Inmunostaining De Retinas De Montaje Completo Con El Método De Claro De Tejido CLARITY

Resumen

Aquí presentamos un protocolo para adaptar el método de la CLARIDAD de los tejidos cerebrales para las retinas del entero-montaje para mejorar la calidad de la coloración immunohistochemical estándar y de la proyección de imagen de alta resolución de neuronas retinianas y de sus estructuras subcelulares.

Resumen

El método de delipidación de hidrogel tisular (CLARITY), desarrollado originalmente por el laboratorio Deisseroth, ha sido modificado y ampliamente utilizado para la inmunotensación y la obtención de imágenes de muestras cerebrales gruesas. Sin embargo, esta tecnología avanzada aún no se ha utilizado para retinas de montaje completo. Aunque la retina es parcialmente transparente, su grosor de aproximadamente 200 μm (en ratones) todavía limita la penetración de anticuerpos en el tejido profundo, así como la reducción de la penetración de la luz para imágenes de alta resolución. Aquí, adaptamos el método CLARITY para retinas de ratón de montaje completo polimerizándolas con un monómero de acrilamida para formar un hidrogel nanoporoso y luego despejandolas en sulfato de dodecil sódico para minimizar la pérdida de proteínas y evitar daños tisulares. las retinas CLARIDAD-procesadas immunostained con los anticuerpos para las neuronas retinianas, las células glial, y las proteínas sinápticas, montadas en una solución que emparejaba del índice de refracción, e imagendas. Nuestros datos demuestran que la CLARIDAD puede mejorar la calidad de la coloración e proyección de imagen immunohistochemical estándar para las neuronas retinianas y las células glial en la preparación del entero-montaje. Por ejemplo, la resolución 3D de las estructuras ariíticas y axones finos de las células dopaminérgicas de amacrina fueron mejoradas mucho por CLARITY. En comparación con las retinas de montaje completo no procesadas, CLARITY puede revelar inmunotensión de proteínas sinápticas como la proteína de densidad postsináptica 95. Nuestros resultados muestran que la CLARIDAD hace la retina más ópticamente transparente después de la eliminación de lípidos y preserva las estructuras finas de las neuronas de la retina y sus proteínas, que se pueden utilizar rutinariamente para la obtención de imágenes de alta resolución de las neuronas de la retina y sus estructuras subcelulares en la preparación de montaje completo.

Introducción

La retina de los vertebrados es quizás la parte más accesible del sistema nervioso central (SNC), y sirve como un excelente modelo para estudiar el desarrollo, la estructura y la función del cerebro. Cinco clases de neuronas en la retina se distribuyen en tres capas nucleares separadas por dos capas plexiformes. La capa nuclear externa (ONL) consiste en fotorreceptores clásicos (varillas y conos) que convierten la luz en señales eléctricas. Las señales eléctricas son procesadas por las neuronas en la capa nuclear interna (INL), incluyendo las células bipolares, horizontales y amacrinas, y luego transmitidas a las células ganglionares de la retina (CRG) en la capa de células ganglionares (GCL). Los CRG son las neuronas de salida de la retina, con los axones que se proyectan hacia el cerebro para contribuir a la función visual formadora y no formadora de imágenes. Además, tres tipos de células gliales (células de Muller, astroglia y microglía) proporcionan nutrientes a las neuronas y protegen a las neuronas de los cambios dañinos en su entorno extracelular.

Una subpoblación especializada de células amacrinas produce y libera dopamina, un importante neuromodulador en el SNC, reconfigurando los circuitos neuronales de la retina durante la adaptación a la luz^1,2. Las células dopaminérgicas del amacrine (DAC) tienen una característica única de perfiles morfológicos. Sus somatas se localizan en el INL proximal con dendritas que se ramifican en la parte más distal de la capa plexiforme interna (IPL). Axón-como los procesos de DAC son unmyelinated, delgado y largo, escasamente ramificado, y varicosidades del oso (los sitios del lanzamiento de la dopamina). Forman un plexo denso con dendritas en el IPL, incluyendo estructuras en forma de anillo alrededor de la somata de las células amacrinas AII. Los axones también corren a través del INL hacia el OPL, formando una vía centrífuga a través de la retina^3. Hemos demostrado que dac procesa receptores expresos en respuesta a la liberación de glutamato de las neuronas presinápticas, incluyendo las células bipolares y las células ganglionares de la retina intrínsecamente fotosensibles (ipRGCs)^4,5,6. Sin embargo, no está claro si los receptores de glutamato se expresan en los axones, dendritas o ambos, ya que están cortados en secciones verticales de la retina y no se pueden distinguir entre sí^5,6. Immunostaining necesita ser realizado en retinas de montaje completo para revelar la ramificación tridimensional de DAC y la presencia de receptores del glutamato en compartimientos subcelulares. Aunque la retina es relativamente transparente, el grosor de una retina de montaje completo de ratón es de aproximadamente 200 μm, lo que limita la penetración de anticuerpos en el tejido profundo, así como reduce la penetración de la luz para imágenes de alta resolución debido a la dispersión de la luz del tejido. Para superar estas limitaciones, adaptamos el método de delipidación de hidrogel tisular compatible con inmunosuficiente (CLARITY) desarrollado recientemente para secciones cerebrales gruesas a retinas de ratón de montaje completo^7.

