Immunfärbung von Whole-Mount-Netzhäuten mit der CLARITY Tissue Clearing Methode

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll zur Anpassung der CLARITY-Methode des Hirngewebes für ganzklächige Netzhäute vor, um die Qualität der immunhistochemischen Standardfärbung und hochauflösenden Bildgebung von Netzhautneuronen und ihren subzellulären Strukturen zu verbessern.

Zusammenfassung

Die Gewebehydrogel-Delipidationsmethode (CLARITY), die ursprünglich vom Deisseroth-Labor entwickelt wurde, wurde modifiziert und häufig für die Immunfärbung und Bildgebung dicker Gehirnproben verwendet. Diese fortschrittliche Technologie wurde jedoch noch nicht für ganz montierte Netzhäute verwendet. Obwohl die Netzhaut teilweise transparent ist, begrenzt ihre Dicke von etwa 200 μm (bei Mäusen) immer noch das Eindringen von Antikörpern in das tiefe Gewebe und reduziert die Lichtdurchdringung für hochauflösende Bildgebung. Hier haben wir die CLARITY-Methode für ganz montierte Maus-Netzhäute angepasst, indem wir sie mit einem Acrylamidmonomer zu einem nanoporösen Hydrogel polymerisiert und dann in Natriumdodecylsulfat räten, um den Proteinverlust zu minimieren und Gewebeschäden zu vermeiden. CLARITY-verarbeitete Netzhäute wurden mit Antikörpern für Netzhautneuronen, Gliazellen und synaptische Proteine immungefärbt, in einer Brechungsindex-Matching-Lösung montiert und abgebildet. Unsere Daten zeigen, dass CLARITY die Qualität der immunhistochemischen Standardfärbung und Bildgebung für Netzhautneuronen und Gliazellen in der Ganzkörperpräparation verbessern kann. So wurde beispielsweise die 3D-Auflösung feiner axonartiger und dendritischer Strukturen dopaminerger Amakrinzellen durch CLARITY deutlich verbessert. Im Vergleich zu nicht verarbeiteten Ganzkörper-Netzhäuten kann CLARITY eine Immunfärbung für synaptische Proteine wie postsynaptisches Dichteprotein 95 aufdecken. Unsere Ergebnisse zeigen, dass CLARITY die Netzhaut nach der Entfernung von Lipiden optisch transparenter macht und feine Strukturen von Netzhautneuronen und deren Proteinen bewahrt, die routinemäßig zur hochauflösenden Abbildung von Netzhautneuronen und ihren subzellulären Strukturen in der Ganzlagervorbereitung verwendet werden können.

Einleitung

Die Netzhaut von Wirbeltieren ist vielleicht der zugänglichste Teil des zentralen Nervensystems (ZNS) und dient als hervorragendes Modell für die Untersuchung der Entwicklung, Struktur und Funktion des Gehirns. Fünf Klassen von Neuronen in der Netzhaut sind in drei Kernschichten verteilt, die durch zwei plexiforme Schichten getrennt sind. Die äußere Kernschicht (ONL) besteht aus klassischen Photorezeptoren (Stäbchen und Zapfen), die Licht in elektrische Signale umwandeln. Elektrische Signale werden von Neuronen in der inneren Kernschicht (INL), einschließlich bipolarer, horizontaler und amakriner Zellen, verarbeitet und dann an retinale Ganglienzellen (RGCs) in der Ganglienzellschicht (GCL) übertragen. RGCs sind die Ausgangsneuronen der Netzhaut, wobei die Axone auf das Gehirn projizieren, um zur bildbildenden und nicht bildbildenden visuellen Funktion beizutragen. Darüber hinaus versorgen drei Arten von Gliazellen (Müllerzellen, Astroglia und Mikroglia) Neuronen mit Nährstoffen und schützen Neuronen vor schädlichen Veränderungen in ihrer extrazellulären Umgebung.

