Cryo-EM وتحليل الجسيمات المفردة مع Scipion

Summary

تحليل الجسيمات المفردة في المجهر الإلكترون المبرد هو واحد من التقنيات الرئيسية المستخدمة لتحديد بنية الفرق البيولوجية بدقة عالية. Scipion يوفر الأدوات اللازمة لإنشاء خط أنابيب كامل لمعالجة المعلومات التي تم الحصول عليها من المجهر وتحقيق إعادة بناء 3D من العينة البيولوجية.

Abstract

أصبح المجهر الإلكتروني المبرد واحدة من أهم الأدوات في البحوث البيولوجية للكشف عن المعلومات الهيكلية للجزيئات الكبيرة بدقة شبه ذرية. في تحليل الجسيمات المفردة ، يتم تصوير العينة الهزازة بواسطة شعاع إلكترون وتنتج أجهزة الكشف في نهاية عمود المجهر أفلاما لتلك العينة. تحتوي هذه الأفلام على آلاف الصور لجسيمات متطابقة في اتجاهات عشوائية. تحتاج البيانات إلى المرور عبر سير عمل معالجة الصور مع خطوات متعددة للحصول على وحدة التخزين النهائية المعاد بناؤها ثلاثية الأبعاد. الهدف من سير عمل معالجة الصور هو تحديد معلمات الاستحواذ لتكون قادرة على إعادة بناء العينة قيد الدراسة. يوفر Scipion جميع الأدوات اللازمة لإنشاء سير العمل هذا باستخدام حزم معالجة الصور المتعددة في إطار تكاملي ، مما يسمح أيضا بتتبع النتائج. في هذه المقالة يتم تقديم سير عمل معالجة الصور بالكامل في Scipion ومناقشته مع البيانات القادمة من حالة اختبار حقيقية ، مما يعطي جميع التفاصيل اللازمة للانتقال من الأفلام التي تم الحصول عليها بواسطة المجهر إلى إعادة بناء 3D نهائية عالية الدقة. كما تتم مناقشة قوة استخدام أدوات التوافق التي تسمح بالجمع بين الأساليب، وتأكيد النتائج على طول كل خطوة من سير العمل، وتحسين دقة النتائج التي تم الحصول عليها.

Introduction

في المجهر الإلكترون المبرد (cryo-EM) ، يعد تحليل الجسيمات المفردة (SPA) للعينات المجمدة المائية الزخوبة أحد أكثر المتغيرات استخداما ونجاحا للتصوير للجزيئات الجزيئية البيولوجية ، لأنه يسمح بفهم التفاعلات الجزيئية ووظيفة الفرق ^{البيولوجية1}. ويرجع الفضل في ذلك إلى التقدم الأخير في تقنية التصوير هذه التي أدت إلى "ثورة القرار" ² وسمحت بالتصميم الناجح للهياكل البيولوجية ثلاثية الأبعاد ذات الدقة شبه الذرية. حاليا، كان أعلى قرار المحرز في SPA cryo-EM 1.15 Å ل apoferritin3 (EMDB الدخول: 11668). وتشمل هذه التطورات التكنولوجية تحسينات في إعداد ^{العينة4}، واكتساب ^{الصورة5}، وطرق معالجة ^الصور6. تركز هذه المقالة على هذه النقطة الأخيرة.

باختصار ، فإن الهدف من أساليب معالجة الصور هو تحديد جميع معلمات الاستحواذ لعكس عملية تصوير المجهر واستعادة البنية ثلاثية الأبعاد للعينة البيولوجية قيد الدراسة. هذه المعلمات هي كسب الكاميرا ، والحركة الناجمة عن شعاع ، وانحرافات المجهر (أساسا defocus) ، والتوجه الزاوي 3D وترجمة كل جسيم ، والحالة تشكيلية في حالة وجود عينة مع التغيرات تشكيلية. ومع ذلك ، فإن عدد المعلمات مرتفع جدا ويتطلب cryo-EM استخدام صور منخفضة الجرعة لتجنب تلف الإشعاع ، مما يقلل بشكل كبير من نسبة الإشارة إلى الضوضاء (SNR) للصور المكتسبة. وبالتالي، لا يمكن حل المشكلة بشكل قاطع، وجميع البارامترات التي يجب حسابها يمكن أن تكون تقديرات فقط. على طول سير عمل معالجة الصور ، يجب تحديد المعلمات الصحيحة ، مع تجاهل المعلمات المتبقية للحصول في النهاية على إعادة بناء ثلاثية الأبعاد عالية الدقة.

يتم جمع البيانات التي تم إنشاؤها بواسطة المجهر في إطارات. تبسيط، إطار يحتوي على عدد من الإلكترونات التي وصلت إلى موقف معين (بكسل) في الصورة، كلما يتم استخدام أجهزة الكشف عن عد الإلكترونات. في مجال معين من العرض، يتم تجميع عدة إطارات وهذا ما يسمى فيلم. كما يتم استخدام جرعات الإلكترون منخفضة لتجنب الأضرار الإشعاعية التي يمكن أن تدمر العينة، وSNR منخفضة جدا والأطر المقابلة لنفس الفيلم تحتاج إلى أن يكون متوسط للحصول على صورة تكشف عن معلومات هيكلية حول العينة. ومع ذلك ، لا يتم تطبيق متوسط بسيط فحسب ، بل يمكن أن تعاني العينة من نوبات وأنواع أخرى من الحركات خلال وقت التصوير بسبب الحركة الناجمة عن الحزمة التي تحتاج إلى تعويض. تنشأ الإطارات التي يتم تعويضها ومتوسطها في التحول صورة مصغرة.

بمجرد الحصول على الصور الدقيقة ، نحتاج إلى تقدير الانحرافات التي أدخلها المجهر لكل منها ، والتي تسمى وظيفة نقل التباين (CTF) ، والتي تمثل التغيرات في تباين المجهر كدالة للتردد. ثم، يمكن اختيار الجسيمات واستخراجها، وهو ما يسمى التقاط الجسيمات. يجب أن يكون كل جسيم صورة صغيرة تحتوي على نسخة واحدة فقط من العينة قيد الدراسة. هناك ثلاث عائلات من الخوارزميات لاختيار الجسيمات: 1) تلك التي تستخدم فقط بعض المعلمات الأساسية لظهور الجسيمات للعثور عليها في مجموعة كاملة من micrographs (على سبيل المثال، حجم الجسيمات)، 2) تلك التي تعلم كيف تبدو الجسيمات من المستخدم أو مجموعة مدربة مسبقا، و 3) تلك التي تستخدم قوالب الصور. كل عائلة لها خصائص مختلفة سيتم عرضها لاحقا.

