Immunomarquage de rétines à monture entière avec la méthode de nettoyage tissulaire CLARITY

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour adapter la méthode CLARITY des tissus cérébraux pour les rétines de montage entier afin d’améliorer la qualité de la coloration immunohistochimique standard et de l’imagerie à haute résolution des neurones rétinins et de leurs structures subcellulaires.

Résumé

La méthode de dlipidation de l’hydrogel tissulaire (CLARITY), développée à l’origine par le laboratoire Deisseroth, a été modifiée et largement utilisée pour l’immunomarquage et l’imagerie d’échantillons de cerveau épais. Cependant, cette technologie de pointe n’a pas encore été utilisée pour les rétines à montage entier. Bien que la rétine soit partiellement transparente, son épaisseur d’environ 200 μm (chez la souris) limite toujours la pénétration des anticorps dans les tissus profonds et réduit la pénétration de la lumière pour l’imagerie à haute résolution. Ici, nous avons adapté la méthode CLARITY pour les rétines de souris à montage entier en les polymérisant avec un monomère d’acrylamide pour former un hydrogel nanoporeux, puis en les éliminant dans du sulfate de dodécyle de sodium pour minimiser la perte de protéines et éviter les lésions tissulaires. des rétines CLARTÉ-traitées immunostained avec des anticorps pour les neurones rétiniens, les cellules glial, et les protéines synaptiques, montés dans une solution d’appariement d’index réfractif, et imagés. Nos données démontrent que clarity peut améliorer la qualité de la souillure et de l’imagerie immunohistochemical standard pour les neurones rétiniennes et les cellules gliales dans la préparation de montage entier. Par exemple, la résolution 3D des structures axon-comme et dendritiques fines des cellules dopaminergiques d’amacrine ont été beaucoup améliorées par la CLARTÉ. Par rapport aux rétines à montage entier non traitées, CLARITY peut révéler une immunomarquage pour les protéines synaptiques telles que la protéine de densité postsynaptique 95. Nos résultats montrent que CLARITY rend la rétine plus transparente optiquement après l’élimination des lipides et préserve les structures fines des neurones rétiniennes et de leurs protéines, qui peuvent être couramment utilisées pour obtenir une imagerie à haute résolution des neurones rétiniennes et de leurs structures subcellulaires dans la préparation de montage entier.

Introduction

La rétine vertébrée est peut-être la partie la plus accessible du système nerveux central (SNC), et elle sert d’excellent modèle pour étudier le développement, la structure et la fonction du cerveau. Cinq classes de neurones de la rétine sont réparties en trois couches nucléaires séparées par deux couches plexiformes. La couche nucléaire externe (ONL) est constituée de photorécepteurs classiques (tiges et cônes) qui convertissent la lumière en signaux électriques. Les signaux électriques sont traités par les neurones de la couche nucléaire interne (INL), y compris les cellules bipolaires, horizontales et amacrines, puis transmis aux cellules ganglionnaires rétiniennes (RGCs) dans la couche cellulaire ganglionnaire (GCL). Les RGCs sont les neurones de sortie de la rétine, avec les axones projetant vers le cerveau pour contribuer à la fonction visuelle image-formation et non-formation d’image. En outre, trois types de cellules gliales (cellules de Muller, astroglie et microglie) fournissent des nutriments aux neurones et protègent les neurones contre les changements nocifs dans leur environnement extracellulaire.

