Иммуноокрашивание цельно-маунтных сетчаток с помощью метода очистки тканей CLARITY

Резюме

Здесь мы представляем протокол адаптации метода CLARITY тканей мозга для цельномонтных сетчаток для улучшения качества стандартного иммуногистохимического окрашивания и визуализации с высоким разрешением нейронов сетчатки и их субклеточных структур.

Аннотация

Метод делипидации тканевого гидрогеля (CLARITY), первоначально разработанный лабораторией Дейссерота, был модифицирован и широко используется для иммуноокрашения и визуализации толстых образцов мозга. Однако эта передовая технология еще не использовалась для цельномонтных сетчаток. Хотя сетчатка частично прозрачна, ее толщина примерно 200 мкм (у мышей) по-прежнему ограничивает проникновение антител в глубокие ткани, а также уменьшает проникновение света для визуализации с высоким разрешением. Здесь мы адаптировали метод CLARITY для цельномонтовых сетчаток мышей, полимеризовав их акриламидным мономером с образованием нанопористого гидрогеля, а затем очистив их в додецилсульфате натрия, чтобы свести к минимуму потерю белка и избежать повреждения тканей. Обработанные CLARITY сетчатки были иммуноокражены антителами к нейронам сетчатки, глиальным клеткам и синаптическим белкам, установлены в растворе, соответствующем индексу преломления, и визуалированы. Наши данные показывают, что CLARITY может улучшить качество стандартного иммуногистохимического окрашивания и визуализации нейронов сетчатки и глиальных клеток при подготовке к целому по креплению. Например, 3D-разрешение тонких аксоноподобных и дендритных структур дофаминергических амакриновых клеток было значительно улучшено CLARITY. По сравнению с необработанными цельномонтными сетчатками, CLARITY может выявить иммуноокрашивание синаптических белков, таких как белок постсинаптической плотности 95. Наши результаты показывают, что CLARITY делает сетчатку более оптически прозрачной после удаления липидов и сохраняет тонкие структуры нейронов сетчатки и их белков, которые могут обычно использоваться для получения визуализации нейронов сетчатки и их субклеточных структур с высоким разрешением при подготовке к целому монтажу.

Введение

Сетчатка позвоночных является, пожалуй, наиболее доступной частью центральной нервной системы (ЦНС), и она служит отличной моделью для изучения развития, структуры и функции мозга. Пять классов нейронов в сетчатке распределены в трех ядерных слоях, разделенных двумя плексиформными слоями. Внешний ядерный слой (ONL) состоит из классических фоторецепторов (стержней и колбочка), которые преобразуют свет в электрические сигналы. Электрические сигналы обрабатываются нейронами во внутреннем ядерном слое (INL), включая биполярные, горизонтальные и амакриновые клетки, а затем передаются в ганглиоцитные клетки сетчатки (RGCs) в ганглиевом клеточном слое (GCL). RGC являются выходными нейронами сетчатки, при этом аксоны проецируются на мозг, чтобы способствовать формированию изображения и не-образующей визуальные функции. Кроме того, три типа глиальных клеток (клетки Мюллера, астроглия и микроглия) обеспечивают нейроны питательными веществами и защищают нейроны от вредных изменений в их внеклеточной среде.

Одна специализированная субпопуляция амакриновых клеток продуцирует и высвобождает дофамин, важный нейромодулятор в ЦНС, реконфигурируемый нейронные цепи сетчатки во время световой адаптации^1,2. Дофаминергические амакриновые клетки (ЦАП) обладают уникальной особенностью морфологических профилей. Их соматы расположены в проксимальном INL с дендритами, разветвляющимися в самой дистальной части внутреннего плексиформного слоя (IPL). Аксоноподобные процессы ЦАП немиелиновые, тонкие и длинные, редко разветвленные и несут варикозное расширение вен (места высвобождения дофамина). Они образуют плотное сплетение с дендритами в IPL, включая кольцеподобные структуры вокруг соматов амакриновых клеток AII. Аксоны также проходят через INL к OPL, образуя центробежный путь через сетчатку^3. Мы продемонстрировали, что процессы DAC экспрессируют рецепторы в ответ на высвобождение глутамата из пресинаптических нейронов, включая биполярные клетки и внутренне светочувствительные ганглиозные клетки сетчатки (ipRGCs)^4,5,6. Однако неясно, экспрессируются ли глутаматные рецепторы на аксонах, дендритах или на обоих, поскольку они отрезаны в вертикальных срезах сетчатки и не могут быть отличимы друг от друга^5,6. Иммуноокрашивание необходимо проводить в цельномонтных сетчатках, чтобы выявить трехмерное разветвление ЦАП и наличие глутаматных рецепторов на субклеточных компартментах. Хотя сетчатка относительно прозрачна, толщина сетчатки с целым креплением мыши составляет примерно 200 мкм, что ограничивает проникновение антител в глубокие ткани, а также уменьшает проникновение света для визуализации с высоким разрешением из-за рассеяния света в тканях. Чтобы преодолеть эти ограничения, мы адаптировали иммуноокрашающий совместимый метод делипидации тканевых гидрогелей (CLARITY), разработанный недавно для толстых участков мозга, к цельной сетчатке мыши^7.

