Immunostaining delle retine a montaggio intero con il metodo clarity tissue clearing

Riepilogo

Qui presentiamo un protocollo per adattare il metodo CLARITY dei tessuti cerebrali per retine a montaggio intero per migliorare la qualità della colorazione immunoistochimica standard e l'imaging ad alta risoluzione dei neuroni retini e delle loro strutture subcellulari.

Abstract

Il metodo di delipidazione dell'idrogel tissutale (CLARITY), originariamente sviluppato dal laboratorio Deisseroth, è stato modificato e ampiamente utilizzato per l'immunosociezione e l'imaging di campioni cerebrali spessi. Tuttavia, questa tecnologia avanzata non è ancora stata utilizzata per retine a montaggio intero. Sebbene la retina sia parzialmente trasparente, il suo spessore di circa 200 μm (nei topi) limita ancora la penetrazione di anticorpi nel tessuto profondo e riduce la penetrazione della luce per l'imaging ad alta risoluzione. Qui, abbiamo adattato il metodo CLARITY per le retine di topo a montaggio intero polimerizzandole con un monomero di acrilammide per formare un idrogel nanoporous e quindi cancellandole in solfato di dodecil di sodio per ridurre al minimo la perdita di proteine ed evitare danni ai tessuti. Le retine elaborate da CLARITY sono state immunosostenibili con anticorpi per neuroni retinali, cellule gliali e proteine sinaptiche, montate in una soluzione di corrispondenza dell'indice di rifrazione e immagini. I nostri dati dimostrano che CLARITY può migliorare la qualità della colorazione immunoistochimica standard e dell'imaging per neuroni retinali e cellule gliali in preparazione a montaggio intero. Ad esempio, la risoluzione 3D delle strutture astronomie fini e dendritiche delle cellule di amacrina dopaminergica è stata molto migliorata da CLARITY. Rispetto alle retine integrali non lavorate, CLARITY può rivelare l'immunostaining per proteine sinaptiche come la proteina a densità postsinaptica 95. I nostri risultati mostrano che CLARITY rende la retina più otticamente trasparente dopo la rimozione dei lipidi e preserva le strutture fini dei neuroni retinali e delle loro proteine, che possono essere utilizzate regolarmente per ottenere l'imaging ad alta risoluzione dei neuroni retinali e delle loro strutture subcellulari in preparazione a montaggio intero.

Introduzione

La retina vertebrata è forse la parte più accessibile del sistema nervoso centrale (SNC), e serve come un modello eccellente per studiare lo sviluppo, la struttura e la funzione del cervello. Cinque classi di neuroni nella retina sono distribuite in tre strati nucleari separati da due strati plexiformi. Lo strato nucleare esterno (ONL) è costituito da fotorecettori classici (aste e coni) che convertono la luce in segnali elettrici. I segnali elettrici vengono elaborati dai neuroni nello strato nucleare interno (INL), comprese le cellule bipolari, orizzontali e amacrine, e quindi trasmessi alle cellule gangliari retiniche (RGC) nello strato cellulare ganglio (GCL). Le RGC sono i neuroni di uscita della retina, con gli assoni che si proiettano al cervello per contribuire alla funzione visiva che forma immagini e non forma immagini. Inoltre, tre tipi di cellule gliali (cellule di Muller, astroglia e microglia) forniscono nutrienti ai neuroni e proteggono i neuroni dai cambiamenti dannosi nel loro ambiente extracellulare.