Une sous-population spécialisée de cellules amacrines produit et libère de la dopamine, un neuromodulateur important dans le SNC, reconfigurant les circuits neuronaux rétiniennes lors de l’adaptation à la lumière^1,2. Les cellules amacrines dopaminergiques (DAC) ont une caractéristique unique des profils morphologiques. Leur somata sont situés dans l’INL proximal avec des dendrites ramifiant dans la partie la plus distale de la couche plexiforme interne (IPL). Les processus axon-like des DAC sont unmyelinated, minces et longs, peu ramifiés, et portent des varicosities (les sites de libération de dopamine). Ils forment un plexus dense avec des dendrites dans l’IPL, y compris des structures en forme d’anneau autour de la somata des cellules amacrines AII. Les axones traversent également l’INL vers la BPO, formant une voie centrifuge à travers la rétine^3. Nous avons démontré que les processus DAC expriment des récepteurs en réponse à la libération de glutamate par les neurones présynaptiques, y compris les cellules bipolaires et les cellules ganglionnaires rétiniennes intrinsèquement photosensibles (ipRGCs)^4,5,6. Cependant, il n’est pas clair si les récepteurs du glutamate s’expriment sur les axones, les dendrites, ou les deux puisqu’ils sont coupés en sections rétiniennes verticales et ne peuvent pas être distingués les uns des autres^5,6. Immunostaining doit être effectué dans les rétines entières de montage pour indiquer la ramification tridimensionnelle des DAC et la présence des récepteurs de glutamate sur les compartiments subcellulaires. Bien que la rétine soit relativement transparente, l’épaisseur d’une rétine à montage entier de souris est d’environ 200 μm, ce qui limite la pénétration des anticorps dans les tissus profonds et réduit la pénétration de la lumière pour l’imagerie à haute résolution en raison de la diffusion de la lumière dans les tissus. Pour surmonter ces limitations, nous avons adapté la méthode de délidation de l’hydrogel tissulaire compatible immunostaining (CLARITY) développée récemment pour les sections épaisses du cerveau aux rétines de souris à montage entier⁷.

La méthode CLARITY a été initialement développée par le laboratoire Deisseroth pour l’immunomarquage et l’imagerie d’échantillons de cerveau épais^7. Il utilise un détergent puissant, le dodécyl sulfate de sodium (SDS) et l’électrophorèse pour éliminer les composants lipidiques (qui provoquent la diffusion de la lumière dans les tissus), laissant les protéines et les acides nucléiques en place. Les lipides éliminés sont remplacés par un échafaudage transparent composé de monomères d’hydrogel tels que l’acrylamide pour soutenir la structure protéique restante. Le tissu dégagé peut être marqué par immunohistochimie et étiqueté avec une profondeur de pénétration de la lumière sensiblement accrue à travers le tissu (jusqu’à plusieurs millimètres sous la surface du tissu). Depuis lors, la méthode CLARITY a été optimisée et simplifiée par plusieurs groupes de recherche^8,9,10. Un protocole CLARITY modifié utilise une technique de compensation passive pour éviter les dommages tissulaires possibles produits par électrophorèse pour effacer l’ensemble du cerveau et d’autres organes intacts¹¹. Cependant, cette méthode n’a pas encore été appliquée aux rétines à montage entier. Ici, nous avons adapté la technique passive CLARITY pour les rétines à montage entier afin de les rendre plus transparentes pour l’immunohistochimie et l’imagerie. Nous avons constaté qu’une majorité des protéines rétiniennes examinées ont été préservées pendant ce processus pour immunohistochemistry. En utilisant la solution d’appariement de l’indice de réfraction, nous avons pu imager les neurones rétiniennes sur l’épaisseur d’environ 200 μm de l’ONL à la GCL dans des rétines à montage entier.

Protocole

Les soins de la souris et toutes les procédures expérimentales ont été effectués conformément aux lignes directrices des National Institutes of Health pour les animaux de laboratoire et ont été approuvés par les comités institutionnels de soins et d’utilisation des animaux de l’Université d’Oakland (protocole no 18071).

NOTA : Les noms des solutions et de leurs compositions sont indiqués dans le tableau 1.