Метод CLARITY был первоначально разработан лабораторией Дейссерота для иммуноокрашения и визуализации толстых образцов мозга^7. Он использует сильное моющее средство, додецилсульфат натрия (SDS) и электрофорез для удаления липидных компонентов (которые вызывают рассеяние света в тканях), оставляя белки и нуклеиновые кислоты на месте. Удаленные липиды заменяются прозрачным каркасом, состоящим из гидрогелевых мономеров, таких как акриламид, для поддержки оставшейся белковой структуры. Очищенная ткань может быть помечена с помощью иммуногистохимии и визуалирована с существенно увеличенной глубиной проникновения света через ткань (до нескольких миллиметров ниже поверхности ткани). С тех пор метод CLARITY был оптимизирован и упрощен несколькими исследовательскими группами^8,9,10. Модифицированный протокол CLARITY использует пассивную технику очистки, чтобы избежать возможного повреждения тканей, вызванного электрофорезом для очистки всего мозга и других неповрежденных органов^11. Однако этот метод еще не применялся к цельномонтным сетчаткам. Здесь мы адаптировали пассивную технику CLARITY для цельномонтных сетчаток, чтобы сделать их более прозрачными для иммуногистохимии и визуализации. Мы обнаружили, что большинство протестированных белков сетчатки были сохранены во время этого процесса иммуногистохимии. Используя решение для сопоставления показателей преломления, мы смогли получить изображение нейронов сетчатки толщиной около 200 мкм от ONL до GCL в цельных сетчатках.

протокол

Уход за мышами и все экспериментальные процедуры проводились в соответствии с руководящими принципами Национального института здравоохранения для лабораторных животных и были одобрены институциональными комитетами по уходу за животными и их использованию в Оклендском университете (протокол No 18071).

ПРИМЕЧАНИЕ: Названия растворов и их составы приведены в таблице 1.

1. Тканевая подготовка

1. Усыпить мышь при передозировке_СО2с последующим вывихом шейки матки.
2. Энуклеазируют глаза изогнутыми щипцами и переносят их в небольшую чашку Петри с 0,1 М PBS(таблица 1). Под рассеченным микроскопом проткните иглой небольшое отверстие вдоль соединения роговицы-склеры. Перевести до 4% параформальдегида (ПФА) в течение 1 ч.
3. Перенесите глаз обратно к блюду с PBS. Под микроскопом для рассечения используйте ножницы для рассечения, чтобы разрезать весь путь вокруг соединения роговицы и склеры. Удалите роговицу и хрусталик. Обрежьте у основания зрительного нерва и аккуратно отклейте склеру щипцами, чтобы изолировать сетчатку.
4. Сделайте четыре небольших разреза равномерно вокруг сетчатки и используйте тонкую кисть, смоченную в PBS, чтобы положить ее плоской (GCL стороной вниз) в клеверной форме на небольшом квадратном срезе из нитроцеллюлозной фильтровальной бумаги для стабилизации сетчатки.
5. Перенесите сетчатку с помощью щипцов, чтобы удерживать угол нитроцеллюлозной бумаги (не касаясь установленной сетчатки) и поместите ее в 48-ю колодезную пластину с 4% PFA в течение 1 часа.
6. Переложите фильтровальную бумагу и сетчатку в колодец с PBS и промыть (по 3 раза по 5 минут каждый).
7. Переложить на А4П0(табл. 1)и инкубировать в течение ночи при 4°С с мягким перемешиванием.
8. Пипетка растительного масла в скважину полностью покрывает раствор А4П0. Инкубировать на водяной бане при 40 °C в течение 3 часов без встряхивания.
9. Мойте (3 раза по 5 минут каждый) в PBS, убедившись, что все масло смыто. При необходимости используйте пипетку, чтобы аккуратно удалить оставшуюся нефть с верхней части скважины перед последним промывкой.
10. Инкубировать в 10% SDS при 40 °C в течение двух дней с легким встряхиванием. Замените SDS свежим раствором на второй день.
11. Перенесите фильтровальную бумагу и сетчатку на PBS с помощью Triton-X-100 (PBST, таблица 1)и промыть (по 5x по 1,5 ч).
12. Хранить при 4 °C в ПБСТ с 0,01% азида натрия (NaN₃₎или перейти непосредственно к иммуноокрашиву.

