使用清晰组织清除方法对全山视网膜进行免疫染色

摘要

在这里，我们提出了一个协议，以调整整个安装视网膜脑组织的CLARITY方法，以提高标准免疫化学染色和视网膜神经元及其细胞下结构的高分辨率成像的质量。

摘要

组织水凝胶脱皮法（CLARITY），最初由戴塞罗斯实验室开发，已被修改并广泛用于免疫染色和成像厚脑样本。然而，这种先进的技术尚未用于全山视网膜。虽然视网膜是部分透明的，但其厚度约为200微米（小鼠），仍然限制抗体渗透到深层组织，并降低高分辨率成像的光渗透。在这里，我们采用了CLARITY方法，用丙烯酰胺单体聚合，形成纳米多孔水凝胶，然后用硫酸钠清除它们，以尽量减少蛋白质损失，避免组织损伤。CLARITY处理的视网膜被视网膜神经元、胶质细胞和突触蛋白的抗体所感染，安装在折射指数匹配溶液中，并成像。我们的数据表明，CLARITY可以提高全安装制备中视网膜神经元和胶质细胞的标准免疫化学染色和成像的质量。例如，CLARITY 大大提高了多巴胺胺类阿米林细胞精细轴突状和树突状结构的 3D 分辨率。与非加工全山视网膜相比，CLARITY 可以揭示突触蛋白（如后突触密度蛋白 95）的免疫染色。我们的结果表明，在去除脂质后，CLARITY 使视网膜更加透明，并保留了视网膜神经元及其蛋白质的精细结构，这些结构可用于在全安装制备中获取视网膜神经元及其子细胞结构的高分辨率成像。

引言

脊椎动物直膜也许是中枢神经系统（CNS）中最容易接近的部分，是研究大脑发育、结构和功能的极好模型。网状膜中的五类神经元分布在三个核层中，由两个丛状层隔开。外核层（ONL）由将光转换成电信号的经典光感受器（棒和圆锥体）组成。电信号由内核层 （INL） 中的神经元处理，包括双极、水平和阿马林细胞，然后传输到结节细胞层 （GCL） 中的视网膜结节细胞 （RGCs）。RGC 是视网膜的输出神经元，轴突投射到大脑中，有助于图像形成和非图像形成的视觉功能。此外，三种类型的胶质细胞（穆勒细胞、天文胶质和微胶质）为神经元提供营养，并保护神经元免受细胞外环境的有害变化。

一种特殊的亚种群的阿马克莱细胞产生和释放多巴胺，在CNS中的重要神经调节器，重新配置视网膜神经回路在光适应^1，2。多巴胺胺性腺素细胞 （DACs） 具有形态特征的独特特征。他们的索玛塔位于近侧的 INL 中，树突在内丛状层 （IPL） 的最荒凉部分进行撞击。DAC 的Axon 样过程是未细化、薄而长、枝条稀疏且具有差异（多巴胺释放的部位）。它们与 IPL 中的树突形成密集的丛状物，包括围绕 AII amacrine 细胞的索马塔周围的环状结构。轴突也穿过 INL 向 OPL 运行，形成一条穿过视网膜³的离心通道。我们已经证明，DAC处理表达受体，以回应谷氨酸释放从前突性神经元，包括双极细胞和内在感光视网膜结节细胞（ipRGCs）4，5，6。然而，目前还不清楚谷氨酸受体是否表达在轴突上，树突上，或两者，因为它们被切断在垂直视网膜部分，不能区分彼此^5，6。需要在整个安装视网膜中进行免疫染色，以揭示 DAC 的三维分支和亚细胞隔间中谷氨酸受体的存在。虽然视网膜相对透明，但小鼠全坐骑视网膜的厚度约为 200 μm，这限制了抗体渗透到深层组织，并减少了组织光散射导致的高分辨率成像光渗透。为了克服这些限制，我们调整了免疫染色相容组织水凝胶脱脂方法（CLARITY）最近开发的厚脑部分到全安装小鼠视网膜^7。

