Imunostaining de Retinas de Monte Inteiro com o Método de Limpeza tecidual CLARITY

Resumo

Aqui apresentamos um protocolo para adaptar o método CLARITY dos tecidos cerebrais para retinas de montagem inteira para melhorar a qualidade da coloração imunohistoquímica padrão e imagens de alta resolução de neurônios retinais e suas estruturas subcelulares.

Resumo

O método de delipidação de hidrogel de tecido (CLARITY), originalmente desenvolvido pelo laboratório Deisseroth, foi modificado e amplamente utilizado para imunossuagem e imagem de amostras cerebrais espessas. No entanto, esta tecnologia avançada ainda não foi usada para retinas de montagem inteira. Embora a retina seja parcialmente transparente, sua espessura de aproximadamente 200 μm (em camundongos) ainda limita a penetração de anticorpos no tecido profundo, bem como reduz a penetração de luz para imagens de alta resolução. Aqui, adaptamos o método CLARITY para retinas de camundongos de montagem inteira polimerizando-as com um monômero de acrilamida para formar um hidrogel nanoporoso e, em seguida, limpá-los em sulfato de dodecilo de sódio para minimizar a perda de proteína e evitar danos teciduais. As retinas processadas pela CLARIDADE foram imunossuídas com anticorpos para neurônios da retina, células gliais e proteínas sinápticas, montadas em uma solução de correspondência de índices refrativos e imagens. Nossos dados demonstram que a CLARITY pode melhorar a qualidade da coloração imunohistoquímica padrão e imagens para neurônios da retina e células gliais em preparação de todo o suporte. Por exemplo, a resolução 3D de estruturas axônicas finas e dendríticas de células amacrinas dopaminérgicas foram muito melhoradas pela CLARITY. Em comparação com retinas de montagem integral não processadas, a CLARITY pode revelar imunossuagem para proteínas sinápticas, como a proteína de densidade pós-sináptica 95. Nossos resultados mostram que a CLARITY torna a retina mais opticamente transparente após a remoção de lipídios e preserva estruturas finas de neurônios da retina e suas proteínas, que podem ser rotineiramente usadas para obter imagens de alta resolução de neurônios da retina e suas estruturas subcelulares em preparação de todo o suporte.

Introdução

A retina vertebrada é talvez a parte mais acessível do sistema nervoso central (SNC), e serve como um excelente modelo para estudar o desenvolvimento, estrutura e função do cérebro. Cinco classes de neurônios na retina são distribuídos em três camadas nucleares separadas por duas camadas plexiformes. A camada nuclear externa (ONL) consiste em fotorreceptores clássicos (hastes e cones) que convertem luz em sinais elétricos. Os sinais elétricos são processados por neurônios na camada nuclear interna (INL), incluindo células bipolares, horizontais e amacrinas, e depois transmitidos para células gânglios da retina (RGCs) na camada celular de gânglio (GCL). Os RGCs são os neurônios de saída da retina, com os axônios projetando para o cérebro contribuir para a formação de imagens e função visual não-formadora de imagens. Além disso, três tipos de células gliais (células Muller, astroglia e microglia) fornecem nutrientes aos neurônios e protegem os neurônios de alterações nocivas em seu ambiente extracelular.

Uma subpopulação especializada de células amacrinas produz e libera dopamina, um importante neuromodulador no CNS, reconfigurando circuitos neurais da retina durante a adaptação da luz^1,2. As células amacrinas dopaminérgicas (DACs) têm uma característica única de perfis morfológicos. Sua somata está localizada no INL proximal com dendritos ramificantes na parte mais distal da camada plexiforme interna (IPL). Os processos semelhantes ao Axon de DACs são nãoomiados, finos e longos, pouco ramificados e têm varizes (os locais de liberação de dopamina). Eles formam um plexo denso com dendritos no IPL, incluindo estruturas semelhantes a anel ao redor da somata de células amacrinas AII. Os axônios também atravessam o INL em direção ao OPL, formando uma via centrífuga através da retina³. Demonstramos que o DAC processa receptores expressos em resposta à liberação de glutamato de neurônios pré-sinápticos, incluindo células bipolares e células de gânglios intrinsecamente fotosensíveis da retina (ipRGCs)^4,5,6. No entanto, não está claro se os receptores de glutamato expressam nos axônios, dendritos ou ambos, uma vez que são cortados em seções verticais de retina e não podem ser distinguidos uns dos outros^5,6. A imunostaining precisa ser realizada em retinas de montagem inteira para revelar ramificações tridimensionais de DACs e a presença de receptores de glutamato em compartimentos subcelulares. Embora a retina seja relativamente transparente, a espessura de uma retina de montagem inteira de um rato é de aproximadamente 200 μm, o que limita a penetração de anticorpos no tecido profundo, bem como reduz a penetração de luz para imagens de alta resolução devido à dispersão da luz tecidual. Para superar essas limitações, adaptamos o método de delipidação de hidrogel de tecido compatível com imunosstaining (CLARITY) desenvolvido recentemente para seções cerebrais grossas para retinas de camundongos de montagem inteira⁷.