1. Préparation des tissus

1. Euthanasier la souris avec un surdosage de CO₂, suivi d’une luxation cervicale.
2. Enucleate les yeux avec des pinces incurvées et les transférer dans une petite boîte de Pétri avec 0,1 M PBS (Tableau 1). Sous un microscope de dissection, piquer un petit trou le long de la jonction cornée-sclérotique avec une aiguille. Transférer à 4% de paraformaldéhyde (PFA) pendant 1 heure.
3. Recarz l’œil dans un plat avec du PBS. Sous un microscope de dissection, utilisez des ciseaux de dissection pour couper tout autour de la jonction cornée-sclérotique. Retirez la cornée et le cristallin. Couper à la base du nerf optique et décoller soigneusement la sclérotique avec une pince pour isoler la rétine.
4. Faites quatre petites coupes uniformément autour de la rétine et utilisez une brosse à pointe fine trempée dans du PBS pour la déposer à plat (côté GCL vers le bas) en forme de trèfle sur une petite coupe carrée de papier filtre à nitrocellulose pour stabiliser la rétine.
5. Transférer la rétine à l’aide d’une pince pour maintenir le coin du papier nitrocellulose (sans toucher la rétine montée) et la placer dans une plaque de 48 puits avec 4% de PFA pendant 1 heure.
6. Transférer le papier filtre et la rétine dans un puits avec pbs et laver (3x pendant 5 min chacun).
7. Transvaire sur A4P0(tableau 1)et incuber pendant une nuit à 4 °C avec une agitation douce.
8. Pipetter l’huile végétale dans le puits pour couvrir complètement la solution A4P0. Incuber au bain-marie à 40 °C pendant 3 heures sans secouer.
9. Laver (3x pendant 5 min chacun) dans du PBS, en vous assurant que toute l’huile a été rincée. Si nécessaire, utilisez un tuyau pour retirer soigneusement l’huile restante du haut du puits avant le dernier rinçage.
10. Incuber dans une FDS à 10% à 40 °C pendant deux jours en secouant doucement. Remplacez la FDS par une solution fraîche le deuxième jour.
11. Transférer le papier filtre et la rétine dans le PBS avec Triton-X-100 (PBST, tableau 1)et laver (5x pour 1,5 h chacun).
12. Conserver à 4 °C dans du PBST contenant 0,01 % d’azide de sodium_(NaN3)ou passer directement à l’immunomarquage.

2. Immunomarquage et appariement de l’indice de réfraction

1. Retirez la rétine du papier filtre en l’épluchant doucement avec une brosse à pointe fine dans du PBST.
2. Incuber la rétine dans un anticorps primaire(tableau 2)dilué dans une solution bloquante(tableau 1)pendant 2 jours à 40 °C avec une légère secousse.
3. Laver (5x, 1,5 h chacun) en PBST.
4. Incuber avec les anticorps secondaires appropriés(tableau 3)dilués dans une solution bloquante pendant 2 jours à 40 °C avec une légère secousse et protéger de la lumière pendant le reste de la procédure.
5. Lavage (5x, 1,5 h chacun) dans un tampon phosphate 0,02 M (voir tableau 1).
6. Incuber dans une solution d’appariement de l’indice de réfraction à base de sorbitol (sRIMS, voir tableau 1)à 40 °C pendant la nuit avec une légère secousse.

3. Montage

1. Contour d’une lame de verre de 18 mm x 18 mm x 1,5 mm avec un marqueur permanent à pointe fine pour marquer une limite carrée à l’arrière d’une lame de microscope en verre.
2. Retournez la glissière et utilisez une seringue pour tracer la limite avec une fine ligne de graisse de silicone sur le devant de la glissière, laissant un petit espace dans un coin pour que la solution de montage excédentaire s’échappe.
3. Transférer la rétine au centre de la zone délimitée et disposer avec une brosse à pointe fine de sorte qu’elle se trouve à plat avec le côté photorécepteur contre la lame de verre.
4. Pipetter environ 60 μL de sRIMS afin qu’il couvre la rétine aplati et s’étende jusqu’à un coin de l’enceinte, en prenant soin que la rétine reste plate et en place.
5. Appliquez la lamelle à partir du coin avec le sRIMS et abaissez-la lentement jusqu’à ce qu’elle touche la graisse de tous les côtés, en évitant la formation de bulles d’air.
6. Placez une pile de 3 lamelle de chaque côté de la rétine montée comme entretoise. Utilisez le bord long d’une autre diapositive pour appuyer sur la lame de couverture afin que le support soit plat et uniforme.
7. Conserver les diapositives à plat à 4 °C jusqu’à l’imagerie.