سيتم استخدام المجموعة المستخرجة من الجسيمات الموجودة في الصور الدقيقة في عملية تصنيف ثنائية الأبعاد لها هدفان: 1) تنظيف مجموعة الجسيمات عن طريق التخلص من المجموعة الفرعية التي تحتوي على صور الضوضاء النقية أو الجسيمات المتداخلة أو القطع الأثرية الأخرى ، و 2) يمكن استخدام الجسيمات المتوسطة التي تمثل كل فئة كمعلومات أولية لحساب حجم أولي ثلاثي الأبعاد.

حساب حجم 3D الأولي هو الخطوة الحاسمة التالية. يمكن النظر إلى مشكلة الحصول على البنية ثلاثية الأبعاد على أنها مشكلة تحسين في مشهد حل متعدد الأبعاد ، حيث الحد الأدنى العالمي هو أفضل وحدة تخزين ثلاثية الأبعاد تمثل الهيكل الأصلي ، ولكن يمكن العثور على العديد من الحلول المحلية الصغيرة التي تمثل حلول دون المستوى الأمثل ، وحيث يكون من السهل جدا الوقوع في الفخ. يمثل الحجم الأولي نقطة البداية لعملية البحث ، لذلك يمكن أن يمنعنا تقدير الحجم الأولي السيئ من العثور على الحد الأدنى العالمي. من الحجم الأولي، ستساعد خطوة التصنيف ثلاثي الأبعاد على اكتشاف حالات تشكيلية مختلفة وتنظيف مجموعة الجسيمات مرة أخرى. والهدف من ذلك هو الحصول على مجموعة متجانسة هيكليا من الجسيمات. بعد ذلك، ستكون خطوة التحسين ثلاثية الأبعاد مسؤولة عن تحسين المعلمات الزاوي والترجمة لكل جسيم للحصول على أفضل حجم ثلاثي الأبعاد ممكن.

وأخيرا، في الخطوات الأخيرة، يمكن شحذ وإعادة بناء 3D التي تم الحصول عليها ومصقول. الشحذ هو عملية لزيادة الترددات العالية للحجم المعاد بناؤه ، والتلميع هو خطوة لزيادة صقل بعض المعلمات ، مثل CTF أو تعويض الحركة الناجم عن الحزمة ، على مستوى الجسيمات. كما يمكن استخدام بعض إجراءات التحقق من الصحة لفهم الدقة المحققة بشكل أفضل في نهاية سير العمل.

وبعد كل هذه الخطوات، ستساعد عمليات التتبع ^{والالتحام7} على إعطاء معنى بيولوجي لإعادة البناء ثلاثي الأبعاد التي تم الحصول عليها، من خلال بناء نماذج ذرية من طراز دي نوفو أو تركيب النماذج القائمة. وإذا تحقق قرار عال، فإن هذه العمليات ستخبرنا بمواقف الهياكل البيولوجية، حتى الذرات المختلفة، في هيكلنا.

^Scipion8 يسمح بإنشاء سير العمل كله الجمع بين حزم معالجة الصور الأكثر صلة بطريقة تكاملية. ^Xmipp9، ^Relion10، CryoSPARC11، ^Eman12، ^Spider13، ^Cryolo14، ^Ctffind15، ^CCP416، ^Phenix17، ويمكن تضمين العديد من الحزم في Scipion. كما أنه يتضمن جميع الأدوات اللازمة للاستفادة من التكامل والتشغيل البيني والتتبع والقابلية لإعادة الإنتاج لجعل تتبع كامل لسير عمل معالجة الصور ^{بالكامل8}.

واحدة من أقوى الأدوات التي تسمح لنا Scipion باستخدامها هي توافق الآراء ، مما يعني مقارنة النتائج التي تم الحصول عليها بعدة طرق في خطوة واحدة من المعالجة ، مما يجعل مزيجا من المعلومات التي تنقلها أساليب مختلفة لتوليد مخرجات أكثر دقة. وهذا يمكن أن يساعد على تعزيز الأداء وتحسين الجودة المحققة في المعلمات المقدرة. لاحظ أنه يمكن إنشاء سير عمل أبسط بدون استخدام أساليب توافق الآراء؛ ومع ذلك، فقد رأينا قوة هذه ^{الأداة22,25} وسير العمل المعروض في هذه المخطوطة سيستخدمها في عدة خطوات.

سيتم شرح جميع الخطوات التي تم تلخيصها في الفقرات السابقة بالتفصيل في القسم التالي ودمجها في سير عمل كامل باستخدام Scipion. كما سيتم عرض كيفية استخدام أدوات توافق الآراء لتحقيق اتفاق أعلى في النواتج الناتجة. وتحقيقا لتلكوم 80S، اختيرت مجموعة البيانات المثلية ل Plasmodium falciparum 80S Ribosome (إدخال EMPIAR: 10028، إدخال EMDB: 2660). يتم تشكيل مجموعة البيانات من قبل 600 فيلم من 16 إطارا من حجم 4096x4096 بكسل في حجم بكسل من 1.34Å التي اتخذت في بولارا FEI 300 مع كاميرا FEI فالكون الثاني، مع قرار ذكرت في EMDB هو ^3.2Å18 .

Protocol

1. إنشاء مشروع في Scipion واستيراد البيانات

1. افتح Scipion وانقر على إنشاء مشروع، وحدد اسم المشروع والموقع الذي سيتم حفظه فيه (الشكل التكميلي 1). سوف Scipion فتح إطار المشروع تظهر قماش مع، على الجانب الأيسر، لوحة مع قائمة من الأساليب المتاحة، كل واحد منهم يمثل أداة واحدة لمعالجة الصور التي يمكن استخدامها لإدارة البيانات.
   ملاحظة: يمكن استخدام Ctrl + F للبحث عن أسلوب إذا لم يظهر في القائمة.
2. لاستيراد الأفلام التي اتخذتها المجهر حدد pwem -- استيراد الأفلام على اللوحة اليسرى (أو اكتبه عند الضغط على Ctrl + F).
3. سيتم فتح نافذة جديدة (الشكل التكميلي 2). هناك، قم بتضمين المسار إلى البيانات ومعلمات الاستحواذ. في هذا المثال، استخدم الإعداد التالي: جهد المجهر 300 كيلو فولت، انحراف كروي 2.0 مم، تباين السعة 0.1، معدل التكبير 50000، وضع معدل أخذ العينات إلى من الصورة، وحجم Pixel 1.34 Å. عند تعبئة كافة المعلمات في النموذج، انقر فوق الزر تنفيذ .
   ملاحظة: عند بدء تشغيل أسلوب يظهر مربع في لوحة القماش باللون الأصفر المسمى ك قيد التشغيل. عند انتهاء أسلوب المربع يتغير إلى اللون الأخضر ثم يتغير التسمية إلى منتهية. في حالة حدوث خطأ أثناء تنفيذ أسلوب، سيظهر المربع باللون الأحمر، مع وصفها بأنها فاشلة. في هذه الحالة، تحقق الجزء السفلي من قماش، في علامة التبويب "سجل الإخراج " شرحا للخطأ سوف تظهر.
4. عند انتهاء الأسلوب، تحقق من النتائج في الجزء السفلي من اللوحة القماشية في علامة التبويب ملخص . هنا ، يتم تقديم المخرجات الناتجة عن الطريقة ، في هذه الحالة ، مجموعة من الأفلام. انقر على زر تحليل النتائج وسوف تظهر نافذة جديدة مع قائمة الأفلام.

