CLARITY組織クリアリング法による全マウントレティナの免疫染色

要約

ここでは、脳組織のCLARITY法を全マウントレチナに適応させ、標準的な免疫組織化学染色およびレチナルニューロンとその細胞下構造の高解像度イメージングの品質を向上させるプロトコルを提示する。

要約

もともと、Deisseroth研究室で開発された組織ヒドロゲル脱脂法(CLARITY)は、厚い脳試料の免疫染色およびイメージングに改変され、広く使用されている。しかし、この高度な技術はまだ全マウントのレティナには使用されていません。レティナは部分的に透明ですが、その厚さは約200μm(マウス)であり、依然として抗体の深部組織への浸透を制限し、高解像度イメージングのための光の浸透を減少させる。ここでは、アクリルアミドモノマーで重合してナノ多孔質ヒドロゲルを形成し、タンパク質の損失を最小限に抑え、組織の損傷を避けるためにドデシル硫酸ナトリウムでクリアすることで、マウス全実装のレチナにCLARITY法を適合させました。CLARITY処理されたレチナを、レチナルニューロン、グリア細胞、シナプスタンパク質に対する抗体で免疫染色し、屈折率整合溶液に搭載し、画像化した。我々のデータは、CLARITYが全型実装におけるレチナルニューロンおよびグリア細胞の標準的な免疫物質化学的染色およびイメージングの品質を向上させることができることを示している。例えば、ドーパミン作動性アマリン細胞の微細軸索様および樹状構造の3D分解能は、CLARITYによって大幅に改善された。非処理型全型型レチナと比較して、CLARITYは、ポストナプティック密度タンパク質95などのシナプスタンパク質の免疫染色を明らかにすることができる。我々の結果は、CLARITYが脂質の除去後にレチナをより光学的に透明にし、レチナルニューロンとそのタンパク質の微細な構造を保存することを示し、これは全型実装中のレチナルニューロンとその細胞下構造の高解像度イメージングを得るために日常的に使用することができる。

概要

脊椎動物の残りは、おそらく中枢神経系(CNS)の最もアクセスしやすい部分であり、脳の発達、構造、機能を研究するための優れたモデルとして機能します。レチナ内の5つのクラスのニューロンは、2つのプレキシフォーム層で分離された3つの核層に分布する。外核層(ONL)は、光を電気信号に変換する古典的な感光体(ロッドとコーン)で構成されています。電気信号は、双極細胞、水平細胞、アマクリン細胞を含む内部核層(INL)のニューロンによって処理され、次いで神経節細胞層(GCL)の神経節細胞(RCL)に伝達される。RGCは、画像形成および非画像形成視覚機能に寄与するために脳に突出する軸索を有する、レティナの出力ニューロンである。さらに、3種類のグリア細胞(ミュラー細胞、アストログリア、ミクログリア)は、ニューロンに栄養素を提供し、細胞外環境の有害な変化からニューロンを保護します。

アマセリン細胞の特殊な亜集団の1つは、CNSにおける重要な神経調節薬であるドーパミンを産生および放出し、光の適応中に神経回路を再構成する^1,2。ドーパミン作動性アマリン細胞(DAC)は、形態学的プロファイルのユニークな特徴を有する。彼らのソマトンは近位INLにあり、内膜層(IPL)の最も遠位部分にデンドライトが出る。DACの軸索のようなプロセスは、非髄膜、薄くて長く、まばらに分岐し、静脈瘤(ドーパミン放出の部位)です。それらはAIIアマトリン細胞のソマトンの周りのリングのような構造を含むIPLのデンドライトを有する密な神経叢を形成する。軸索はまた、OPLに向かってINLを通って走り、レティナ³を横切る遠心経路を形成する。我々は、DACプロセスが、双極性細胞および本質的に感光性神経節細胞(ipRGCs)4、5、6を含むシナプス前ニューロンからのグルタミン酸放出に応答して受容体^を発現することを実証した。しかし、グルタミン酸受容体が軸索、樹状突起、あるいはその両方に発現するかどうかは、垂直の筋切片で切断され、互いに区別できないため^5,6である。免疫染色は、DCの3次元分岐と細胞内区画上のグルタミン酸受容体の存在を明らかにするために、全型型のレチナで行う必要があります。レティナは比較的透明ですが、マウス全型型のレティナの厚さは約200μmで、深部組織への抗体の浸透を制限し、組織光散乱による高解像度イメージングのための光の浸透を低減します。これらの制限を克服するために、我々は、マウスのレチナを全マウントするに厚い脳切片のために最近開発された免疫染色適合組織ヒドロゲル脱脂質化法(CLARITY)を適応^{させました。}

クラリティ法は、もともと、太い脳試料⁷の免疫染色およびイメージングのためにDeisseroth研究所によって開発されました。強力な洗剤、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、電気泳動を使用して脂質成分(組織光散乱を引き起こす)を除去し、タンパク質と核酸を所定の位置に残します。除去された脂質は、残りのタンパク質構造を支持するためにアクリルアミドなどのヒドロゲルモノマーで構成された透明な足場に置き換えられる。クリアされた組織は、免疫組織化学を介して標識することができ、組織を通して実質的に増加した光の浸透深さ(組織表面の下数ミリメートルまで)で画像化することができます。それ以来、CLARITY法は、いくつかの研究グループ^8、9、10によって最適化され^、簡素化されています。修飾されたCLARITYプロトコルは、受動的なクリア技術を使用して、全脳および他の無傷の器官¹¹をクリアするための電気泳動によって生じる可能性のある組織損傷を回避する。しかし、この方法はまだ全マウントのレティナには適用されていません。ここでは、全身マウントレチナの受動的なCLARITY技術を応用し、免疫組織化学やイメージングに対して透明性を高めました。我々は、試験されたレチンタンパク質の大部分が免疫細胞化学のこのプロセス中に保存されたことを発見した。屈折率マッチングソリューションを用いて、ONLからGCLまでの約200μmの厚さにわたって、全型型のレティナでレチン性ニューロンを画像化することができました。

プロトコル

マウスケアと実験手順は、実験動物のための国立衛生研究所のガイドラインに従って行われ、オークランド大学の施設動物のケアと使用委員会によって承認されました(プロトコルNo. 18071)。

注: ソリューションの名前とその構成を 表 1に示します。

1. 組織の準備

1. マウスを_CO2の過剰摂取で安楽死させ、続いて子宮頸部脱臼を行う。
2. 湾曲した鉗子で目を核とし、0.1 M PBSの小さなシャーレに移す(表1)。解剖顕微鏡の下で、角膜スクレラ接合部に沿って小さな穴を針で突く。4%パラホルムアルデヒド(PFA)に1時間移します。
3. 目をPBSの皿に戻します。解剖顕微鏡の下で、角膜スクレラ接合部の周りのすべての方法をカットするために解剖はさみを使用しています。角膜とレンズを取り外します。視神経の基部で切断し、慎重に脱皮を鉗子で剥がし、残性を分離します。
4. レティナの周りに4つの小さな切り傷を均等にし、PBSに浸した細かい先端ブラシを使用して、ニトロセルロース濾紙から切り取られた小さな正方形の上にクローバーのような形で平らに(GCL側を下に)置き、レチナを安定させます。
5. 鉗子を使ってレチナをニトロセルロース紙の角を保持し(取り付けられたレチナに触れず)、4%PFAの48ウェルプレートに1時間置きます。
6. フィルターペーパーとレチナをPBSでウェルに移し、洗浄します(3倍で5分間ずつ)。
7. A4P0(表1)に移し、穏やかな攪拌で一晩4°Cでインキュベートする。
8. ピペット植物油を井戸に入れ、A4P0溶液を完全にカバーします。40°Cの水浴で3時間、振盪を起さないでインキュベートします。
9. PBSで(それぞれ5分間3倍)洗浄し、すべての油が洗い流されていることを確認します。必要に応じて、最後のすすめの前に、残りの油を慎重にウェルの上部から除去するためにピペットを使用してください。
10. 穏やかな揺れで2日間40°Cで10%SDSでインキュベート。2日目にSDSを新しいソリューションに交換してください。
11. 濾紙とレチナをトリトンX-100(PBST、 表1)でPBSに移し、洗浄(それぞれ1.5時間5倍)します。
12. PBSTで4°Cで0.01%アジドナトリウム(NaN₃₎で保存するか、免疫染色に直接移動します。

2. 免疫染色と屈折率のマッチング

1. PBSTの細かい先端ブラシで軽く剥がして、フィルター紙からレチナを取り除きます。
2. 一次抗体にレチナをインキュベートする (表2)ブロッキング溶液に希釈した(表1)を緩やかに振るとともに40°Cで2日間培養する。
3. PBSTで(5倍、1.5時間)洗浄します。
4. 適切な二次抗体を用いてインキュベートする(表3)を緩やかに振盪して40°Cで2日間ブロッキング溶液に希釈し、残りの手順を通して光から保護する。
5. 0.02 Mリン酸緩衝液( 表1参照)で洗浄(5x、1.5時間ずつ)
6. ソルビトールベースの屈折率マッチング溶液(sRIMS、 表1参照)で一晩で穏やかな揺れでインキュベートする。

3. 取り付け

1. ガラス顕微鏡スライドの背面に正方形の境界をマークするために、細かい先端の永久マーカーと18 mm x 18 mm x 1.5 mmガラスカバースリップを概説します。
2. スライドを裏返し、シリンジを使用してスライドの前面にシリコーングリースの細い線で境界をトレースし、余分な取り付け溶液が逃げるために1つのコーナーに小さなギャップを残します。
3. 有形分を境界領域の中央に移し、ガラススライドに対して感光体側に平らに置くように細かい先端ブラシで配置します。
4. ピペットのsRIMSは約60 μLで平坦なレチナを覆い、エンクロージャの一角まで伸び、レチナは平らで所定の位置に留まるように注意します。
5. sRIMSでコーナーから始まるカバースリップを塗布し、気泡の形成を避け、すべての側面のグリースに触れるまでゆっくりと下げます。
6. 取り付けられたレティナの両側に3つのカバーリップのスタックをスペーサーとして配置します。別のスライドの長いエッジを使用してカバースリップを押し下げて、マウントが平らで均等になるようにします。
7. スライドはイメージングまで4°Cで平らに保管してください。

4. イメージング

1. 従来の蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡上の画像サンプル (材料表)顕微鏡のステージにスライドを配置し、サンプルを見つけることから始めます。
   注:反転された目的顕微鏡を使用している場合は、スライドを上向きに上に置き、まずスライドの露出した領域がすべてのシリコーングリースと取り付け溶液から離れているかどうかを確認します。
2. 共標識サンプルのZ積層画像を得るためには、まず各チャンネルの信号に個別に焦点を合わせ、蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡の露光時間または走査速度を設定します。
3. 目的の範囲の上部と下部に焦点面を手動で設定するか、中点を設定してから中点の周囲の範囲を指定して、Z スタックの範囲を設定します。
4. 必要に応じて、ステップサイズまたはスライス数を調整します。
5. イメージをキャプチャして元のファイルを保存し、TIFF ファイルまたはその他の目的の形式でエクスポートします。

5. 画像解析

1. 選択の画像解析ソフトウェアを使用して選択して (材料表)、Zスタックの単一の画像と3次元レンダリングの両方で最適な明瞭度が達成されるまで、各チャンネルの明るさとコントラストを調整します。
   注:選択したステップサイズが十分に小さい場合、3Dデコンボリューションを実行して信号を強化することもできます。

結果

修飾されたCLARITY処理されたレチナは、光学的に透明な組織である。
十分な脱脂を提供し、細胞タンパク質の構造的完全性を保持しながら、レチナにおける免疫組織化学的用途と互換性のある組織クリアリング方法を策定するために、我々は、マウスの全実装にCLARITY組織クリアリング法を適合させた。プロトコルを簡素化し、全体マウントの retinas 用に変更することができま?...

ディスカッション

全マウントのレティナのためのCLARITYプロトコルの変更。
我々は、ほとんどの以前の研究^7、9、11で使用されているように、真空排気または乾燥室を必要とせずに適切な重合を達成するためにCLARITYプロトコル^を簡素化しました。重合プロセスは酸素によって阻害され、プロトコルの重合工程中に試料を空気か...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Fixative
Acrylamide	Fisher Biotech	BP170	Hydrogel monomer
Axio Imager.Z2	Zeiss		Fluorscence microscope
BSA	Fisher Scientific	BP1600	Blocking agent
Eclipse Ti	Nikon Instruments		Scanning confocal microscope
KCl	VWR	BDH0258	Buffer component
KH2PO4	Sigma	P5655	Buffer component
Na2HPO4	Sigma Aldrich	S9763	Buffer component
NaCl	Sigma Aldrich	S7653	Buffer component
NaH2PO4	Sigma Aldrich	S0751	Buffer component
NaN3	Sigma Aldrich	S2002	Bacteriostatic preservative
NDS	Aurion	900.122	Blocking agent
NIS Elements AR	Nikon		Image analysis software
SDS	BioRad	1610301	Delipidation agent
Sorbitol	Sigma Aldrich	51876	Buffer component
Triton-X-100	Sigma	T8787	Surfactant
Tween-20	Fisher Scientific	BP337	Surfactant
VA-044	Wako Chemicals	011-19365	Thermal initiator