Una sottopopolazione specializzata di cellule amacrine produce e rilascia dopamina, un importante neuromodulatore nel SNC, riconfigurando i circuiti neurali retinali durante^{l'adattamento della luce 1,2}. Le cellule amacrine dopaminergiche (DAC) hanno una caratteristica unica dei profili morfologici. I loro somata si trovano nell'INL prossimale con dendriti che ramificano nella parte più distale dello strato plexiforme interno (IPL). I processi simili ad axon dei DAC sono non meelini, sottili e lunghi, scarsamente ramificati e sopportano variacosità (i siti di rilascio della dopamina). Formano un plesso denso con dendriti nell'IPL, incluse strutture simili ad anelli attorno ai somi delle cellule di amacrina AII. Gli assoni attraversano anche l'INL verso l'OPL, formando un percorso centrifugo attraverso la retina³. Abbiamo dimostrato che i processi DAC esprimono recettori in risposta al rilascio di glutammato dai neuroni presnaptici, comprese le cellule bipolari e le cellule gangliari retiniche intrinsecamente fotosensibili (IPRGC)^4,5,6. Tuttavia, non è chiaro se i recettori del glutammato esprimono sugli assoni, sui dendriti o entrambi poiché sono tagliati in sezioni retiniche verticali e non possono essere distinti l'uno^{dall'altro 5,6}. L'immunostaining deve essere effettuato in retine a montaggio intero per rivelare la ramificazione tridimensionale dei DAC e la presenza di recettori del glutammato sui compartimenti subcellulari. Sebbene la retina sia relativamente trasparente, lo spessore di una retina a montaggio intero del topo è di circa 200 μm, il che limita la penetrazione degli anticorpi nel tessuto profondo e riduce la penetrazione della luce per l'imaging ad alta risoluzione a causa della diffusione della luce tissutale. Per superare questi limiti, abbiamo adattato il metodo di delipidazione dell'idrogel tissutale compatibile immunosottenibile (CLARITY) sviluppato di recente per sezioni cerebrali spesse alle retine di topo^{montate su intero 7}.

Il metodo CLARITY è stato originariamente sviluppato dal laboratorio Deisseroth per l'immunosociezione e l'imaging di campioni cerebrali^{spessi 7}. Utilizza un detergente forte, il solfato di dodecil di sodio (SDS) e l'elettroforesi per rimuovere i componenti lipidici (che causano lo scattering della luce dei tessuti), lasciando le proteine e gli acidi nucleici in posizione. I lipidi rimossi vengono sostituiti con un'impalcatura trasparente composta da monomeri idrogel come l'acrilammide per sostenere la restante struttura proteica. Il tessuto eliminato può essere etichettato tramite immunoistochimica e immaginato con una profondità di penetrazione della luce notevolmente aumentata attraverso il tessuto (fino a diversi millimetri sotto la superficie del tessuto). Da allora, il metodo CLARITY è stato ottimizzato e semplificato da diversi gruppi^{di ricerca 8,9,10}. Un protocollo CLARITY modificato utilizza una tecnica di compensazione passiva per evitare i possibili danni ai tessuti prodotti dall'elettroforesi per lo sgombero di tutto il cervello e di altri organi^{intatti 11}. Tuttavia, questo metodo non è ancora stato applicato alle retine a montaggio intero. Qui, abbiamo adattato la tecnica PASSIVA CLARITY per retine a montaggio intero per renderle più trasparenti per l'immunoistochimica e l'imaging. Abbiamo scoperto che la maggior parte delle proteine retiniche testate sono state conservate durante questo processo per l'immunoistochimica. Utilizzando la soluzione di corrispondenza dell'indice di rifrazione, siamo stati in grado di visualizzare i neuroni retini attraverso lo spessore di circa 200 μm dall'ONL al GCL nelle retine a montaggio intero.

Protocollo

La cura del topo e tutte le procedure sperimentali sono state condotte secondo le linee guida del National Institutes of Health per gli animali da laboratorio e sono state approvate dagli Institutional Animal Care and Use Committees della Oakland University (protocollo n. 18071).

NOTA: I nomi delle soluzioni e le loro composizioni sono elencati nella tabella 1.