2. Соответствие иммуноокрашивания и показателя преломления

1. Извлеките сетчатку из фильтровальной бумаги, аккуратно отклеив ее тонкой щеткой в PBST.
2. Инкубировать сетчатку в первичных антителах(таблица 2),разведенных в блокирующем растворе(таблица 1)в течение 2 дней при 40 °С с легким встряхиванием.
3. Стирка (5x, 1,5 ч каждая) в PBST.
4. Инкубировать с соответствующими вторичными антителами(табл. 3),разбавляя в блокирующем растворе в течение 2 дней при 40 °С с легким встряхиванием и защищая от света в течение оставшейся части процедуры.
5. Промывка (5x, 1,5 ч каждая) в 0,02 М фосфатного буфера (см. Таблицу 1).
6. Инкубировать в растворе для согласования показателей преломления на основе сорбита (sRIMS, см. таблицу 1)при 40 °C в течение ночи с легким встряхиванием.

3. Монтаж

1. Очертите стеклянную крышку 18 мм x 18 мм x 1,5 мм с помощью постоянного маркера с тонким наконечником, чтобы отметить квадратную границу на задней части слайда стеклянного микроскопа.
2. Переверните слайд и используйте шприц, чтобы проследить границу тонкой линией силиконовой смазки на передней части слайда, оставив небольшой зазор в одном углу для избыточного монтажного раствора.
3. Перенесите сетчатку к центру ограниченной области и расположите кистью с тонким кончиком так, чтобы она ложилась плоской стороной фоторецептора на стеклянный слайд.
4. Пипетка примерно 60 мкл sRIMS так, чтобы она покрывала уплощенной сетчатки и распространялась на один угол корпуса, заботясь о том, чтобы сетчатка оставалась плоской и на месте.
5. Нанесите крышку, начиная с угла с помощью sRIMS, и медленно опустите ее, пока она не коснется смазки со всех сторон, избегая образования пузырьков воздуха.
6. Поместите стопку из 3 обложек с каждой стороны смонтированной сетчатки в качестве прокладки. Используйте длинный край другого слайда, чтобы нажать на крышку, чтобы крепление было плоским и ровным.
7. Храните слайды при 4 °C до тех пор, пока не будете выявить изображения.

4. Визуализация

1. Изображения образцов на обычном флуоресцентном микроскопе или конфокальном микроскопе(Таблица материалов). Начните с размещения слайда на ступень микроскопа и найдите образец.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если используется перевернутый объективный микроскоп, поместите затвор вверх ногами на сцену, сначала убедившись, что открытые области слайда очищены от всей силиконовой смазки и монтажного раствора.
2. Чтобы получить z-стекированные изображения совместно меченых образцов, сначала сосредоточьтесь на сигнале в каждом канале индивидуально и установите время экспозиции или скорость сканирования для флуоресцентных или конфокальных микроскопов, соответственно.
3. Установите диапазон для z-стека, либо вручную установив фокальную плоскость в верхней и нижней части требуемого диапазона, либо установив среднюю точку, а затем указав диапазон вокруг средней точки.
4. Отрегулируйте размер шага или количество фрагментов по желанию.
5. Захватите изображение и сохраните исходный файл, а также экспортируйте его в виде файла TIFF или другого желаемого формата.

5. Анализ изображений

1. Используйте программное обеспечение для анализа изображений по выбору(Таблица материалов)для регулировки яркости и контрастности в каждом канале до тех пор, пока не будет достигнута оптимальная четкость как в отдельных изображениях, так и в 3-мерном рендеринге z-стека.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если выбранный размер шага достаточно мал, 3D-деконволюция также может быть выполнена для усиления сигнала.

Результаты

Модифицированные сетчатки, обработанные CLARITY, представляют собой оптически прозрачную ткань.
Чтобы сформулировать метод очистки тканей, совместимый с иммуногистохимическими приложениями в сетчатке, обеспечивая при этом адекватную делипидацию и сохраняя структурную целос...

Обсуждение

Модификация протокола CLARITY для цельномонтных сетчаток.
Мы упростили протокол CLARITY для достижения адекватной полимеризации без необходимости вакуумной вакуумной эвакуации или сухой камеры, как это используется в большинстве предыдущих исследований^7,

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Fixative
Acrylamide	Fisher Biotech	BP170	Hydrogel monomer
Axio Imager.Z2	Zeiss		Fluorscence microscope
BSA	Fisher Scientific	BP1600	Blocking agent
Eclipse Ti	Nikon Instruments		Scanning confocal microscope
KCl	VWR	BDH0258	Buffer component
KH2PO4	Sigma	P5655	Buffer component
Na2HPO4	Sigma Aldrich	S9763	Buffer component
NaCl	Sigma Aldrich	S7653	Buffer component
NaH2PO4	Sigma Aldrich	S0751	Buffer component
NaN3	Sigma Aldrich	S2002	Bacteriostatic preservative
NDS	Aurion	900.122	Blocking agent
NIS Elements AR	Nikon		Image analysis software
SDS	BioRad	1610301	Delipidation agent
Sorbitol	Sigma Aldrich	51876	Buffer component
Triton-X-100	Sigma	T8787	Surfactant
Tween-20	Fisher Scientific	BP337	Surfactant
VA-044	Wako Chemicals	011-19365	Thermal initiator