CLARITY方法最初是由戴塞罗斯实验室开发的，用于免疫和成像厚脑样本^7。它使用强洗涤剂、硫酸钠 （SDS） 和电磷酸盐去除脂质成分（导致组织光散射），使蛋白质和核酸就位。去除的脂质被一个透明的脚手架所取代，该脚手架由丙烯酰胺等水凝胶单体组成，以支持剩余的蛋白质结构。清除的组织可以通过免疫化学进行标记，并通过组织（组织表面以下几毫米）显著增加光渗透深度进行成像。此后，由^8、9、10几个研究小组对CLARITY方法进行了优化和简化。修改后的CLARITY协议使用被动清除技术，以避免电泳可能产生的组织损伤，用于清除全脑和其他完整的器官^11。然而，这种方法尚未应用于全山视网膜。在这里，我们为全山视网膜采用了被动的CLARITY技术，使其在免疫化学和成像方面更加透明。我们发现，在免疫造血过程中，大多数被测试的视网膜蛋白都保存下来。使用折射指数匹配解决方案，我们能够在全山视网膜中从 ONL 到 GCL 的大约 200μm 厚度上对视网膜神经元进行成像。

研究方案

老鼠护理和所有实验程序都是根据国家卫生研究院关于实验室动物的指南进行的，并得到了奥克兰大学动物护理和使用机构委员会的批准（第18071号议定书）。

注:解决方案的名称及其组成列在 表1中。

1. 组织准备

1. 用过量_{的二氧化碳}对小鼠进行安乐死，然后是颈椎脱位。
2. 用弯曲的钳子使眼睛受洗，并将其转移到带有0.1 M PBS（表1）的小培养皿中。在解剖显微镜下，用针头在角膜-硬膜交界处戳一个小洞。转移到4%的甲醛（PFA）1小时。
3. 将眼睛移回带有 PBS 的菜。在解剖显微镜下，使用解剖剪刀在角膜-硬膜交界处一路切割。取出角膜和镜片。切开视神经底部，用钳子小心地剥去硬膜，以隔离视网膜。
4. 在视网膜周围均匀地进行四个小切口，并使用浸入 PBS 的细尖刷将其平整（GCL 侧向下），形成三叶草状形状，从硝基纤维素滤纸上切开一个小方块，以稳定视网膜。
5. 使用钳子转移网膜，以保持硝基纤维素纸的一角（不接触安装的网膜），并将其放置在48井板与4%PFA 1小时。
6. 将滤纸和网膜转移到带 PBS 的井中，然后洗涤（每次 3 次，每次 5 分钟）。
7. 转移到A4P0（表1），并在4°C的温和搅拌下在一夜之间孵化。
8. 派佩特植物油进入井中，完全覆盖A4P0溶液。在40°C的水浴中孵育3小时，无摇晃。
9. 在 PBS 中清洗（每次 3 次 5 分钟），确保所有油均被冲洗掉。如有必要，请使用管道在最后一次冲洗之前小心地从油井顶部取出剩余的油。
10. 在 40 °C 的 10% SDS 中孵化两天，轻轻摇晃。在第二天用新的解决方案替换 SDS。
11. 将滤纸和视网膜与 Triton-X-100 （PBST， 表 1）一起转移到 PBS 中，然后洗涤（每次 5 倍，每张 1.5 小时）。
12. 在PBST中储存4°C，含0.01%的钠（NaN_3），或直接移动到免疫染色。

2. 免疫染色和折射指数匹配

1. 用PBST中的细尖刷轻轻剥落，从滤纸中取出网膜。
2. 在阻塞溶液（表 1）中稀释的主要抗体 （表 2）中孵化 2 天，在 40 °C 下轻轻摇晃。
3. 在PBST中清洗（5倍，每个1.5小时）。
4. 在 40 °C 的阻塞溶液中用适当的二次抗体（表 3）稀释 2 天，轻轻摇晃，并通过剩余过程免受光线的照射。
5. 在 0.02 M 磷酸盐缓冲区中清洗 （5 倍，每个 1.5 小时）（见表 1）。
6. 在基于沙比妥的折射指数匹配解决方案 （sRIMS，参见 表 1）中孵化，在 40 °C 过夜，轻轻摇晃。