O método CLARITY foi originalmente desenvolvido pelo laboratório Deisseroth para imunossuagem e imagem de amostras cerebrais espessas⁷. Ele usa um detergente forte, sulfato de dodecila de sódio (SDS) e eletroforese para remover os componentes lipídicos (que causam dispersão de luz tecidual), deixando as proteínas e ácidos nucleicos no lugar. Os lipídios removidos são substituídos por um andaime transparente composto por monômeros de hidrogel, como acrilamida, para suportar a estrutura proteica restante. O tecido limpo pode ser rotulado através de imunohistoquímica e imageado com profundidade de penetração de luz substancialmente aumentada através do tecido (até vários milímetros abaixo da superfície do tecido). Desde então, o método CLARITY tem sido otimizado e simplificado por diversos grupos de pesquisa^8,9,10. Um protocolo clarity modificado usa uma técnica de compensação passiva para evitar os possíveis danos teciduais produzidos pela eletroforese para limpar todo o cérebro e outros órgãos intactos¹¹. No entanto, este método ainda não foi aplicado a retinas de montagem inteira. Aqui, adaptamos a técnica de CLARIDADE passiva para retinas de montagem integral para torná-las mais transparentes para a imunohistoquímica e a imagem. Descobrimos que a maioria das proteínas da retina testadas foram preservadas durante esse processo para imunohistoquímica. Usando a solução de correspondência de índices refrativos, fomos capazes de imaginar neurônios de retina através da espessura de aproximadamente 200 μm do ONL para o GCL em retinas de montagem inteira.

Protocolo

O cuidado com o rato e todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com as diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde para animais de laboratório e foram aprovados pelos Comitês Institucionais de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Oakland (protocolo nº 18071).

NOTA: Os nomes das soluções e suas composições estão listados na Tabela 1.

1. Preparação tecidual

1. Eutanize o rato com uma overdose de CO_2,seguido de luxação cervical.
2. Enuclear os olhos com fórceps curvos e transferi-los para uma pequena placa de petri com 0,1 M PBS(Tabela 1). Sob um microscópio de dissecção, faça um pequeno buraco ao longo da junção córnea-esclera com uma agulha. Transfira para 4% de paraformaldeído (PFA) por 1 hora.
3. Transfira o olho de volta para um prato com PBS. Sob um microscópio de dissecção, use uma tesoura de dissecção para cortar todo o caminho ao redor da junção córnea-esclera. Remova a córnea e a lente. Corte na base do nervo óptico e retire cuidadosamente a esclera com fórceps para isolar a retina.
4. Faça quatro pequenos cortes uniformemente ao redor da retina e use uma fina escova de ponta mergulhada em PBS para colocá-lo plano (lado GCL para baixo) em uma forma de trevo em um pequeno corte quadrado de papel filtro de nitrocelulose para estabilizar a retina.
5. Transfira a retina usando fórceps para segurar o canto do papel nitrocelulose (sem tocar na retina montada) e coloque-a em uma placa de 48 poços com 4% de PFA por 1 hora.
6. Transfira o papel filtro e a retina para um poço com PBS e lave (3x por 5 min cada).
7. Transfira para A4P0 (Tabela 1) e incuba durante a noite a 4 °C com agitação suave.
8. Óleo vegetal pipeta no poço para cobrir completamente a solução A4P0. Incubar em um banho de água a 40 °C por 3 horas sem tremer.
9. Lave (3x por 5 min cada) em PBS, certificando-se de que todo o óleo foi lavado. Se necessário, use uma tubulação para remover cuidadosamente o óleo restante da parte superior do poço antes da última lavagem.
10. Incubar em 10% SDS a 40 °C por dois dias com agitação suave. Substitua o SDS por uma solução nova no segundo dia.
11. Transfira o papel filtro e a retina para PBS com Triton-X-100 (PBST, Tabela 1) e lave (5x por 1,5 h cada).
12. Armazene a 4 °C em PBST com azida de sódio de 0,01% (NaN₃) ou mova-se diretamente para a imunostainagem.

2. Imunostaining e correspondência de índices refratários

1. Remova a retina do papel do filtro descascando-a suavemente com uma escova de ponta fina no PBST.
2. Incubar a retina em anticorpo primário(Tabela 2) diluído na solução de bloqueio(Tabela 1) por 2 dias a 40 °C com agitação suave.
3. Lave (5x, 1,5 h cada) em PBST.
4. Incubar com os anticorpos secundários apropriados(Tabela 3) diluídos em solução de bloqueio por 2 dias a 40 °C com agitação suave e proteger da luz durante o restante do procedimento.
5. Lave (5x, 1,5 h cada) em tampão fosfato de 0,02 M (ver Tabela 1).
6. Incubar em solução de correspondência de índice refrativo baseada em sorbitol (sRIMS, ver Tabela 1) a 40 °C durante a noite com agitação suave.