2. محاذاة الفيلم: من الأفلام إلى الصور الدقيقة

1. استخدام طريقة xmipp3 - المحاذاة البصرية التي تنفذ ^flow19 البصرية. استخدام المعلمات التالية لملء النموذج (الشكل التكميلي 3): أفلام الإدخال هي تلك التي تم الحصول عليها في الخطوة 1، النطاق في إطارات إلى محاذاة هو من 2 إلى 13، والخيارات الأخرى البقاء مع القيم الافتراضية. تنفيذ البرنامج.
   ملاحظة: يجب أن تكون المعلمات بخط عريض في نموذج تعبئة دوما. الآخرين سوف يكون لها قيمة افتراضية أو لن تكون مطلوبة إجباريا. في الجزء العلوي من إطار النموذج، يمكن العثور على الحقول التي يتم توزيع الموارد الحسابية، كمؤشرات الترابط أو MPIs أو وحدات المعالجة التراكمية.
2. انقر على تحليل النتائج للتحقق من الصور الدقيقة التي تم الحصول عليها ومسار التحولات المقدرة (الشكل 1). لكل ميكروجراف ينظر: ننظر في كثافة الطيفية السلطة (PSD)، والمسارات التي تم الحصول عليها لمحاذاة الفيلم (نقطة واحدة لكل إطار) في الإحداثيات الديكارتية والقطبية، واسم ملف المجهر التي تم الحصول عليها (النقر عليه، يمكن فحص المجهر). لاحظ أن جزيئات العينة أكثر وضوحا في المجهر ، مقارنة بإطار واحد من الفيلم.

3. تقدير CTF: حساب انحرافات المجهر

1. أولا، استخدم طريقة غريغوريفلاب - ctffind15. الإعداد هو: ميكروجرافات الإدخال هي إخراج الخطوة 2، يتم تعيين عامل إعادة ختم CTF اليدوي إلى 1.5، ونطاق الدقة من 0.06 إلى 0.42. علاوة على ذلك، في خيارات متقدمة (التي يمكن العثور عليها عن طريق تحديد هذا الاختيار في مستوى الخبراء من النموذج) ، تعيين حجم الإطار إلى 256. تبقى المعلمات المتبقية مع القيم الافتراضية (الشكل التكميلي 4).
   ملاحظة: في معظم الطرق في Scipion الخيار متقدم يظهر معلمات التكوين أكثر. استخدم هذه الخيارات بعناية، عندما يكون البرنامج الذي سيتم إطلاقه معروفا تماما ويتم فهم معنى المعلمات. قد يكون من الصعب ملء بعض المعلمات دون إلقاء نظرة على البيانات؛ في هذه الحالة، Scipion يظهر عصا سحرية على الجانب الأيمن التي سوف تظهر نافذة المعالج (الشكل التكميلي 5). على سبيل المثال، في حقل الحل من هذا النموذج مفيد بشكل خاص، حيث يجب تحديد هذه القيم لتغطية المنطقة تقريبا من الصفر الأول إلى الحلقة الملحوظة الأخيرة من PSD.
2. انقر على تنفيذ وعلى تحليل النتائج (الشكل 2) عند انتهاء الأسلوب. تأكد من تطابق CTF المقدر مع الاختبار. وتحقيقا ولهذا الغرض، انظر إلى شعبة الأمن العام وقارن الحلقات المقدرة في الزاوية بالحلقات القادمة من البيانات. تحقق أيضا من قيم defocus التي تم الحصول عليها للعثور على أي قيم غير متوقعة ويمكن تجاهل الصور الدقيقة المعنية أو إعادة حسابها. في هذا المثال، يمكن استخدام مجموعة كاملة من الصور الدقيقة.
   ملاحظة: استخدم الأزرار الموجودة في الجزء السفلي من النافذة لإنشاء مجموعة فرعية من الصور الدقيقة (مع زر Micrographs الأحمر) وإعادة حساب CTF (مع زر CTFs الأحمر لإعادة حسابها )، في حالة الحاجة.
3. لصقل التقدير السابق، استخدم xmipp3 - ctf ^{التقدير20}. حدد كمقاكروغراف الإدخال إخراج الخطوة 2، حدد الخيار استخدام defoci من تقدير CTF السابقة، كما تقدير CTF السابقة اختيار إخراج غريغوريفلاب - ctffind، وعلى المستوى المتقدم، تغيير حجم النافذة إلى 256 (الشكل التكميلي 6). قم بتشغيله.
4. انقر على تحليل النتائج للتحقق من CTFs التي تم الحصول عليها. مع هذا الأسلوب، يتم تقدير المزيد من البيانات وتمثيلها في بعض الأعمدة الإضافية. كما لا أحد منهم إظهار القيم المقدرة غير صحيحة، سيتم استخدام كافة micrographs في الخطوات التالية.