1. Preparazione dei tessuti

1. Eutanasia del topo con un sovradosaggio di CO₂, seguito da lussazione cervicale.
2. Enucleare gli occhi con forcep curve e trasferirli in una piccola piastra di Petri con 0,1 M PBS(Tabella 1). Al microscopio a dissezione, colpire un piccolo foro lungo la giunzione cornea-sclera con un ago. Trasferire al 4% di paraformaldeide (PFA) per 1 ora.
3. Trasferire l'occhio su un piatto con PBS. Al microscopio a dissezione, utilizzare le forbici di dissezione per tagliare tutto intorno alla giunzione cornea-sclera. Rimuovere la cornea e l'obiettivo. Tagliare alla base del nervo ottico e staccare con cura la sclera con le forcep per isolare la retina.
4. Fare quattro piccoli tagli uniformemente intorno alla retina e utilizzare un pennello a punta fine immerso in PBS per posarlo piatto (lato GCL verso il basso) in una forma simile a un trifoglio su un piccolo taglio quadrato dalla carta filtrante di nitrocellulosa per stabilizzare la retina.
5. Trasferire la retina utilizzando le forcelle per tenere l'angolo della carta nitrocellulosa (senza toccare la retina montata) e posizionarla in una piastra da 48 po 'con 4% di PFA per 1 ora.
6. Trasferire la carta filtrante e la retina in un pozzo con PBS e lavare (3 volte per 5 minuti ciascuno).
7. Trasferire ad A4P0(tabella 1)e incubare durante la notte a 4 °C con agitazione delicata.
8. Pipetta olio vegetale nel pozzo per coprire completamente la soluzione A4P0. Incubare in un bagno d'acqua a 40 °C per 3 ore senza tremare.
9. Lavare (3 volte per 5 minuti ciascuno) in PBS, assicurandosi che tutto l'olio sia stato risciacquato. Se necessario, utilizzare una pipetta per rimuovere con cura l'olio rimanente dalla parte superiore del pozzo prima dell'ultimo risciacquo.
10. Incubare in SDS al 10% a 40 °C per due giorni con tremori delicati. Sostituire SDS con una soluzione fresca il secondo giorno.
11. Trasferire la carta da filtro e la retina in PBS con Triton-X-100 (PBST, Tabella 1)e lavare (5x per 1,5 h ciascuno).
12. Conservare a 4 °C in PBST con azide di sodio allo 0,01% (NaN 3 ) o passare_direttamenteall'immunosocienza.

2. Corrispondenza dell'indice di immunostaining e rifrazione

1. Rimuovere la retina dalla carta da filtro staccarla delicatamente con un pennello a punta fine in PBST.
2. Incubare la retina nell'anticorpo primario (Tabella 2) diluita in soluzione di blocco(tabella 1)per 2 giorni a 40 °C con tremori delicati.
3. Lavare (5x, 1,5 h ciascuno) in PBST.
4. Incubare con gli anticorpi secondari appropriati(tabella 3)diluiti in soluzione di blocco per 2 giorni a 40 °C con scuotimenti delicati e proteggere dalla luce attraverso il resto della procedura.
5. Lavare (5x, 1,5 h ciascuno) in tampone fosfato 0,02 M (cfr. tabella 1).
6. Incubare in soluzione di corrispondenza dell'indice di rifrazione a base di sorbitolo (sRIMS, vedi tabella 1) a 40 °C durante la notte con tremori delicati.

3. Montaggio

1. Delineare un coverslip in vetro da 18 mm x 18 mm x 1,5 mm con un pennarello permanente a punta fine per contrassegnare un bordo quadrato sul retro di uno scivolo al microscopio di vetro.
2. Capovolgere lo scivolo e utilizzare una siringa per tracciare il confine con una sottile linea di grasso siliconico sulla parte anteriore dello scivolo, lasciando un piccolo spazio in un angolo per evitare l'eccesso di soluzione di montaggio.
3. Trasferire la retina al centro dell'area delimitata e disporre con un pennello a punta fine in modo che giace piatto con il lato fotorecettore contro lo scivolo di vetro.
4. Pipetta circa 60 μL di sRIMS in modo che copra la retina appiattita e si estenda ad un angolo del recinto, facendo attenzione che la retina rimanga piatta e in posizione.
5. Applicare il copripavimenti partendo dall'angolo con lo sRIMS e abbassarlo lentamente fino a tocchire il grasso su tutti i lati, evitando la formazione di bolle d'aria.
6. Posizionare una pila di 3 coverlips su ciascun lato della retina montata come distanziale. Utilizzare il bordo lungo di un'altra diapositiva per premere verso il basso il coperchio in modo che il supporto sia piatto e uniforme.
7. Conservare gli scivoli piatti a 4 °C fino all'imaging.