3. Montagem

1. Delineie uma tampa de vidro de 18 mm x 18 mm x 1,5 mm com um marcador permanente de ponta fina para marcar um limite quadrado na parte de trás de um deslizamento de microscópio de vidro.
2. Vire o slide e use uma seringa para traçar o limite com uma fina linha de graxa de silicone na parte frontal do slide, deixando uma pequena lacuna em um canto para a solução de montagem em excesso escapar.
3. Transfira a retina para o centro da área delimitada e organize com uma escova de ponta fina para que ela fique plana com o lado fotorreceptor contra o escorregador de vidro.
4. Pipeta aproximadamente 60 μL de sRIMS de modo que cubra a retina achatada e se estenda a um canto do gabinete, tomando cuidado para que a retina permaneça plana e no lugar.
5. Aplique a mancha de cobertura a partir do canto com o sRIMS e abaixe-a lentamente até tocar a graxa em todos os lados, evitando a formação de bolhas de ar.
6. Coloque uma pilha de 3 tampas em cada lado da retina montada como um espaçador. Use a borda longa de outro slide para pressionar o deslizamento para que a montagem fique plana e uniforme.
7. Armazene os slides a 4 °C até a imagem.

4. Imagem

1. Amostras de imagem em um microscópio de fluorescência convencional ou um microscópio confocal(Tabela de Materiais). Comece colocando o slide no estágio do microscópio e localizando a amostra.
   NOTA: Se um microscópio objetivo invertido estiver sendo usado, coloque o slide de cabeça para baixo no palco, primeiro garantindo que as áreas expostas do slide estejam livres de toda a graxa de silicone e solução de montagem.
2. Para obter imagens empilhadas em z de amostras co-rotuladas, primeiro concentre-se no sinal em cada canal individualmente e defina o tempo de exposição ou velocidade de varredura, para fluorescência ou microscópios confocal, respectivamente.
3. Defina o intervalo para a pilha z, definindo manualmente o plano focal na parte superior e inferior da faixa desejada, ou definindo o ponto médio e, em seguida, especificando um intervalo ao redor do ponto médio.
4. Ajuste o tamanho da etapa ou o número de fatias conforme desejado.
5. Capture a imagem e salve o arquivo original, bem como exporte-a como um arquivo TIFF ou outro formato desejado.

5. Análise de imagem

1. Use o software de análise de imagem de escolha(Tabela de Materiais) para ajustar o brilho e o contraste em cada canal até que a clareza ideal seja alcançada tanto nas imagens únicas quanto na renderização tridimensional da pilha z.
   NOTA: Se o tamanho da etapa selecionada for suficientemente pequeno, a desconvolução 3D também poderá ser realizada para melhorar o sinal.

Resultados

Retinas modificadas processadas por CLARITY são tecido opticamente transparente.
Para formular um método de limpeza tecidual compatível com aplicações imunohistoquímicas na retina, ao mesmo tempo em que fornecemos delipidação adequada e retendo a integridade estrutural das proteínas celulares, adaptamos o método de limpeza tecidual CLARITY para retinas de camundongos de montagem total. Conseguimos simplificar o protocolo e modificá-lo para retinas de montagem inteira (ver Protocolo). Após ...

Discussão

Modificação do protocolo CLARITY para retinas de montagem inteira.
Simplificamos o protocolo CLARITY para alcançar a polimerização adequada sem a necessidade de uma câmara de evacuação ou dessecação a vácuo, como é usado na maioria dos estudos anteriores^7,9,11. O processo de polimerização é inibido pelo oxigênio, exigindo que a amostra seja isolada do ar durante a etapa de polimerização do p...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Fixative
Acrylamide	Fisher Biotech	BP170	Hydrogel monomer
Axio Imager.Z2	Zeiss		Fluorscence microscope
BSA	Fisher Scientific	BP1600	Blocking agent
Eclipse Ti	Nikon Instruments		Scanning confocal microscope
KCl	VWR	BDH0258	Buffer component
KH2PO4	Sigma	P5655	Buffer component
Na2HPO4	Sigma Aldrich	S9763	Buffer component
NaCl	Sigma Aldrich	S7653	Buffer component
NaH2PO4	Sigma Aldrich	S0751	Buffer component
NaN3	Sigma Aldrich	S2002	Bacteriostatic preservative
NDS	Aurion	900.122	Blocking agent
NIS Elements AR	Nikon		Image analysis software
SDS	BioRad	1610301	Delipidation agent
Sorbitol	Sigma Aldrich	51876	Buffer component
Triton-X-100	Sigma	T8787	Surfactant
Tween-20	Fisher Scientific	BP337	Surfactant
VA-044	Wako Chemicals	011-19365	Thermal initiator