3. 安装

1. 勾勒出 18 mm x 18 mm x 1.5 mm 玻璃盖片，并带有细尖永久标记，以标记玻璃显微镜幻灯片背面的方形边界。
2. 翻转滑梯，使用注射器在滑梯正面用细细的硅胶油脂线追踪边界，在一个角落留下一个小缝隙，以便多余的安装溶液逸出。
3. 将网膜转移到边界区域的中心，并安排用细尖刷，使其平躺在照片受体侧对玻璃滑梯。
4. Pipette 大约 60μL 的 SRIMS，以便它覆盖扁平的网状网膜，并延伸到外壳的一角，注意网状网膜保持平整和到位。
5. 将盖片从角落与 SRIMS 一起涂抹，慢慢降低，直到它触及四面的油脂，避免形成气泡。
6. 将一叠 3 个盖片放在安装的网膜的每一侧作为垫片。使用另一张幻灯片的长边向下按下盖子，使坐骑是平的，均匀的。
7. 在成像前，将幻灯片平放到 4 °C。

4. 成像

1. 传统荧光显微镜或共聚焦显微镜（材料表）上的图像样本。首先将幻灯片放在显微镜舞台上并定位样品。
   注意:如果使用倒置的客观显微镜，请将幻灯片倒置在舞台上，首先确保滑梯的暴露区域远离所有硅胶油脂和安装溶液。
2. 要获取共同标记样品的 z 堆叠图像，请首先单独关注每个通道中的信号，并分别设置荧光或共焦显微镜的曝光时间或扫描速度。
3. 通过手动将焦距设置在所需范围的顶部和底部，或者设置中点，然后指定中点周围的范围，为 z 栈设置范围。
4. 根据需要调整步幅大小或切片数量。
5. 捕获图像并保存原始文件，并导出它作为 TIFF 文件或其他所需的格式。

5. 图像分析

1. 使用所选图像分析软件（材料表）调整每个通道的亮度和对比度，直到在单个图像和 z-stack 的三维渲染中实现最佳清晰度。
   注意:如果选定的步幅足够小，也可以执行 3D 下放以增强信号。

结果

经过修改的CLARE处理视网膜是光学透明组织。
为了制定一种与视网膜免疫生化应用相容的组织清除方法，同时提供足够的去皮化和保持细胞蛋白的结构完整性，我们采用了CLARITY组织清除方法，以全安装小鼠视网膜。我们能够简化协议并修改它为全安装视网膜（见协议）。在完成组织杂交、清除和折射索引匹配后，与非加工控制视网膜（图 1B）相比，使用此修?...

讨论

修改全安装视网膜的清晰协议。
我们已经简化了CLARITY协议，以实现足够的聚合，而无需真空疏散或干燥室，如大多数以前的研究^7，9，11所使用。聚合过程受到氧气的抑制，要求样品在协议的聚合步骤中从空气中分离。然而，我们发现，用油覆盖样品，而不是用氮气去气，从而充分隔离样品，使聚合在彻底冲洗?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Fixative
Acrylamide	Fisher Biotech	BP170	Hydrogel monomer
Axio Imager.Z2	Zeiss		Fluorscence microscope
BSA	Fisher Scientific	BP1600	Blocking agent
Eclipse Ti	Nikon Instruments		Scanning confocal microscope
KCl	VWR	BDH0258	Buffer component
KH2PO4	Sigma	P5655	Buffer component
Na2HPO4	Sigma Aldrich	S9763	Buffer component
NaCl	Sigma Aldrich	S7653	Buffer component
NaH2PO4	Sigma Aldrich	S0751	Buffer component
NaN3	Sigma Aldrich	S2002	Bacteriostatic preservative
NDS	Aurion	900.122	Blocking agent
NIS Elements AR	Nikon		Image analysis software
SDS	BioRad	1610301	Delipidation agent
Sorbitol	Sigma Aldrich	51876	Buffer component
Triton-X-100	Sigma	T8787	Surfactant
Tween-20	Fisher Scientific	BP337	Surfactant
VA-044	Wako Chemicals	011-19365	Thermal initiator