4. التقاط الجسيمات: العثور على جزيئات في ميكروجرافس

1. قبل البدء في الانتقاء ، نفذ معالجة مسبقة للميكروجرافات. فتح xmipp3 - micrographs preprocess، تعيين كميكروغرافات الإدخال تلك التي تم الحصول عليها في الخطوة 2 وتحديد الخيارات إزالة بكسل سيئة؟ مع مضاعف من ستديف إلى 5، وMicrographs داونسامبل؟ مع عامل داونسامبل من 2 (الشكل التكميلي 7). انقر على تنفيذ وتحقق من أن حجم micrographs الناتجة قد انخفض.
2. لاستخدام الانتقاء xmipp3 - الانتقاء اليدوي (الخطوة 1) و xmipp3 - الانتقاء التلقائي (الخطوة 2)²¹. يسمح الانتقاء اليدوي بإعداد مجموعة من الجسيمات يدويا ستتعلم بها خطوة الانتقاء التلقائي وتولد مجموعة كاملة من الجسيمات. أولا ، تشغيل xmipp3 -- اليدوية الانتقاء (الخطوة 1) مع ميكروجرافات الإدخال كما micrographs التي تم الحصول عليها في preprocess السابقة. انقر على تنفيذ وسوف تظهر نافذة تفاعلية جديدة (الشكل 3).
3. في هذه النافذة يتم تقديم قائمة من micrographs (الشكل 3a) وخيارات أخرى. تغيير الحجم (px) إلى 150، وهذا سيكون حجم مربع يحتوي على كل جسيم. يظهر المجهر المحدد في نافذة أكبر. اختر منطقة واختر جميع الجسيمات المرئية فيها (الشكل 3ب). ثم انقر على تنشيط التدريب لبدء التعلم. يتم اختيار المناطق المتبقية من ميكروجراف تلقائيا (الشكل 3c). تحقق من الجسيمات التي تم انتقاؤها وتضمين المزيد عن طريق النقر عليها ، أو إزالة الجسيمات غير الصحيحة مع shift + clicking ، إذا لزم الأمر.
4. حدد ميكروجراف التالي في الإطار الأول. سيتم اختيار المجهر تلقائيا. تحقق مرة أخرى لتشمل أو إزالة بعض الجسيمات، إذا لزم الأمر. كرر هذه الخطوة مع، تقريبا، 5 ميكروجراف لإنشاء مجموعة تدريب تمثيلية.
5. بمجرد الانتهاء من ذلك، انقر على الإحداثيات في النافذة الرئيسية لحفظ إحداثيات جميع الجسيمات التي تم انتقاؤها. مجموعة التدريب من الجسيمات على استعداد للذهاب إلى اختيار السيارات لإكمال عملية لجميع micrographs.
6. فتح xmipp3 - لصناعة السيارات في قطف (الخطوة 2) مشيرا في انتقاء الجسيمات Xmipp تشغيل الانتقاء اليدوي السابق، وMicrographs لاختيار نفس كما أشرف. انقر على تنفيذ. سيقوم هذا الأسلوب بإنشاء إخراج مجموعة من حوالي 100000 إحداثيات.
7. تطبيق نهج توافق الآراء، لذلك تنفيذ طريقة الانتقاء الثاني لتحديد الجسيمات التي يتفق كلا الأسلوبين. فتح sphire - cryolo ^picking14 وحدد micrographs المجهزة مسبقا كما Micrographs الإدخال، واستخدام النموذج العام؟ إلى نعم، مع عتبة الثقة من 0.3، وحجم مربع من 150 (الشكل التكميلي 8). قم بتشغيله. يجب أن يقوم هذا الأسلوب بإنشاء إحداثيات حوالي 100000.
8. تشغيل xmipp3 -- توافق عميق في الآراء ^picking22. كما تشمل إحداثيات الإدخال إخراج sphire - اختيار cryolo (الخطوة 4.7) وxmipp3 - الانتقاء التلقائي (الخطوة 4.6) ، تعيين نوع نموذج حدد إلى تدريب مسبق ، وتخطي التدريب والنتيجة مباشرة مع نموذج مدرب مسبقا؟ إلى نعم (الشكل التكميلي 9). قم بتشغيله.
9. انقر على تحليل النتائج ، وفي النافذة الجديدة، على أيقونة العين بجوار تحديد الجسيمات / الإحداثيات مع قيم "zScoreDeepLearning1" العالية. سيتم فتح نافذة جديدة مع قائمة بجميع الجسيمات (الشكل 4). قيم zScore في العمود تعطي فكرة عن جودة الجسيمات ، والقيم المنخفضة تعني جودة سيئة.
   1. انقر على التسمية_xmipp_zScoreDeepLearning لطلب الجسيمات من أعلى إلى أدنى zScore. حدد الجسيمات التي يزيد ارتفاع zScore عن 0.75 وانقر على الإحداثيات لإنشاء مجموعة فرعية جديدة. يجب أن يقوم هذا بإنشاء مجموعة فرعية مع إحداثيات 50000 تقريبا.
10. فتح xmipp3 - منظف ميكروجراف عميق. حدد كمدخلات إحداثيات المجموعة الفرعية التي تم الحصول عليها في الخطوة السابقة، Micrographs المصدر نفس الإحداثيات، والحفاظ على عتبة في 0.75. قم بتشغيله. تحقق في علامة التبويب ملخص أنه تم تقليل عدد الإحداثيات، على الرغم من أنه في هذه الحالة، تتم إزالة إحداثيات قليلة فقط.
    ملاحظة: هذه الخطوة غير قادر على تنظيف بالإضافة إلى ذلك مجموعة من الإحداثيات ويمكن أن تكون مفيدة جدا في تنظيف مجموعات البيانات الأخرى مع المزيد من artifacts الفيلم كمنازق الكربون أو الشوائب الكبيرة.
11. تشغيل xmipp3 - استخراج الجسيمات (الشكل التكميلي 10). كما تشير المدخلات تنسق الإحداثيات التي تم الحصول عليها بعد الخطوة السابقة ، Micrographs المصدر وغيرها ، وإدخال micrographs كما إخراج الخطوة 2 ، وتقدير CTF كما إخراج تقدير xmipp3 -- ctf ، عامل Downsampling إلى 3 ، وحجم مربع الجسيمات إلى 100. في علامة التبويب معالجة مسبقة في النموذج حدد نعم للجميع. قم بتشغيله.
12. تأكد من أن الإخراج يجب أن يحتوي على الجسيمات في حجم مخفض من 100x100 بكسل وحجم بكسل من 4.02Å/px.
13. تشغيل xmipp3 مرة أخرى - استخراج الجسيمات تغيير المعلمات التالية: عامل Downsampling إلى 1، وحجم مربع الجسيمات إلى 300. تأكد من أن الإخراج هو نفس مجموعة من الجسيمات ولكن الآن في القرار الكامل.

5. تصنيف 2D: تجميع جزيئات مماثلة معا

1. افتح طريقة cryosparc2 - تصنيف 2D11 مع جزيئات الإدخال مثل تلك التي تم الحصول عليها في الخطوة 4.11، وفي علامة التبويب تصنيف 2D، وعدد الفئات إلى 128، والحفاظ على جميع المعلمات الأخرى مع القيم الافتراضية. قم بتشغيله.
2. انقر على تحليل النتائج ثم على أيقونة العين بجوار عرض فئات الجسيمات مع Scipion (الشكل 5). سيساعد هذا التصنيف على تنظيف مجموعة الجسيمات ، حيث ستظهر عدة فئات صاخبة أو مع القطع الأثرية. حدد الفئات التي تحتوي على طرق عرض جيدة. انقر على الجسيمات (الزر الأحمر في الجزء السفلي من النافذة) لإنشاء مجموعة فرعية أنظف.
3. الآن ، افتح xmipp3 - cl2d23 وتعيين صور الإدخال الصور التي تم الحصول عليها في الخطوة السابقة وعدد الفئات ك 128. انقر على تنفيذ.
   ملاحظة: يستخدم هذا التصنيف الثاني كخطوة تنظيف إضافية لمجموعة الجسيمات. عادة ما يكون مفيدا لإزالة أكبر قدر ممكن من الجسيمات الصاخبة. ومع ذلك، إذا كان سير عمل أبسط المطلوبة، يمكن استخدام أسلوب تصنيف 2D واحد فقط.
4. عند انتهاء الأسلوب، تحقق من الفئات التي تم إنشاؤها 128 بالنقر فوق تحليل النتائج وعلى ما لإظهار: فئات. معظم الفئات التي تم إنشاؤها تظهر إسقاط الجزيئات الكبيرة مع مستوى معين من التفاصيل. ومع ذلك، يبدو بعضها صاخبة (في هذا المثال ما يقرب من 10 فئات). حدد جميع الفئات الجيدة وانقر على زر الفئات لإنشاء مجموعة فرعية جديدة مع تلك الجيدة فقط. سيتم استخدام هذه المجموعة الفرعية كمدخل إلى إحدى الطرق لإنشاء وحدة تخزين أولية. مع نفس الطبقات المحددة انقر على الجسيمات لإنشاء مجموعة فرعية أنظف بعد إزالة تلك التي تنتمي إلى الطبقات السيئة.
5. pwem مفتوحة -- مجموعة فرعية مع مجموعة كاملة من العناصر كما خرج من 4.13 (جميع الجسيمات في الحجم الكامل) ، وجعل مجموعة فرعية عشوائية إلى لا ، مجموعة أخرى باعتبارها مجموعة فرعية من الجسيمات التي تم إنشاؤها في الخطوة السابقة ، وتعيين العملية كتقاطع. وهذا سوف استخراج المجموعة الفرعية السابقة من الجسيمات بدقة كاملة.

6. تقدير الحجم الأولي: بناء أول تخمين لحجم 3D

1. في هذه الخطوة، قم بتقدير مجلدين أوليين باستخدام أساليب مختلفة ثم استخدم أداة توافق الآراء لإنشاء المجلد ثلاثي الأبعاد المقدر النهائي. فتح xmipp3 - إعادة بناء الأسلوب ^{significant24} مع فئات الإدخال كما تلك التي تم الحصول عليها بعد الخطوة 5، مجموعة التماثل ك c1، والحفاظ على المعلمات المتبقية مع القيم الافتراضية الخاصة بهم (الشكل التكميلي 11). نفذه.
2. انقر على تحليل النتائج. تحقق من أن حجم دقة منخفضة من حجم 100x100x100 بكسل وحجم بكسل 4.02Å/px يتم الحصول عليها.
3. فتح xmipp3 - أحجام المحاصيل / تغيير الحجم (الشكل التكميلي 12) باستخدام وحدات تخزين الإدخال التي تم الحصول عليها في الخطوة السابقة، تغيير حجم وحدات التخزين؟ إلى نعم، تغيير حجم الخيار إلى معدل أخذ العينات، ومعدل أخذ العينات تغيير الحجم إلى 1.34 Å/px. قم بتشغيله. تحقق في علامة التبويب ملخص أن وحدة تخزين الإخراج بالحجم الصحيح.
4. الآن، إنشاء وحدة التخزين الأولية الثانية. open relion - نموذج أولي ثلاثي ^{الأبعاد10}، حيث تستخدم جزيئات الإدخال الجسيمات الجيدة بدقة كاملة (إخراج 5.5) وتعيين قطر قناع الجسيمات إلى 402Å، احتفظ بالمعلمات المتبقية مع القيم الافتراضية. قم بتشغيله.
5. انقر على تحليل النتائج ومن ثم في حجم العرض مع: شرائح. تحقق من أن حجم دقة منخفضة ولكن مع الشكل الرئيسي للهيكل يتم الحصول عليها (الشكل التكميلي 13).
6. الآن ، pwem مفتوحة -- مجموعات الانضمام إلى الجمع بين وحدات التخزين الأولية اثنين ولدت لإنشاء الإدخال إلى طريقة توافق الآراء. ما سوى الإشارة إلى وحدات التخزين كنوع إدخال وتحديد مجلدين أوليين في مجموعة الإدخال. قم بتشغيله. يجب أن يكون الإخراج مجموعة تحتوي على عنصرين مع كلا المجلدين.
7. أداة توافق الآراء هي تلك المدرجة في xmipp3 -- سرب ^consensus25. افتح ذلك. استخدام صور كاملة الحجم الجزيئات جيدة في القرار الكامل (إخراج 5.5)، كما وحدات التخزين الأولية مجموعة مع اثنين من العناصر التي تم إنشاؤها في الخطوة السابقة، وتأكد من أن مجموعة التماثل هو c1. انقر على تنفيذ.
8. انقر على تحليل النتائج. تحقق من أنه تم الحصول على وحدة تخزين إخراج أكثر تفصيلا (الشكل 6). على الرغم من وجود المزيد من الضوضاء المحيطة بالهيكل ، إلا أن الحصول على مزيد من التفاصيل في خريطة الهيكل سيساعد على خطوات الصقل التالية لتجنب minima المحلية.
   ملاحظة: إذا كان UCSF ^Chimera26 متوفرا، استخدم الرمز الأخير في الجزء العلوي من الإطار لجعل مرئيات ثلاثية الأبعاد لوحدة التخزين التي تم الحصول عليها.
9. فتح وتنفيذ relion - 3D لصناعة السيارات ^refine10 لجعل أول تعيين الزاوي 3D من الجسيمات. حدد كجسيمات الإدخال إخراج 5.5، وتعيين قطر قناع الجسيمات إلى 402Å. في علامة التبويب خريطة ثلاثية الأبعاد المرجعية، حدد كمجلد إدخال الذي تم الحصول عليه في الخطوة السابقة، والتماثل ك c1، وفلتر التمرير المنخفض الأولي إلى 30Å (الشكل التكميلي 14).
10. انقر على تحليل النتائج. في نافذة جديدة حدد النهائي كحجم لتصور وانقر على حجم العرض مع: شرائح لرؤية حجم التي تم الحصول عليها. تحقق أيضا من ارتباط قذيفة فورييه (FSC) بالنقر على مخططات دقة العرض في إطار النتائج والتغطية الزاوي في التوزيع الزاوي العرض: مؤامرة 2D (الشكل 7). يحتوي المجلد المعاد بناؤه على تفاصيل أكثر بكثير (ربما مع بعض المناطق غير الواضحة في الجزء الخارجي من الهيكل) ، ويعبر FSC عتبة 0.143 حوالي 4.5Å. تغطي التغطية الزاوي المجال ثلاثي الأبعاد بأكمله.

تصنيف 7.3D: اكتشاف الحالات التوافقية

1. باستخدام نهج توافق الآراء، إذا كان يمكن اكتشاف حالات تشكيلية مختلفة في البيانات. open relion - تصنيف ثلاثي ^{الأبعاد10} (الشكل التكميلي 15). كما تستخدم جزيئات الإدخال تلك التي تم الحصول عليها للتو في 6.10 ، وتعيين قطر قناع الجسيمات إلى 402Å. في علامة التبويب خريطة 3D مرجع استخدام وحدة التخزين الإدخال التي تم الحصول عليها بعد الخطوة 6.10 تعيين التماثل إلى c1 و عامل التصفية ذات التمرير المنخفض الأولي إلى 15Å. وأخيرا، في علامة التبويب تحسين تعيين عدد الفئات إلى 3. قم بتشغيله.
2. تحقق من النتائج بالنقر على تحليل النتائج، حدد إظهار التصنيف في Scipion. وتظهر الفئات الثلاث التي تم إنشاؤها وبعض التدابير المثيرة للاهتمام. يجب أن تحتوي الفئتان الأوليان على عدد مماثل من الصور المخصصة (عمود الحجم ) وتبدو متشابهة جدا ، في حين أن الفئة الثالثة تحتوي على عدد أقل من الصور ومظهر أكثر ضبابية. أيضا، يجب أن تكون rlnAccuracyRotations و rlnAccuracyTranslations أفضل بشكل واضح للفئات الأولى. حدد أفضل فئتين وانقر على زر الفئات لإنشاء مجموعة فرعية تحتوي عليها.
3. كرر الخطوتين 7.1 و 7.2 لإنشاء مجموعة ثانية من الفئات الجيدة. وسيكون كلاهما مدخلا في أداة توافق الآراء.
4. فتح وتشغيل xmipp3 - فئات توافق الآراء 3D وحدد كفئات الإدخال المجموعتين الفرعيتين التي تم إنشاؤها في الخطوات السابقة.
5. انقر على تحليل النتائج. يتم عرض عدد الجسيمات المتزامنة بين الفئات: القيمة الأولى هي عدد الجسيمات المتزامنة في الفئة الأولى من المجموعة الفرعية 1 والفئة الأولى من المجموعة الفرعية 2، والقيمة الثانية هي عدد الجسيمات المتزامنة في الفئة الأولى من المجموعة الفرعية 1 والفئة الثانية من المجموعة الفرعية 2، إلخ. تأكد من أن الجسيمات يتم تعيينها عشوائيا إلى الفئات واحد أو اثنين، مما يعني أن طريقة التصنيف ثلاثي الأبعاد غير قادرة على العثور على تغييرات تشكيلية. وبالنظر إلى هذه النتيجة، سيتم استخدام مجموعة كاملة من الجسيمات لمواصلة المعالجة.

8.3D صقل: صقل التعيينات الزاوي للسكان متجانسة

1. ومرة أخرى، تطبيق نهج توافقي في هذه الخطوة. أولا، فتح وتشغيل pwem - مجموعة فرعية مع مجموعة كاملة من العناصر كما إخراج 6.9، جعل مجموعة فرعية عشوائية إلى نعم، وعدد العناصر إلى 5000. مع هذا، يتم إنشاء مجموعة فرعية من الصور مع محاذاة سابقة لتدريب الأسلوب المستخدم في الخطوة التالية.
2. فتح xmipp3 -- محاذاة عميقة ، تعيين الصور الإدخال كما إخراج الجسيمات الجيدة التي تم الحصول عليها في 5.5 ، حجم واحد كما حصل بعد 6.10 ، وإدخال التدريب تعيين واحد تم إنشاؤه في الخطوة السابقة ، والهدف من القرار إلى 10Å ، والحفاظ على المعلمات المتبقية مع القيم الافتراضية (الشكل التكميلي 16). انقر على تنفيذ.
3. انقر على تحليل النتائج للتحقق من التوزيع الزاوي الذي تم الحصول عليه ، حيث لا توجد اتجاهات مفقودة وتحسن التغطية الزاوي بشكل طفيف مقارنة بواحدة من 6.10 (الشكل 8).
4. فتح وتنفيذ xmipp3 - مقارنة الزوايا وحدد كجزيئات الإدخال 1 إخراج 6.9 والجسيمات الإدخال 2 الإخراج من 8.2، تأكد من أن مجموعة التماثل هو c1. هذه الطريقة بحساب الاتفاق بين xmipp3 -- محاذاة عميقة وrelion -- 3D السيارات صقل.
5. انقر على تحليل النتائج، تظهر قائمة الجسيمات، مع الاختلافات التي تم الحصول عليها في التحولات والزوايا. انقر على رمز شريط في الجزء العلوي من النافذة، سيتم فتح نافذة أخرى تسمح جعل المؤامرات من المتغيرات المحسوبة. حدد _xmipp_angleDiff وانقر على رسم لرؤية تمثيل الاختلافات الزاوي لكل جسيم. افعل الشيء نفسه مع _xmipp_shiftDiff. وفي هذه الأرقام، يتفق ما يقرب من نصف الجسيمات على كلا الطريقتين (الشكل 9). حدد الجسيمات ذات الاختلافات الزاوي أقل من 10º وإنشاء مجموعة فرعية جديدة.
6. الآن، افتح xmipp3 - highres27 لإجراء صقل محلي للزوايا المعينة. أولا، حدد كصور كاملة الحجم الصور التي تم الحصول عليها في الخطوة السابقة، وكما وحدات التخزين الأولية إخراج 6.9، تعيين نصف قطر الجسيمات إلى 150 بكسل، ومجموعة التماثل كما c1. في علامة التبويب تعيين الزاوي تعيين محاذاة الصورة إلى محلية وعدد التكرارات إلى 1 و الحد الأقصى. الهدف القرار كما 5Å/px (الشكل التكميلي 17). قم بتشغيله.
7. في علامة التبويب ملخص تحقق من أن حجم الإخراج أصغر من 300x300x300 بكسل مع حجم بكسل أعلى قليلا.
8. انقر على تحليل النتائج لمعرفة النتائج التي تم الحصول عليها. انقر على مخططات دقة العرض لرؤية FSC، وعلى وحدة تخزين العرض: أعيد بناؤها لرؤية حجم تم الحصول عليها (الشكل التكميلي 18). يتم الحصول على وحدة تخزين دقة جيدة قريبة من 4-3.5Å.
9. انقر على عرض جزيئات الإخراج، وفي النافذة مع قائمة الجسيمات، انقر على رمز شريط. في النافذة الجديدة، حدد اكتب كمخطط، مع 100 سلة، وحدد تسمية _xmipp_cost، واضغط أخيرا على الرسم (الشكل التكميلي 19). وبهذه الطريقة، يتم عرض الرسم البياني لتسمية التكلفة، والذي يحتوي على ارتباط الجسيمات مع اتجاه الإسقاط المحدد له. في هذه الحالة ، يتم الحصول على وظيفة الكثافة الأحادية ، وهي علامة على عدم وجود مجموعات مختلفة في مجموعة الجسيمات. وبالتالي سيتم استخدام كل منهم لمواصلة صقل
   ملاحظة: في حالة رؤية دالة كثافة متعددة الوسائط، يجب تحديد مجموعة الجسيمات التي تنتمي إلى الحد الأقصى الأعلى لمواصلة سير العمل فقط معها.
10. فتح وتنفيذ xmipp3 مرة أخرى -- highres مع متابعة من تشغيل السابقة؟ إلى نعم، تعيين ك صور كاملة الحجم تلك التي تم الحصول عليها بعد 8.5، وحدد السابقة تشغيل مع التنفيذ السابق من Highres Xmipp. في التبويب تعيين الزاوي تعيين محاذاة الصورة إلى محلية مع تكرار 1 و 2.6Å/px كدقة الهدف (الدقة الكاملة).
11. الآن يجب أن يحتوي الإخراج على وحدة تخزين بدقة كاملة (حجم 300x300x300 بكسل). انقر على تحليل النتائج للتحقق مرة أخرى من حجم التي تم الحصول عليها وFSC، والتي ينبغي الآن أن يكون حجم عالية الدقة في حوالي 3Å (الشكل 10).

