 18 مم × 18 مم × 1.5 مم مع علامة دائمة ذات طرف رفيع لوضع علامة على حد مربع على الجزء الخلفي من شريحة المجهر الزجاجي.
الوجه الشريحة أكثر واستخدام حقنة لتتبع الحدود مع خط رفيع من الشحوم السيليكون على الجزء الأمامي من الشريحة، وترك فجوة صغيرة في زاوية واحدة لحل تصاعد الزائدة للهروب.
نقل شبكية العين إلى وسط المنطقة المحيطة وترتيب مع فرشاة غرامة تلميح بحيث تقع مسطحة مع الجانب مستقبلات ضوئية ضد الشريحة الزجاجية.
ماصة ما يقرب من 60 ميكرولتر من sRIMS بحيث يغطي شبكية العين بالارض ويمتد إلى زاوية واحدة من الضميمة، مع الحرص على أن شبكية العين يبقى شقة وفي مكانها.
تطبيق coverslip بدءا من الزاوية مع SRIMS وخفض ببطء حتى يمس الشحوم على جميع الجوانب، وتجنب تشكيل فقاعات الهواء.
ضع كومة من 3 قطع تغطي على كل جانب من شبكية العين المركبة كمسافة. استخدام حافة طويلة من شريحة أخرى للضغط على أسفل coverslip بحيث جبل مسطحة وحتى.
تخزين الشرائح مسطحة عند 4 درجة مئوية حتى التصوير.

4. التصوير

عينات الصورة على المجهر الفلوري التقليدي أو المجهر الكونفوكوكال(جدول المواد). ابدأ بوضع الشريحة على مرحلة المجهر وتحديد موقع العينة.
ملاحظة: إذا تم استخدام مجهر موضوعي مقلوب، ضع الشريحة رأسا على عقب على المسرح، أولا ضمان أن المناطق المكشوفة من الشريحة واضحة من جميع الشحوم السيليكون والحل المتصاعد.
للحصول على صور مكدسة z لعينات تحمل علامة مشتركة، ركز أولا على الإشارة في كل قناة على حدة وحدد وقت التعرض أو سرعة المسح الضوئي، للمجاهر الفلورية أو البؤرية، على التوالي.
تعيين النطاق للكدسة z إما عن طريق تعيين المستوى البؤري يدويا في أعلى وأسفل النطاق المطلوب، أو عن طريق تعيين نقطة الوسط ثم تحديد نطاق حول نقطة الوسط.
ضبط حجم الخطوة أو عدد الشرائح حسب الرغبة.
التقاط الصورة وحفظ الملف الأصلي وكذلك تصديره كملف TIFF أو تنسيق آخر المطلوب.

5. تحليل الصور

استخدام برنامج تحليل الصور من اختيار(جدول المواد)لضبط السطوع والتباين في كل قناة حتى يتحقق الوضوح الأمثل في كل من الصور المفردة وتقديم 3 الأبعاد من z-كومة.
ملاحظة: إذا كان حجم الخطوة المحددة صغيرة بما فيه الكفاية، يمكن أيضا إجراء deconvolution 3D لتحسين الإشارة.

النتائج

شبكية العين المعدلة المعالجة CLARITY هي أنسجة شفافة بصريا.
لصياغة طريقة تطهير الأنسجة التي تتوافق مع التطبيقات المناعية الكيميائية في شبكية العين مع توفير الهذيان الكافي والاحتفاظ السلامة الهيكلية للبروتينات الخلوية، قمنا بتكييف طريقة إزالة الأنسجة وضوح لشبكية العين الماوس جبل...

Discussion

تعديل بروتوكول CLARITY لشبكية العين كاملة التركيب.
لقد قمنا بتبسيط بروتوكول CLARITY لتحقيق البلمرة الكافية دون الحاجة إلى إخلاء فراغ أو غرفة الجفاف ، كما هو مستخدم في معظم الدراسات السابقة⁷^و⁹^و¹¹. يتم تثبيط عملية البلمرة عن طريق الأكسج?...

Disclosures

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

ونود أن نشكر بينغ يي، وناثان سبيكس، وهاو ليو على الدعم التقني. وقد تم دعم هذا العمل من قبل المعهد الوطني للمنح الصحية EY022640 (D.-Q.Z.) وجائزة أبحاث الطلاب الجامعيين في جامعة أوكلاند (E.J.A.).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Fixative
Acrylamide	Fisher Biotech	BP170	Hydrogel monomer
Axio Imager.Z2	Zeiss		Fluorscence microscope
BSA	Fisher Scientific	BP1600	Blocking agent
Eclipse Ti	Nikon Instruments		Scanning confocal microscope
KCl	VWR	BDH0258	Buffer component
KH₂PO₄	Sigma	P5655	Buffer component
Na₂HPO₄	Sigma Aldrich	S9763	Buffer component
NaCl	Sigma Aldrich	S7653	Buffer component
NaH₂PO₄	Sigma Aldrich	S0751	Buffer component
NaN₃	Sigma Aldrich	S2002	Bacteriostatic preservative
NDS	Aurion	900.122	Blocking agent
NIS Elements AR	Nikon		Image analysis software
SDS	BioRad	1610301	Delipidation agent
Sorbitol	Sigma Aldrich	51876	Buffer component
Triton-X-100	Sigma	T8787	Surfactant
Tween-20	Fisher Scientific	BP337	Surfactant
VA-044	Wako Chemicals	011-19365	Thermal initiator

References

Witkovsky, P. Dopamine and retinal function. Documenta Ophthalmologica. 108 (1), 17-40 (2004).
McMahon, D. G., Iuvone, P. M. Circadian organization of the mammalian retina: from gene regulation to physiology and diseases. Progress in Retinal and Eye Research. 39, 58-76 (2014).
Prigge, C. L., et al. M1 ipRGCs Influence Visual Function through Retrograde Signaling in the Retina. Journal of Neuroscience. 36 (27), 7184-7197 (2016).
Zhang, D. Q., Belenky, M. A., Sollars, P. J., Pickard, G. E., McMahon, D. G. Melanopsin mediates retrograde visual signaling in the retina. PLoS One. 7 (8), 42647 (2012).
Liu, L. L., Alessio, E. J., Spix, N. J., Zhang, D. Q. Expression of GluA2-containing calcium-impermeable AMPA receptors on dopaminergic amacrine cells in the mouse retina. Molecular Vision. 25, 780-790 (2019).
Liu, L. L., Spix, N. J., Zhang, D. Q. NMDA Receptors Contribute to Retrograde Synaptic Transmission from Ganglion Cell Photoreceptors to Dopaminergic Amacrine Cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 279 (2017).
Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332 (2013).
Poguzhelskaya, E., Artamonov, D., Bolshakova, A., Vlasova, O., Bezprozvanny, I. Simplified method to perform CLARITY imaging. Molecular Neurodegeneration. 9, 19 (2014).
Epp, J. R., et al. Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs. eNeuro. 2 (3), (2015).
Magliaro, C., et al. Clarifying CLARITY: Quantitative Optimization of the Diffusion Based Delipidation Protocol for Genetically Labeled Tissue. Frontiers in Neuroscience. 10, 179 (2016).
Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
Zheng, H., Rinaman, L. Simplified CLARITY for visualizing immunofluorescence labeling in the developing rat brain. Brain Structure and Function. 221 (4), 2375-2383 (2016).
Witkovsky, P., Arango-Gonzalez, B., Haycock, J. W., Kohler, K. Rat retinal dopaminergic neurons: differential maturation of somatodendritic and axonal compartments. Journal of Comparative Neurology. 481 (4), 352-362 (2005).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

169

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: