CLARITY組織クリアリング法による全マウントレティナの免疫染色

要約

ここでは、脳組織のCLARITY法を全マウントレチナに適応させ、標準的な免疫組織化学染色およびレチナルニューロンとその細胞下構造の高解像度イメージングの品質を向上させるプロトコルを提示する。

要約

もともと、Deisseroth研究室で開発された組織ヒドロゲル脱脂法(CLARITY)は、厚い脳試料の免疫染色およびイメージングに改変され、広く使用されている。しかし、この高度な技術はまだ全マウントのレティナには使用されていません。レティナは部分的に透明ですが、その厚さは約200μm(マウス)であり、依然として抗体の深部組織への浸透を制限し、高解像度イメージングのための光の浸透を減少させる。ここでは、アクリルアミドモノマーで重合してナノ多孔質ヒドロゲルを形成し、タンパク質の損失を最小限に抑え、組織の損傷を避けるためにドデシル硫酸ナトリウムでクリアすることで、マウス全実装のレチナにCLARITY法を適合させました。CLARITY処理されたレチナを、レチナルニューロン、グリア細胞、シナプスタンパク質に対する抗体で免疫染色し、屈折率整合溶液に搭載し、画像化した。我々のデータは、CLARITYが全型実装におけるレチナルニューロンおよびグリア細胞の標準的な免疫物質化学的染色およびイメージングの品質を向上させることができることを示している。例えば、ドーパミン作動性アマリン細胞の微細軸索様および樹状構造の3D分解能は、CLARITYによって大幅に改善された。非処理型全型型レチナと比較して、CLARITYは、ポストナプティック密度タンパク質95などのシナプスタンパク質の免疫染色を明らかにすることができる。我々の結果は、CLARITYが脂質の除去後にレチナをより光学的に透明にし、レチナルニューロンとそのタンパク質の微細な構造を保存することを示し、これは全型実装中のレチナルニューロンとその細胞下構造の高解像度イメージングを得るために日常的に使用することができる。

概要

脊椎動物の残りは、おそらく中枢神経系(CNS)の最もアクセスしやすい部分であり、脳の発達、構造、機能を研究するための優れたモデルとして機能します。レチナ内の5つのクラスのニューロンは、2つのプレキシフォーム層で分離された3つの核層に分布する。外核層(ONL)は、光を電気信号に変換する古典的な感光体(ロッドとコーン)で構成されています。電気信号は、双極細胞、水平細胞、アマクリン細胞を含む内部核層(INL)のニューロンによって処理され、次いで神経節細胞層(GCL)の神経節細胞(RCL)に伝達される。RGCは、画像形成および非画像形成視覚機能に寄与するために脳に突出する軸索を有する、レティナの出力ニューロンである。さらに、3種類のグリア細胞(ミュラー細胞、アストログリア、ミクログリア)は、ニューロンに栄養素を提供し、細胞外環境の有害な変化からニューロンを保護します。

アマセリン細胞の特殊な亜集団の1つは、CNSにおける重要な神経調節薬であるドーパミンを産生および放出し、光の適応中に神経回路を再構成する^1,2。ドーパミン作動性アマリン細胞(DAC)は、形態学的プロファイルのユニークな特徴を有する。彼らのソマトンは近位INLにあり、内膜層(IPL)の最も遠位部分にデンドライトが出る。DACの軸索のようなプロセスは、非髄膜、薄くて長く、まばらに分岐し、静脈瘤(ドーパミン放....

プロトコル

マウスケアと実験手順は、実験動物のための国立衛生研究所のガイドラインに従って行われ、オークランド大学の施設動物のケアと使用委員会によって承認されました(プロトコルNo. 18071)。

注: ソリューションの名前とその構成を 表 1に示します。

1. 組織の準備

1. マウスを_CO2の過剰摂取で安楽死させ、続いて子宮頸部脱臼を行う。
2. 湾曲した鉗子で目を核とし、0.1 M PBSの小さなシャーレに移す(表1)。解剖顕微鏡の下で、角膜スクレラ接合部に沿って小さな穴を針で突く。4%パラホルムアルデヒド(PFA)に1時間移します。
3. 目をPBSの皿に戻します。解剖顕微鏡の下で、角膜スクレラ接合部の周りのすべての方法をカットするために解剖はさみを使用しています。角膜とレンズを取り外します。視神経の基部で切断し、慎重に脱皮を鉗子で剥がし、残性を分離します。
4. レティナの周りに4つの小さな切り傷を均等にし、PBSに浸した細かい先端ブラシを使用して、ニトロセルロース濾紙から切り取られた小さな正方形の上にクローバーのような形で平らに(GCL側を下に)置き、レチナを安定させます。
5. 鉗子を使ってレチナをニトロセルロース紙の角を保持し(取り付けられたレチナに触れず)、....

結果

修飾されたCLARITY処理されたレチナは、光学的に透明な組織である。
十分な脱脂を提供し、細胞タンパク質の構造的完全性を保持しながら、レチナにおける免疫組織化学的用途と互換性のある組織クリアリング方法を策定するために、我々は、マウスの全実装にCLARITY組織クリアリング法を適合させた。プロトコルを簡素化し、全体マウントの retinas 用に変更することができま?.......

ディスカッション

全マウントのレティナのためのCLARITYプロトコルの変更。
我々は、ほとんどの以前の研究^7、9、11で使用されているように、真空排気または乾燥室を必要とせずに適切な重合を達成するためにCLARITYプロトコル^を簡素化しました。重合プロセスは酸素によって阻害され、プロトコルの重合工程中に試料を空気か.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Fixative
Acrylamide	Fisher Biotech	BP170	Hydrogel monomer
Axio Imager.Z2	Zeiss		Fluorscence microscope
BSA	Fisher Scientific	BP1600	Blocking agent
Eclipse Ti	Nikon Instruments		Scanning confocal microscope
KCl	VWR	BDH0258	Buffer component
KH2PO4	Sigma	P5655	Buffer component
Na2HPO4	Sigma Aldrich	S9763	Buffer component
NaCl	Sigma Aldrich	S7653	Buffer component
NaH2PO4	Sigma Aldrich	S0751	Buffer component
NaN3	Sigma Aldrich	S2002	Bacteriostatic preservative
NDS	Aurion	900.122	Blocking agent
NIS Elements AR	Nikon		Image analysis software
SDS	BioRad	1610301	Delipidation agent
Sorbitol	Sigma Aldrich	51876	Buffer component
Triton-X-100	Sigma	T8787	Surfactant
Tween-20	Fisher Scientific	BP337	Surfactant
VA-044	Wako Chemicals	011-19365	Thermal initiator