CLARITY Doku Temizleme Yöntemi ile Tüm Mount Retinaların İmmünasyonunun İmmünasyon

Özet

Burada, standart immünohistokimyasal lekelenme ve retina nöronlarının ve bunların hücre altı yapılarının yüksek çözünürlüklü görüntüleme kalitesini artırmak için beyin dokularının CLARITY yöntemini tam montajlı retinalara uyarlamak için bir protokol sunuyoruz.

Özet

Başlangıçta Deisseroth laboratuvarı tarafından geliştirilen doku hidrojel delipidasyon yöntemi (CLARITY), kalın beyin örneklerinin immünostainasyonu ve görüntülenmesi için değiştirilmiş ve yaygın olarak kullanılmıştır. Ancak, bu ileri teknoloji henüz tam montajlı retinalar için kullanılmamıştır. Retina kısmen şeffaf olmasına rağmen, yaklaşık 200 μm kalınlığı (farelerde) hala antikorların derin dokuya nüfuzunu sınırlar ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme için ışık penetrasyonunu azaltır. Burada, protein kaybını en aza indirmek ve doku hasarını önlemek için akrilamid monomer ile polimerleştirerek nanoporöz bir hidrojel oluşturmak ve daha sonra sodyum dodecyl sülfatta temizlemek için tüm mount fare retinaları için CLARITY yöntemini uyarladık. CLARITY ile işlenmiş retinalar, retina nöronları, glial hücreler ve sinaptik proteinler için antikorlarla immünostain edildi, kırılma indeksi eşleştirme çözeltisine monte edildi ve görüntülendi. Verilerimiz CLARITY'nin retina nöronları ve glial hücreler için standart immünohistokimyasal boyama ve görüntüleme kalitesini tam montajlı hazırlıkta artırabileceğini göstermektedir. Örneğin, dopaminerjik amakrin hücrelerin ince akson benzeri ve dendritik yapılarının 3D çözünürlüğü CLARITY tarafından çok daha iyi hale getirildi. İşlenmemiş tam montajlı retinalarla karşılaştırıldığında CLARITY, postinaptik yoğunluk proteini 95 gibi sinaptik proteinler için immünostaining ortaya çıkarabilir. Sonuçlarımız, CLARITY'nin lipitlerin çıkarılmasından sonra retinayı daha optik olarak şeffaf hale getirdiğini ve retina nöronlarının ve proteinlerinin ince yapılarını koruduğunu ve retina nöronlarının ve bunların hücre altı yapılarının tüm montajlı preparat içinde yüksek çözünürlüklü görüntülemesi için rutin olarak kullanılabileceğini göstermektedir.

Giriş

Omurgalı retina, merkezi sinir sisteminin (CNS) belki de en erişilebilir kısmıdır ve beynin gelişimini, yapısını ve işlevini incelemek için mükemmel bir model görevi görür. Retinadaki beş nöron sınıfı, iki pleksiform katmanla ayrılmış üç nükleer katmanda dağıtılır. Dış nükleer tabaka (ONL), ışığı elektrik sinyallerine dönüştüren klasik fotoreceptörlerden (çubuklar ve koniler) oluşur. Elektrik sinyalleri, bipolar, yatay ve amakrin hücreler de dahil olmak üzere iç nükleer tabakadaki (INL) nöronlar tarafından işlenir ve daha sonra ganglion hücre tabakasındaki (GCL) retinal ganglion hücrelerine (RGC' ler) iletilir. RGC'ler retinanın çıkış nöronlarıdır, aksonlar görüntü oluşturan ve görüntü oluşturmayan görsel işleve katkıda bulunmak için beyne yansıtır. Ek olarak, üç tür glial hücre (Muller hücreleri, astroglia ve mikroglia) nöronlara besin sağlar ve nöronları hücre dışı ortamlarındaki zararlı değişikliklerden korur.

Amakrin hücrelerinin özel bir alt nüfus, CNS'de önemli bir nöromodülatör olan dopamin üretir ve serbest bırakır, ışık adaptasyonu sırasında retinal sinir devrelerini yeniden yapılandırır^1,2. Dopaminerjik amakrin hücreler (DAC' ler) morfolojik profillerin benzersiz bir özelliğine sahiptir. Somataları proksimal INL'de bulunur ve dendritler iç pleksiform tabakanın (IPL) en distal kısmında ortaya çıkar. DAC'lerin akson benzeri süreçleri boyasız, ince ve uzun, seyrek dallıdır ve varikoziteleri taşır (dopamin salınım bölgeleri). AII amacrine hücrelerinin somata etrafındaki halka benzeri yapılar da dahil olmak üzere IPL'de dendritleri olan yoğun bir pleksus oluştururlar. Aksonlar ayrıca INL'den OPL'ye doğru ilerler ve retina³boyunca santrifüj bir yol oluşturur. DAC süreçlerinin, bipolar hücreler ve özünde ışığa duyarlı retina ganglion hücreleri (ipRGC'ler)⁴,^5,6dahil olmak üzere presynaptik nöronlardan glutamat salınımı yanıt olarak reseptörleri ifade ettiğini gösterdik. Bununla birlikte, glutamat reseptörlerinin aksonlar, dendritler veya her ikisi de dikey retina bölümlerinde kesildiğinden ve birbirinden ayırt edilemediğinden ifade edip etmediği belirsizdir^5,6. DAC'lerin üç boyutlu dallanmalarını ve hücre altı bölmelerde glutamat reseptörlerinin varlığını ortaya çıkarmak için tüm montajlı retinalarda immünostaining yapılması gerekir. Retina nispeten şeffaf olmasına rağmen, bir farenin tam montajlı retina kalınlığı yaklaşık 200 μm'dir, bu da antikorların derin dokuya nüfuz etmesini sınırlar ve doku ışığı saçılım nedeniyle yüksek çözünürlüklü görüntüleme için ışık penetrasyonunu azaltır. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, son zamanlarda kalın beyin bölümleri için geliştirilen immünostaining uyumlu doku hidrojel delipidasyon yöntemini (CLARITY) tüm montajlı fare retinalarına uyarladık⁷.

CLARITY yöntemi başlangıçta Kalın beyin örneklerinin immünostaining ve görüntüleme için Deisseroth laboratuvarı tarafından geliştirilmiştir⁷. Lipid bileşenlerini (doku ışığının saçılmasına neden olan) çıkarmak için proteinleri ve nükleik asitleri yerinde bırakarak güçlü bir deterjan, sodyum dodecyl sülfat (SDS) ve elektroforezi kullanır. Çıkarılan lipitler, kalan protein yapısını desteklemek için akrilamid gibi hidrojel monomerlerden oluşan şeffaf bir iskele ile değiştirilir. Temizlenen doku immünhistokimya ile etiketlenebilir ve doku boyunca önemli ölçüde artan ışık penetrasyon derinliği ile görüntülenebilir (doku yüzeyinin birkaç milimetre altına kadar). O zamandan beri CLARITY yöntemi birkaç araştırma grubu⁸, 9^,10tarafından optimize edilmiş ve basitleştirilmiştir. Değiştirilmiş bir CLARITY protokolü, tüm beyni ve diğer sağlam organları temizlemek için elektroforez tarafından üretilen olası doku hasarını önlemek için pasif bir temizleme tekniği kullanır¹¹. Ancak bu yöntem henüz tam mount retinalara uygulanmamıştır. Burada, pasif CLARITY tekniğini tüm mount retinalar için immünhistokinoloji ve görüntüleme için daha şeffaf hale getirmek için uyarladık. İmmünohistokinoloji için test edilen retina proteinlerinin çoğunluğunun bu süreçte korunduğunu tespit ettik. Kırma indeksi eşleştirme solüsyonını kullanarak, retina nöronlarını ONL'den GCL'ye kadar yaklaşık 200 μm kalınlığında tüm montajlı retinalarda görüntüleyebildik.

Protokol

Fare bakımı ve tüm deneysel prosedürler laboratuvar hayvanları için Ulusal Sağlık Enstitüleri yönergelerine göre yürütüldü ve Oakland Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri tarafından onaylandı (protokol no. 18071).

NOT: Çözümlerin adları ve kompozisyonları Tablo 1'de listelenmiştir.

1. Doku hazırlama

1. Fareyi aşırı dozda CO₂ile ötenazi , ardından servikal çıkık.
2. Gözleri kavisli tokmaklarla enükle edin ve 0,1 M PBS(Tablo 1)ile küçük bir petri kabına aktarın. Diseksiyon mikroskobu altında, kornea-sklera kavşağı boyunca küçük bir deliği bir iğne ile dürtün. 1 saat boyunca % 4 paraformaldehite (PFA) aktarın.
3. Gözü PBS'li bir tabağa geri aktarın. Diseksiyon mikroskobu altında, kornea-sklera kavşağının etrafını kesmek için diseksiyon makası kullanın. Korneayı ve lensi çıkarın. Optik sinirin tabanında kesin ve retinayı izole etmek için sklerayı dikkatlice ön ayaklarla soyun.
4. Retinanın etrafında eşit olarak dört küçük kesim yapın ve retinayı stabilize etmek için nitroselüloz filtre kağıdından küçük bir kare kesim üzerinde yonca benzeri bir şekle düz (GCL tarafı aşağı) koymak için PBS'ye batırılmış ince bir uç fırçası kullanın.
5. Nitroselüloz kağıdının köşesini tutmak için forseps kullanarak retinayı aktarın (monte retinaya dokunmadan) ve 1 saat boyunca% 4 PFA'ya sahip 48 kuyulu bir plakaya yerleştirin.
6. Filtre kağıdını ve retinayı PBS ile bir kuyuya aktarın ve yıkayın (her biri 5 dakika için 3x).
7. A4P0'ye (Tablo 1) aktarın ve hafif ajitasyonla 4 °C'de gece boyunca kuluçkaya yatırın.
8. Pipet bitkisel yağı, A4P0 çözeltisini tamamen örtmek için kuyuya. 40 °C'de bir su banyosunda 3 saat boyunca titreme olmadan kuluçkaya yatır.
9. PBS'de yıkayın (her biri 5 dakika için 3x), tüm yağın durulanmış olduğundan emin olun. Gerekirse, kalan yağı son durulamadan önce kuyunun üstünden dikkatlice çıkarmak için bir pipet kullanın.
10. Hafifçe sallanarak iki gün boyunca 40 °C'de% 10 SDS'de kuluçkaya yatırın. SDS'i ikinci gün yeni bir çözelti ile değiştirin.
11. Filtre kağıdını ve retinayı Triton-X-100 (PBST, Tablo 1) ve yıkama (her biri 1,5saat için 5x) ile PBS'ye aktarın.
12. PBST'de %0,01 sodyum azit (NaN₃₎ile 4 °C'de saklayın veya doğrudan immün yetinmeye geçin.

2. İmmünostaining ve kırılma indeksi eşleştirme

1. Retinayı PBST'de ince bir uç fırçasıyla hafifçe soyarak filtre kağıdından çıkarın.
2. Retinayı birincil antikorda(Tablo 2)bloke çözeltisinde seyreltilmiş (Tablo 1) 40 ° C'de 2 gün boyunca hafifçe sallanarak kuluçkaya yatırın.
3. PBST'de yıkayın (her biri 5x, 1,5 saat).
4. 40 °C'de 2 gün boyunca blokaj çözeltisinde seyreltilmiş uygun ikincil antikorlarla(Tablo 3)hafifçe sallanarak kuluçkaya yatırın ve prosedürün geri kalanı boyunca ışıktan koruyun.
5. 0,02 M fosfat tamponunda yıkayın (her biri 5x, 1,5 saat) (bkz. Tablo 1).
6. Sorbitol bazlı Kırılma İndeksi Eşleştirme Çözümünde (sRIMS, bkz. Tablo 1)gece boyunca 40 °C'de hafif titreme ile kuluçkaya yatırın.

3. Montaj

1. Cam mikroskop kaydırağının arkasında kare bir sınırı işaretlemek için ince uçlu kalıcı bir işaretleyici ile 18 mm x 18 mm x 1,5 mm cam kapakçık anahattı.
2. Kaydırağı ters çevirin ve slaydın önünde ince bir silikon gres çizgisiyle sınırı izlemek için bir şırınna kullanın, fazla montaj çözümünün kaçması için bir köşede küçük bir boşluk bırakın.
3. Retinayı sınırlanan alanın ortasına aktarın ve cam kaydırağın karşısında fotoreceptör tarafıyla düz olacak şekilde ince uçlu bir fırça ile düzenleyin.
4. Pipet yaklaşık 60 μL sRIMS, böylece düzleştirilmiş retinayı kaplar ve retinanın düz ve yerinde kalmasına dikkat ederek muhafazanın bir köşesine uzanır.
5. Köşeden başlayarak sRIMS ile kapak kapağını uygulayın ve hava kabarcıklarının oluşmasını önleyerek her taraftaki grese dokunana kadar yavaşça indirin.
6. Monte retinanın her iki tarafına aralayıcı olarak 3 kapaklı bir yığın yerleştirin. Başka bir slaydın uzun kenarını kullanarak kapak altlıklarına bastırın, böylece montaj düz ve eşit olacaktır.
7. Görüntülemeye kadar slaytları 4 °C'de düz bir şekilde saklayın.