El método CLARITY fue desarrollado originalmente por el laboratorio Deisseroth para inmunosupertenimiento e imágenes de muestras cerebrales gruesas⁷. Utiliza un detergente fuerte, sulfato de dodecil sódico (SDS) y electroforesis para eliminar los componentes lipídicos (que causan la dispersión de la luz del tejido), dejando las proteínas y los ácidos nucleicos en su lugar. Los lípidos eliminados se reemplazan con un andamio transparente compuesto de monómeros de hidrogel como la acrilamida para apoyar la estructura proteica restante. El tejido despejado se puede etiquetar a través de inmunohistoquímica y tomar imágenes con una profundidad de penetración de luz sustancialmente mayor a través del tejido (hasta varios milímetros por debajo de la superficie del tejido). Desde entonces, el método CLARITY ha sido optimizado y simplificado por varios grupos de investigación^8,9,10. Un protocolo CLARITY modificado utiliza una técnica pasiva de limpieza para evitar el posible daño tisular producido por la electroforesis para limpiar todo el cerebro y otros órganos intactos¹¹. Sin embargo, este método todavía no se ha aplicado a las retinas de montaje completo. Aquí, adaptamos la técnica pasiva de la CLARIDAD para las retinas del entero-montaje para hacerlas más transparentes para immunohistochemistry y la proyección de imagen. Encontramos que preservaron a una mayoría de las proteínas retinianas probadas durante este proceso para immunohistochemistry. Utilizando la solución de coincidencia de índice de refracción, pudimos obtener imágenes de neuronas de la retina a través de los aproximadamente 200 μm de espesor de la ONL a la GCL en retinas de montaje completo.

Protocolo

El cuidado del ratón y todos los procedimientos experimentales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de los Institutos Nacionales de Salud para animales de laboratorio y fueron aprobados por los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Oakland (protocolo no. 18071).

Nota: Los nombres de las soluciones y sus composiciones se enumeran en la tabla 1.

1. Preparación de tejidos

1. Eutanasiar el ratón con una sobredosis de CO_2,seguida de dislocación cervical.
2. Enuclear los ojos con fórceps curvos y transferirlos a una pequeña placa de Petri con 0,1 M PBS (Tabla 1). Bajo un microscopio de disección, haga un pequeño agujero a lo largo de la unión córnea-esclerótica con una aguja. Transferencia al paraformadehído al 4% (PFA) durante 1 hora.
3. Transferir el ojo de nuevo a un plato con PBS. Bajo un microscopio de disección, use tijeras de disección para cortar todo el camino alrededor de la unión córnea-esclerótica. Retire la córnea y el cristalino. Corte en la base del nervio óptico y desprenda cuidadosamente la esclerótica con las autopsas para aislar la retina.
4. Haga cuatro pequeños cortes uniformemente alrededor de la retina y use un cepillo de punta fina sumergido en PBS para ponerlo plano (lado GCL hacia abajo) en forma de trébol en un pequeño corte cuadrado de papel de filtro de nitrocelulosa para estabilizar la retina.
5. Transfiera la retina usando fórceps para sostener la esquina del papel de nitrocelulosa (sin tocar la retina montada) y colóquela en una placa de 48 pocillos con 4% de PFA durante 1 hora.
6. Transfiera el papel de filtro y la retina a un pozo con PBS y lave (3x durante 5 min cada uno).
7. Transferir a A4P0 (Tabla 1) e incubar durante la noche a 4 °C con agitación suave.
8. Pipetee el aceite vegetal en el pozo para cubrir completamente la solución A4P0. Incubar en un baño de agua a 40 °C durante 3 horas sin agitar.
9. Lave (3x durante 5 minutos cada uno) en PBS, asegurándose de que todo el aceite se haya enjuagado. Si es necesario, use una pipeta para retirar cuidadosamente el aceite restante de la parte superior del pozo antes del último enjuague.
10. Incubar en SDS al 10% a 40 °C durante dos días con temblores suaves. Reemplace SDS con una solución nueva el segundo día.
11. Transferir el papel de filtro y la retina a PBS con Triton-X-100 (PBST, Tabla 1)y lavar (5x para 1,5 h cada uno).
12. Conservar a 4 °C en PBST con azida de sodio al 0,01% (NaN₃₎o pasar directamente a inmunotensoración.

2. Inmunosutención y correspondencia del índice de refracción

1. Retire la retina del papel de filtro desprendiéndolo suavemente con un cepillo de punta fina en PBST.
2. Incubar la retina en anticuerpo primario(Tabla 2)diluido en solución bloqueador(Tabla 1)durante 2 días a 40 °C con un suave temblor.
3. Lavar (5x, 1,5 h cada uno) en PBST.
4. Incubar con los anticuerpos secundarios apropiados(Tabla 3)diluido en solución de bloqueo durante 2 días a 40 °C con agitación suave y proteger de la luz durante el resto del procedimiento.
5. Lavar (5x, 1,5 h cada uno) en tampón de fosfato de 0,02 M (ver Tabla 1).
6. Incubar en solución de correspondencia de índice de refracción a base de sorbitol (sRIMS, ver Tabla 1)a 40 °C durante la noche con agitación suave.