Eine spezialisierte Subpopulation von amakrinen Zellen produziert und setzt Dopamin frei, einen wichtigen Neuromodulator im ZNS, der die neuronalen Schaltkreise der Netzhaut während der Lichtanpassung neu konfiguriert^1,2. Dopaminerge Amakrinzellen (DACs) haben eine einzigartige Eigenschaft morphologischer Profile. Ihre Somata befinden sich im proximalen INL mit Dendriten, die sich im distalsten Teil der inneren plexiformen Schicht (IPL) verzweigen. Axonähnliche Prozesse von DACs sind unmyeliniert, dünn und lang, spärlich verzweigt und tragen Krampfadern (die Stellen der Dopaminfreisetzung). Sie bilden einen dichten Plexus mit Dendriten im IPL, einschließlich ringförmiger Strukturen um die Somata von AII-Amakrinzellen. Die Axone verlaufen auch durch das INL in Richtung OPL und bilden einen Zentrifugalweg über die Netzhaut³. Wir haben gezeigt, dass DAC-Prozesse Rezeptoren als Reaktion auf die Freisetzung von Glutamat aus präsynaptischen Neuronen, einschließlich bipolarer Zellen und intrinsisch lichtempfindlicher retinaler Ganglienzellen (ipRGCs)^{exprimieren 4,5,6}. Es ist jedoch unklar, ob Glutamatrezeptoren auf die Axone, Dendriten oder beides exprimieren, da sie in vertikalen Netzhautabschnitten abgeschnitten sind und nicht voneinander unterschieden werden können^5,6. Die Immunfärbung muss in ganzgedeckten Netzhäuten durchgeführt werden, um eine dreidimensionale Verzweigung von DACs und das Vorhandensein von Glutamatrezeptoren auf subzellulären Kompartimenten aufzudecken. Obwohl die Netzhaut relativ transparent ist, beträgt die Dicke einer Maus-Netzhaut etwa 200 μm, was das Eindringen von Antikörpern in das tiefe Gewebe begrenzt und die Lichtdurchdringung für hochauflösende Bildgebung aufgrund der Gewebelichtstreuung reduziert. Um diese Einschränkungen zu überwinden, haben wir die immunstaining-kompatible Gewebehydrogel-Delipidationsmethode (CLARITY) angepasst, die kürzlich für dicke Hirnschnitte entwickelt wurde, um die Netzhaut der Maus ganz zu montieren⁷.

Die CLARITY-Methode wurde ursprünglich vom Deisseroth-Labor zur Immunfärbung und Bildgebung dicker Hirnproben entwickelt⁷. Es verwendet ein starkes Reinigungsmittel, Natriumdodecylsulfat (SDS) und Elektrophorese, um die Lipidkomponenten (die Gewebelichtstreuung verursachen) zu entfernen und die Proteine und Nukleinsäuren an Ort und Stelle zu lassen. Die entfernten Lipide werden durch ein transparentes Gerüst aus Hydrogelmonomeren wie Acrylamid ersetzt, um die verbleibende Proteinstruktur zu unterstützen. Das gereinigte Gewebe kann immunhistochemisch markiert und mit deutlich erhöhter Lichteindringtiefe durch das Gewebe (bis zu mehreren Millimeter unter der Gewebeoberfläche) abgebildet werden. Seitdem wurde die CLARITY-Methode von mehreren Forschungsgruppen 8 ,^9,10optimiert und vereinfacht. Ein modifiziertes CLARITY-Protokoll verwendet eine passive Clearing-Technik, um die möglichen Gewebeschäden zu vermeiden, die durch Elektrophorese zur Beseitigung des gesamten Gehirns und anderer intakter Organe verursacht werden¹¹. Diese Methode wurde jedoch noch nicht auf ganz montierte Netzhäute angewendet. Hier haben wir die passive CLARITY-Technik für Ganzkörper-Netzhäute angepasst, um sie für die Immunhistochemie und Bildgebung transparenter zu machen. Wir fanden heraus, dass ein Großteil der getesteten Netzhautproteine während dieses Prozesses für die Immunhistochemie erhalten blieb. Mit der Brechungsindex-Matching-Lösung konnten wir Netzhautneuronen über die etwa 200 μm Dicke von der ONL bis zur GCL in ganz montierten Netzhäuten abbilden.

Protokoll

Die Mauspflege und alle experimentellen Verfahren wurden gemäß den Richtlinien der National Institutes of Health für Labortiere durchgeführt und von den Institutional Animal Care and Use Committees der Oakland University genehmigt (Protokoll Nr. 18071).

HINWEIS: Die Namen der Lösungen und ihre Zusammensetzungen sind in Tabelle 1aufgeführt.