4. Görüntüleme

1. Geleneksel floresan mikroskop veya konfokal mikroskop(Malzeme Tablosu)üzerinde görüntü örnekleri. Slaydı mikroskop aşamasına yerleştirerek ve numuneyi bularak başlayın.
   NOT: Ters nesnel mikroskop kullanılıyorsa, önce slaydın açık alanlarının tüm silikon gres ve montaj çözeltisinden arındırılmasını sağlayarak, slaytı sahne alanına baş aşağı yerleştirin.
2. Birlikte etiketlenmiş örneklerin z yığılmış görüntülerini elde etmek için, önce her kanaldaki sinyale ayrı ayrı odaklanın ve floresan veya konfokal mikroskoplar için pozlama süresini veya tarama hızını ayarlayın.
3. Odak düzlemini istediğiniz aralığın üst ve alt kısmına el ile ayarlayarak veya orta noktayı ayarlayıp orta noktanın etrafında bir aralık belirterek z yığınının aralığını ayarlayın.
4. Adım boyutunu veya dilim sayısını istediğiniz gibi ayarlayın.
5. Görüntüyü yakalayın ve orijinal dosyayı kaydedin ve bir TIFF dosyası veya başka bir istenen biçim olarak dışa aktarın.

5. Görüntü analizi

1. Hem tek görüntülerde hem de z yığınının 3 boyutlu işlenmesinde optimum netlik elde edilene kadar her kanaldaki parlaklığı ve kontrastı ayarlamak için tercih edilen görüntü analizi yazılımını(Malzeme Tablosu)kullanın.
   NOT: Seçilen adım boyutu yeterince küçükse, sinyali geliştirmek için 3D dekonvolüasyon da yapılabilir.

Sonuçlar

Modifiye CLARITY işlenmiş retinalar optik olarak şeffaf dokudur.
Yeterli delipidasyon sağlarken ve hücresel proteinlerin yapısal bütünlüğünü korurken retinadaki immünohistokimyasal uygulamalarla uyumlu bir doku temizleme yöntemi formüle etmek için CLARITY doku temizleme yöntemini tüm montajlı fare retinalarına uyarladık. Protokolü basitleştirebildik ve tam montajlı retinalar için modifiye edebildik (bkz. Protokol). Doku hibridizasyonu, temizleme ve kırılma indeksi eşleştir...

Tartışmalar

Tüm montajlı retinalar için CLARITY protokolünün değiştirilmesi.
Daha önceki çalışmaların çoğunda kullanıldığı gibi vakum tahliyesi veya tahliye odasına ihtiyaç duymadan yeterli polimerizasyon elde etmek için CLARITY protokolünü basitleştirdik^7,9,11. Polimerizasyon işlemi oksijen tarafından inhibe edilir ve protokolün polimerizasyon adımı sırasında numunenin havadan izole edilme...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Fixative
Acrylamide	Fisher Biotech	BP170	Hydrogel monomer
Axio Imager.Z2	Zeiss		Fluorscence microscope
BSA	Fisher Scientific	BP1600	Blocking agent
Eclipse Ti	Nikon Instruments		Scanning confocal microscope
KCl	VWR	BDH0258	Buffer component
KH2PO4	Sigma	P5655	Buffer component
Na2HPO4	Sigma Aldrich	S9763	Buffer component
NaCl	Sigma Aldrich	S7653	Buffer component
NaH2PO4	Sigma Aldrich	S0751	Buffer component
NaN3	Sigma Aldrich	S2002	Bacteriostatic preservative
NDS	Aurion	900.122	Blocking agent
NIS Elements AR	Nikon		Image analysis software
SDS	BioRad	1610301	Delipidation agent
Sorbitol	Sigma Aldrich	51876	Buffer component
Triton-X-100	Sigma	T8787	Surfactant
Tween-20	Fisher Scientific	BP337	Surfactant
VA-044	Wako Chemicals	011-19365	Thermal initiator