9. التقييم وما بعد المعالجة

1. فتح xmipp3 - MonoRes28 المحلية. سيقوم هذا الأسلوب بحساب الدقة محليا. تعيين وحدة تخزين الإدخال التي تم الحصول عليها بعد 8.10 تعيين هل ترغب في استخدام half وحدات التخزين؟ إلى نعم ونطاق الدقة من 1 إلى 10Å. قم بتشغيله.
2. انقر على تحليل النتائج وحدد إظهار الرسم البياني الدقة وعرض الشرائح الملونة (الشكل 11). يتم عرض الدقة في الأجزاء المختلفة من وحدة التخزين. وينبغي أن تقدم معظم ال voxels الجزء المركزي من الهيكل قرارات حول 3Å، في حين يتم تحقيق أسوأ القرارات في الأجزاء الخارجية. أيضا ، يظهر الرسم البياني للقرارات لكل voxel مع ذروة حول (حتى أدناه) 3Å.
3. فتح وتشغيل xmipp3 - شحذ localdeblur29 لتطبيق شحذ. حدد كخريطة إدخال التي تم الحصول عليها في 8.10، وخريطة دقة التي تم الحصول عليها في الخطوة السابقة مع MonoRes.
4. انقر على تحليل النتائج للتحقق من وحدات التخزين التي تم الحصول عليها. افتح آخر واحد، المطابقة التكرار الأخير الخوارزمية. من المستحسن فتح وحدة التخزين باستخدام أدوات أخرى، مثل UCSF ^Chimera26، لرؤية ميزات وحدة التخزين بشكل أفضل في 3D (الشكل 12).
5. وأخيرا، افتح أداة التحقق المضمنة في xmipp3 - التحقق من صحة overfitting30 التي سوف تظهر كيف يتغير القرار مع عدد من الجسيمات. فتحه وتضمين جزيئات الإدخال الجسيمات التي تم الحصول عليها في الخطوة 8.5، تعيين حساب الضوضاء ملزمة للقرار؟ إلى نعم، مع حجم المرجع 3D الأولية كما إخراج 8.10. في خيارات متقدمة، تعيين عدد الجسيمات إلى "500 1000 1500 2000 3000 5000 10000 15000 20000" (الشكل التكميلي 20). قم بتشغيله.
6. انقر على تحليل النتائج. ستظهر قطعتان (الشكل 13) مع تطور الدقة ، في الخط الأخضر ، مع نمو عدد الجسيمات المستخدمة في إعادة الإعمار. يمثل الخط الأحمر القرار الذي تحقق مع إعادة بناء الضوضاء الغاوسية المنحازة. يحسن القرار مع الرقم الجسيمات وفروق عظيمة من الإعادة بناء من جزيئات يقارن إلى الواحدة من ضوضاء لاحظت, أي يكون مؤشر من يتلقى جزيئات مع معلومة جيدة إنشائية.
7. 10- ومن النتائج السابقة، يمكن تنفيذ تركيب نموذج في الحجم الذي تم تجهيزه، مما يسمح باكتشاف الهياكل البيولوجية للجزيئ الكلي.

النتائج

لقد استخدمنا مجموعة بيانات بلازموديوم فالسيباروم 80S ريبوسوم (دخول EMPIAR: 10028، EMDB الدخول : 2660) لإجراء الاختبار ، ومع بروتوكول Scipion المقدمة في القسم السابق ، عالية الدقة 3D إعادة بناء حجم الجزيئات الكبيرة في هذا المثال بالذات قد تحققت ، بدءا من المعلومات التي تم جمعها من المجهر التي تتكون من الصور الصاخبة جدا التي تحتوي على إسقاطات 2D في أي اتجاه للعينة.