1. Gewebevorbereitung

1. Euthanisieren Sie die Maus mit einer Überdosis CO₂, gefolgt von zervikaler Dislokation.
2. Die Augen mit einer gekrümmten Zette verschließen und in eine kleine Petrischale mit 0,1 M PBS überführen (Tabelle 1). Unter einem Seziermikroskop mit einer Nadel ein kleines Loch entlang der Hornhaut-Sklera-Verbindung stechen. 1 Stunde lang auf 4% Paraformaldehyd (PFA) übertragen.
3. Übertragen Sie das Auge zurück auf eine Schüssel mit PBS. Verwenden Sie unter einem Seziermikroskop eine Dissektionsschere, um den ganzen Weg um die Hornhaut-Sklera-Verbindung zu schneiden. Hornhaut und Linse entfernen. Schneiden Sie an der Basis des Sehnervs und schälen Sie die Sklera vorsichtig mit einer Zette ab, um die Netzhaut zu isolieren.
4. Machen Sie vier kleine Schnitte gleichmäßig um die Netzhaut und verwenden Sie eine feine Spitzenbürste, die in PBS getaucht ist, um sie flach (GCL-Seite nach unten) in einer kleeartigen Form auf einen kleinen quadratischen Schnitt aus Nitrocellulose-Filterpapier zu legen, um die Netzhaut zu stabilisieren.
5. Übertragen Sie die Netzhaut mit einer Zette, um die Ecke des Nitrocellulosepapiers zu halten (ohne die montierte Netzhaut zu berühren) und legen Sie sie für 1 Stunde in eine 48-Well-Platte mit 4% PFA.
6. Filterpapier und Netzhaut mit PBS in einen Brunnen geben und waschen (3x für je 5 min).
7. Auf A4P0 (Tabelle 1) umstellen und über Nacht bei 4 °C unter sanftem Rühren inkubieren.
8. Pipette Pflanzenöl in den Brunnen, um die A4P0-Lösung vollständig abzudecken. Inkubieren Sie in einem Wasserbad bei 40 °C für 3 Stunden ohne Schütteln.
9. Waschen Sie (3x für jeweils 5 min) in PBS und stellen Sie sicher, dass das gesamte Öl abgespült wurde. Verwenden Sie bei Bedarf ein Pipett, um das verbleibende Öl vor dem letzten Spülen vorsichtig von der Oberseite des Bohrplatzes zu entfernen.
10. Inkubieren Sie in 10% SDS bei 40 °C für zwei Tage unter sanftem Schütteln. Ersetzen Sie SDS am zweiten Tag durch eine frische Lösung.
11. Filterpapier und Netzhaut mit Triton-X-100 (PBST, Tabelle 1)auf PBS übertragen und waschen (5x für je 1,5 h).
12. Bei 4 °C in PBST mit 0,01% Natriumazid_{(NaN3) lagern}oder direkt zur Immunfärbung übergehen.

2. Immunfärbung und Brechungsindex-Matching

1. Entfernen Sie die Netzhaut vom Filterpapier, indem Sie sie vorsichtig mit einem feinen Spitzenpinsel in PBST abziehen.
2. Inkubieren Sie die Netzhaut in primärem Antikörper (Tabelle 2) verdünnt in Blocklösung (Tabelle 1) für 2 Tage bei 40 °C unter sanftem Schütteln.
3. Waschen (5x, je 1,5 h) in PBST.
4. Mit den entsprechenden sekundären Antikörpern (Tabelle 3) in Blockierungslösung verdünnt für 2 Tage bei 40 °C unter sanftem Schütteln inkubieren und während des restlichen Verfahrens vor Licht schützen.
5. Waschen (5x, je 1,5 h) in 0,02 M Phosphatpuffer (siehe Tabelle 1).
6. Inkubieren Sie in Sorbit-basierter Refractive Index Matching Solution (sRIMS, siehe Tabelle 1)bei 40 °C über Nacht unter sanftem Schütteln.

3. Montage

1. Umreißen Sie einen 18 mm x 18 mm x 1,5 mm großen Glasdeckel mit einem feinen Permanentmarker, um eine quadratische Grenze auf der Rückseite eines Glasmikroskopobjektträgers zu markieren.
2. Drehen Sie den Schieber um und verwenden Sie eine Spritze, um die Grenze mit einer dünnen Linie silikonfett auf der Vorderseite des Schlittens zu verfolgen, wobei ein kleiner Spalt in einer Ecke für überschüssige Montagelösung bleibt.
3. Die Netzhaut in die Mitte des begrenzten Bereichs übertragen und mit einem Feinspitzenpinsel so anordnen, dass sie flach mit der Photorezeptorseite gegen den Glasträger liegt.
4. Pipette ca. 60 μL sRIMS, so dass es die abgeflachte Netzhaut bedeckt und sich bis zu einer Ecke des Gehäuses erstreckt, wobei darauf geachtet wird, dass die Netzhaut flach und an Ort und Stelle bleibt.
5. Tragen Sie den Abdeckverschluss ab der Ecke mit dem sRIMS auf und senken Sie ihn langsam ab, bis er das Fett auf allen Seiten berührt, wodurch die Bildung von Luftblasen vermieden wird.
6. Platzieren Sie einen Stapel von 3 Abdecklippen auf jeder Seite der montierten Netzhaut als Abstandhalter. Verwenden Sie die lange Kante eines anderen Schlittens, um den Abdeckrutsch nach unten zu drücken, so dass die Halterung flach und gleichmäßig ist.
7. Dias flach bei 4 °C bis zur Bildgebung aufbewahren.