4. Imaging

1. Campioni di immagini su un microscopio a fluorescenza convenzionale o su un microscopio confocale (Tabella dei materiali). Iniziare posizionando la diapositiva sullo stadio del microscopio e individuando il campione.
   NOTA: Se viene utilizzato un microscopio obiettivo invertito, posizionare lo scivolo capovolto sul palco, assicurando prima che le aree esposte dello scivolo siano chiare da tutto il grasso siliconico e la soluzione di montaggio.
2. Per ottenere immagini impilate a Z di campioni co-etichettati, prima concentrati sul segnale in ogni canale singolarmente e imposta il tempo di esposizione o la velocità di scansione, rispettivamente per la fluorescenza o i microscopi confocali.
3. Impostate l'intervallo per la pila z impostando manualmente il piano focale nella parte superiore e inferiore dell'intervallo desiderato oppure impostando il punto medio e quindi specificando un intervallo intorno al punto medio.
4. Regolare le dimensioni del passo o il numero di sezioni come desiderato.
5. Acquisisci l'immagine e salva il file originale, nonché esportalo come file TIFF o altro formato desiderato.

5. Analisi delle immagini

1. Utilizzare il software di analisi delle immagini preferito (Table of Materials) per regolare la luminosità e il contrasto in ogni canale fino a ottenere una chiarezza ottimale sia nelle singole immagini che nel rendering tridimensionale dello stack z.
   NOTA: Se la dimensione del passo selezionata è sufficientemente piccola, è possibile eseguire anche la deconvoluzione 3D per migliorare il segnale.

Risultati

Le retine modificate elaborate con CLARITY sono tessuti otticamente trasparenti.
Per formulare un metodo di compensazione dei tessuti compatibile con le applicazioni immunoistochimiche nella retina, fornendo al contempo un'adeguata delipidazione e mantenendo l'integrità strutturale delle proteine cellulari, abbiamo adattato il metodo di compensazione dei tessuti CLARITY alle retine di topo montate su intero. Siamo stati in grado di semplificare il protocollo e modificarlo per le retine a montaggio in...

Discussione

Modifica del protocollo CLARITY per retine a montaggio intero.
Abbiamo semplificato il protocollo CLARITY per ottenere un'adeguata polimerizzazione senza la necessità di una camera di evacuazione o essiccazione sottovuoto, come viene utilizzato nella maggior parte^{degli studi precedenti 7,9,11}. Il processo di polimerizzazione è inibito dall'ossigeno, richiedendo che il campione sia isolato dall'aria durante ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Fixative
Acrylamide	Fisher Biotech	BP170	Hydrogel monomer
Axio Imager.Z2	Zeiss		Fluorscence microscope
BSA	Fisher Scientific	BP1600	Blocking agent
Eclipse Ti	Nikon Instruments		Scanning confocal microscope
KCl	VWR	BDH0258	Buffer component
KH2PO4	Sigma	P5655	Buffer component
Na2HPO4	Sigma Aldrich	S9763	Buffer component
NaCl	Sigma Aldrich	S7653	Buffer component
NaH2PO4	Sigma Aldrich	S0751	Buffer component
NaN3	Sigma Aldrich	S2002	Bacteriostatic preservative
NDS	Aurion	900.122	Blocking agent
NIS Elements AR	Nikon		Image analysis software
SDS	BioRad	1610301	Delipidation agent
Sorbitol	Sigma Aldrich	51876	Buffer component
Triton-X-100	Sigma	T8787	Surfactant
Tween-20	Fisher Scientific	BP337	Surfactant
VA-044	Wako Chemicals	011-19365	Thermal initiator