3. Montaje

1. Delinee una cubierta de vidrio de 18 mm x 18 mm x 1,5 mm con un marcador permanente de punta fina para marcar un límite cuadrado en la parte posterior de un portaobjetos de microscopio de vidrio.
2. Voltee la diapositiva y use una jeringa para trazar el límite con una delgada línea de grasa de silicona en la parte frontal de la diapositiva, dejando un pequeño espacio en una esquina para que escape el exceso de solución de montaje.
3. Transfiera la retina al centro del área acotada y arregle con un cepillo de punta fina para que quede plano con el lado del fotorreceptor contra el portaobjetos de vidrio.
4. Pipetee aproximadamente 60 μL de sRIMS para que cubra la retina aplanada y se extienda hasta una esquina del recinto, cuidando que la retina se mantenga plana y en su lugar.
5. Aplique el cubrebocas a partir de la esquina con el sRIMS y baje lentamente hasta que toque la grasa por todos los lados, evitando la formación de burbujas de aire.
6. Coloque una pila de 3 cubrebocas a cada lado de la retina montada como espaciador. Utilice el borde largo de otra diapositiva para presionar hacia abajo la cubierta para que el montaje sea plano y uniforme.
7. Guarde los portaobjetos planos a 4 °C hasta la toma de imágenes.

4. Imágenes

1. Muestras de imagen en un microscopio de fluorescencia convencional o en un microscopio confocal(Tabla de materiales). Comience colocando el portaobjetos en la etapa del microscopio y localizando la muestra.
   NOTA: Si se está utilizando un microscopio objetivo invertido, coloque la corredera boca abajo en el escenario, primero asegurándose de que las áreas expuestas de la diapositiva estén despejadas de toda la grasa de silicona y la solución de montaje.
2. Para obtener imágenes apiladas en z de muestras co-etiquetadas, primero concéntrese en la señal en cada canal individualmente y establezca el tiempo de exposición o la velocidad de escaneo, para microscopios de fluorescencia o confocales, respectivamente.
3. Establezca el rango para la pila z estableciendo manualmente el plano focal en la parte superior e inferior del rango deseado, o estableciendo el punto medio y luego especificando un rango alrededor del punto medio.
4. Ajuste el tamaño del paso o el número de sectores como desee.
5. Capturar la imagen y guardar el archivo original, así como exportarlo como un archivo TIFF u otro formato deseado.

5. Análisis de imágenes

1. Utilice el software de análisis de imágenes de elección(Tabla de materiales)para ajustar el brillo y el contraste en cada canal hasta que se logre una claridad óptima tanto en las imágenes individuales como en la representación en 3 dimensiones de la pila z.
   NOTA: Si el tamaño de paso seleccionado es lo suficientemente pequeño, también se puede realizar la deconvolución 3D para mejorar la señal.

Resultados

Las retinas procesadas clarity modificadas son tejido ópticamente transparente.
Para formular un método de limpieza de tejido que es compatible con aplicaciones inmunohistoquímicas en la retina, mientras que proporciona una delipidación adecuada y la retención de la integridad estructural de las proteínas celulares, se adaptó el método de claro de tejido CLARITY para todo el monte de las retinas de ratón. Pudimos simplificar el protocolo y modificarlo para retinas de montaje completo (ver Pro...

Discusión

Modificación del protocolo CLARITY para las retinas de montaje completo.
Hemos simplificado el protocolo CLARITY para lograr una polimerización adecuada sin necesidad de una cámara de evacuación o desecación al vacío, como se utiliza en la mayoría de los estudios previos^7,9,11. El proceso de polimerización es inhibido por el oxígeno, requiriendo que la muestra sea aislada del aire durante la etapa de...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Fixative
Acrylamide	Fisher Biotech	BP170	Hydrogel monomer
Axio Imager.Z2	Zeiss		Fluorscence microscope
BSA	Fisher Scientific	BP1600	Blocking agent
Eclipse Ti	Nikon Instruments		Scanning confocal microscope
KCl	VWR	BDH0258	Buffer component
KH2PO4	Sigma	P5655	Buffer component
Na2HPO4	Sigma Aldrich	S9763	Buffer component
NaCl	Sigma Aldrich	S7653	Buffer component
NaH2PO4	Sigma Aldrich	S0751	Buffer component
NaN3	Sigma Aldrich	S2002	Bacteriostatic preservative
NDS	Aurion	900.122	Blocking agent
NIS Elements AR	Nikon		Image analysis software
SDS	BioRad	1610301	Delipidation agent
Sorbitol	Sigma Aldrich	51876	Buffer component
Triton-X-100	Sigma	T8787	Surfactant
Tween-20	Fisher Scientific	BP337	Surfactant
VA-044	Wako Chemicals	011-19365	Thermal initiator