4. Bildgebung

1. Bildproben entweder auf einem herkömmlichen Fluoreszenzmikroskop oder einem konfokalen Mikroskop (Materialverzeichnis). Beginnen Sie, indem Sie den Objektträger auf den Mikroskopstand legen und die Probe lokalisieren.
   HINWEIS: Wenn ein invertiertes Objektivmikroskop verwendet wird, legen Sie den Objektträger kopfüber auf die Bühne und stellen Sie zunächst sicher, dass die exponierten Bereiche des Objektträgers frei von Silikonfett und Montagelösung sind.
2. Um z-gestapelte Bilder von co-markierten Proben zu erhalten, konzentrieren Sie sich zunächst auf das Signal in jedem Kanal einzeln und stellen Sie die Belichtungszeit bzw. Scangeschwindigkeit für Fluoreszenz- bzw. Konfokalmikroskope ein.
3. Legen Sie den Bereich für den Z-Stapel fest, indem Sie entweder die Fokusebene oben und unten im gewünschten Bereich manuell einstellen oder indem Sie den Mittelpunkt festlegen und dann einen Bereich um den Mittelpunkt angeben.
4. Passen Sie die Schrittgröße oder die Anzahl der Slices wie gewünscht an.
5. Erfassen Sie das Bild und speichern Sie die Originaldatei sowie exportieren Sie sie als TIFF-Datei oder ein anderes gewünschtes Format.

5. Bildanalyse

1. Verwenden Sie die Bildanalysesoftware Ihrer Wahl (Table of Materials), um die Helligkeit und den Kontrast in jedem Kanal anzupassen, bis sowohl in den Einzelbildern als auch im 3-dimensionalen Rendering des Z-Stacks eine optimale Klarheit erreicht ist.
   HINWEIS: Wenn die gewählte Schrittgröße ausreichend klein ist, kann auch eine 3D-Dekonvolution durchgeführt werden, um das Signal zu verbessern.

Ergebnisse

Modifizierte CLARITY-verarbeitete Netzhäute sind optisch transparentes Gewebe.
Um eine Gewebereinigungsmethode zu formulieren, die mit immunhistochemischen Anwendungen in der Netzhaut kompatibel ist und gleichzeitig eine ausreichende Entspeiung bietet und die strukturelle Integrität der zellulären Proteine beibehält, haben wir die CLARITY-Gewebereinigungsmethode an die Netzhaut von Mäusen angepasst. Wir konnten das Protokoll vereinfachen und für ganz montierte Netzhäute modifizieren (siehe Prot...

Diskussion

Modifikation des CLARITY-Protokolls für Ganzhaut.
Wir haben das CLARITY-Protokoll vereinfacht, um eine angemessene Polymerisation zu erreichen, ohne dass eine Vakuumevakuierungs- oder Austrocknungskammer erforderlich ist, wie es in den meisten früheren Studien verwendet wird^7,9,11. Der Polymerisationsprozess wird durch Sauerstoff gehemmt, so dass die Probe während des Polymerisationsschritts des Protokolls...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Fixative
Acrylamide	Fisher Biotech	BP170	Hydrogel monomer
Axio Imager.Z2	Zeiss		Fluorscence microscope
BSA	Fisher Scientific	BP1600	Blocking agent
Eclipse Ti	Nikon Instruments		Scanning confocal microscope
KCl	VWR	BDH0258	Buffer component
KH2PO4	Sigma	P5655	Buffer component
Na2HPO4	Sigma Aldrich	S9763	Buffer component
NaCl	Sigma Aldrich	S7653	Buffer component
NaH2PO4	Sigma Aldrich	S0751	Buffer component
NaN3	Sigma Aldrich	S2002	Bacteriostatic preservative
NDS	Aurion	900.122	Blocking agent
NIS Elements AR	Nikon		Image analysis software
SDS	BioRad	1610301	Delipidation agent
Sorbitol	Sigma Aldrich	51876	Buffer component
Triton-X-100	Sigma	T8787	Surfactant
Tween-20	Fisher Scientific	BP337	Surfactant
VA-044	Wako Chemicals	011-19365	Thermal initiator