4. Imagerie

1. Échantillons d’images sur un microscope à fluorescence conventionnel ou un microscope confocal(Table des matériaux). Commencez par placer la lame sur l’étage du microscope et localiser l’échantillon.
   REMARQUE: Si un microscope objectif inversé est utilisé, placez la lame à l’envers sur la scène, en vous assurant d’abord que les zones exposées de la lame sont débrêchées de toute graisse de silicone et de toute solution de montage.
2. Pour obtenir des images empilées z d’échantillons co-marqués, concentrez-vous d’abord sur le signal dans chaque canal individuellement et définissez le temps d’exposition ou la vitesse de balayage, pour les microscopes à fluorescence ou confocaux, respectivement.
3. Définissez la plage de la pile z en définissant manuellement le plan focal en haut et en bas de la plage souhaitée, ou en définissant le point médian, puis en spécifiant une plage autour du milieu.
4. Ajustez la taille de l’étape ou le nombre de tranches comme vous le souhaitez.
5. Capturez l’image et enregistrez le fichier d’origine ainsi que l’exportez en tant que fichier TIFF ou autre format souhaité.

5. Analyse d’image

1. Utilisez le logiciel d’analyse d’image de choix(Table des matériaux)pour ajuster la luminosité et le contraste dans chaque canal jusqu’à ce qu’une clarté optimale soit atteinte à la fois dans les images uniques et dans le rendu en 3 dimensions de la pile z.
   REMARQUE: Si la taille de pas sélectionnée est suffisamment petite, la déconvolution 3D peut également être effectuée pour améliorer le signal.

Résultats

Les rétines modifiées traitées par CLARITY sont des tissus optiquement transparents.
Pour formuler une méthode de nettoyage des tissus compatible avec les applications immunohistochimiques dans la rétine tout en fournissant une délidation adéquate et en conservant l’intégrité structurelle des protéines cellulaires, nous avons adapté la méthode de nettoyage des tissus CLARITY aux rétines de souris à montage entier. Nous avons pu simplifier le protocole et le modifier pour les rétines ?...

Discussion

Modification du protocole CLARITY pour les rétines à monture entière.
Nous avons simplifié le protocole CLARITY pour obtenir une polymérisation adéquate sans avoir besoin d’une chambre d’évacuation sous vide ou de dessiccation, comme cela est utilisé dans la plupart des études précédentes^7,9,11. Le processus de polymérisation est inhibé par l’oxygène, ce qui nécessite que l’échantillon...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Fixative
Acrylamide	Fisher Biotech	BP170	Hydrogel monomer
Axio Imager.Z2	Zeiss		Fluorscence microscope
BSA	Fisher Scientific	BP1600	Blocking agent
Eclipse Ti	Nikon Instruments		Scanning confocal microscope
KCl	VWR	BDH0258	Buffer component
KH2PO4	Sigma	P5655	Buffer component
Na2HPO4	Sigma Aldrich	S9763	Buffer component
NaCl	Sigma Aldrich	S7653	Buffer component
NaH2PO4	Sigma Aldrich	S0751	Buffer component
NaN3	Sigma Aldrich	S2002	Bacteriostatic preservative
NDS	Aurion	900.122	Blocking agent
NIS Elements AR	Nikon		Image analysis software
SDS	BioRad	1610301	Delipidation agent
Sorbitol	Sigma Aldrich	51876	Buffer component
Triton-X-100	Sigma	T8787	Surfactant
Tween-20	Fisher Scientific	BP337	Surfactant
VA-044	Wako Chemicals	011-19365	Thermal initiator