يتم عرض النتائج الرئيسية التي تم الحصول عليها بعد تشغيل البروتوكول بأكمله في الشكل 10 والشكل 11 والشكل 12. يمثل الشكل 10 حجم ثلاثي الأبعاد تم الحصول عليه قبل المعالجة اللاحقة. في الشكل 10a، يمكن رؤية FSC من 3 Å، أنه قريب جدا من حد Nyquist (مع بيانات بحجم بكسل 1.34 Å، الحد Nyquist هو 2.6 Å). يظهر الشكل 10b بعض شرائح الحجم ثلاثي الأبعاد المعاد بناؤه مع مستويات عالية من التفاصيل والهياكل المحددة جيدا. في الشكل 11 يتم عرض النتائج بعد تحليل محلي لقرار حجم 3D التي تم الحصول عليها. ويمكن رؤية أن معظم voxels في هيكل تحقيق القرار أدناه 3 ألف ، وخاصة تلك الموجودة في الجزء المركزي من الهيكل. ومع ذلك، يظهر الجزء الخارجي قرارات أسوأ، ما يتفق مع عدم وضوح الظهور في تلك المناطق في شرائح الشكل 10b. ويبين الشكل 12 نفس الخريطة ثلاثية الأبعاد بعد المعالجة اللاحقة القادرة على إبراز الترددات الأعلى للحجم، والكشف عن مزيد من التفاصيل وتحسين التمثيل، وهو ما يمكن رؤيته خاصة في العرض التقديمي ثلاثي الأبعاد في الشكل 12c.

في الشكل 14، تم استخدام ^Chimera26 لرؤية تمثيل ثلاثي الأبعاد للحجم الذي تم الحصول عليه (الشكل 14a)، وما بعد المعالجة (الشكل 14ب)، وخريطة الدقة (الشكل 14c)، الملونة برمز اللون للقرارات المحلية. وهذا يمكن أن يعطي المزيد من المعلومات حول الهيكل الذي تم الحصول عليه. هذه الأداة مفيدة جدا للحصول على نظرة ثاقبة في نوعية حجم الحصول عليها، كما يمكن أن ينظر إلى تفاصيل صغيرة جدا في سياق 3D كله من الهيكل. عندما يكون القرار الذي تم تحقيقه كافيا، حتى بعض الأجزاء الكيميائية الحيوية من الهيكل يمكن العثور عليها (على سبيل المثال، ألفا-helices في الشكل 14d. في هذا الشكل، يجب تسليط الضوء على الدقة العالية التي تحققت في جميع الأجزاء المركزية من الهيكل ثلاثي الأبعاد، والتي يمكن أن ينظر إليها على أنها المناطق الزرقاء الداكنة في الشكل 14c.

وقد تحققت جميع النتائج السابقة بفضل الأداء الجيد للبروتوكول بأكمله، ولكن هذا قد لا يكون هو الحال. هناك عدة طرق لتحديد السلوك السيئ. في الحالة الأكثر عمومية، يحدث هذا عندما يكون الهيكل الذي تم الحصول عليه منخفض الدقة ولا يمكن أن يتطور إلى هيكل أفضل. ومن الأمثلة على ذلك الشكل 15. ويؤدي عدم وضوح الحجم (الشكل 15 ج) إلى انخفاض مستوى ال FSC، الذي يمكن رؤيته في منحنى FSC (الشكل 15a) والمسناز البياني للتقدير المحلي (الشكل 15ب). تم إنشاء هذا المثال باستخدام طريقة تحسين ثلاثية الأبعاد مع بيانات إدخال غير صحيحة، حيث كان يتوقع بعض الخصائص المحددة في مجموعة مدخلات الجسيمات التي لا تفي بها. كما يمكن أن نرى، من المهم جدا دائما أن نعرف كيف تتوقع أساليب مختلفة لتلقي البيانات وإعدادها بشكل صحيح. بشكل عام، عند الحصول على إخراج مثل الذي في الشكل 15 ، قد يكون هناك مشكلة في سير العمل المعالجة أو البيانات الأساسية.

هناك عدة نقاط تفتيش على طول سير العمل التي يمكن تحليلها لمعرفة ما إذا كان البروتوكول يتطور بشكل صحيح أم لا. على سبيل المثال، بعد الانتقاء مباشرة، يمكن للعديد من الطرق التي تمت مناقشتها سابقا ترتيب الجسيمات وإعطاء درجة لكل منها. في حالة وجود جزيئات سيئة ، تسمح هذه الطرق بتحديدها وإزالتها. أيضا، يمكن تصنيف 2D يكون مؤشرا جيدا من وجود مجموعة سيئة من الجسيمات. ويبين الشكل 16 مثالا على هذه المجموعة السيئة. في الشكل 16a، يتم عرض فئات جيدة تحتوي على بعض تفاصيل الهيكل، في حين يظهر الشكل 16b الطبقات السيئة، والتي هي صاخبة أو غير مركزة، في هذه الحالة الأخيرة يمكن أن نرى أن الانتقاء كان غير صحيح واثنين من الجسيمات ويبدو أن تظهر معا. نقطة تفتيش أخرى هي تقدير الحجم الأولي، ويبين الشكل 17 مثالا على التقديرات الأولية الجيدة (الشكل 17a) والسيئة (الشكل 17ب). تم إنشاء التقدير غير صحيح باستخدام إعداد غير صحيح للأسلوب. يجب أن يؤخذ في الاعتبار أن جميع الاجهزة يجب أن يتم بعناية، واختيار مناسب كل معلمة وفقا للبيانات التي يجري تحليلها. في حالة عدم وجود خريطة مع بعض المعلومات الهيكلية الحد الأدنى، فإن الصقل التالية لن تكون قادرة على الحصول على إعادة بناء جيدة.

عندما تكون المشكلة هي اقتناء سيئة ، والتي لا تحافظ على الأفلام المعلومات الهيكلية ، سيكون من المستحيل استخراج جزيئات جيدة منها والحصول على معالجة ناجحة. في هذه الحالة ، يجب جمع المزيد من الأفلام للحصول على إعادة بناء ثلاثية الأبعاد عالية الدقة. ولكن، إذا لم يكن الأمر كذلك، فهناك عدة طرق لإدارة المشاكل على طول سير العمل المعالج. إذا لم يكن الانتقاء جيدا بما فيه الكفاية ، فهناك عدة طرق لمحاولة إصلاحه ، على سبيل المثال ، تكرار الانتقاء ، أو استخدام أساليب مختلفة ، أو محاولة اختيار المزيد من الجسيمات يدويا لمساعدة الطرق على التعلم منها. أثناء التصنيف 2D، إذا كانت هناك فئات قليلة جيدة، فكر أيضا في تكرار عملية الانتقاء. في تقدير الحجم الأولي، حاول استخدام عدة طرق إذا أعطى بعضها نتائج غير دقيقة. وينطبق الشيء نفسه على التحسين ثلاثي الأبعاد. وبناء على هذا المنطق، تم في هذه المخطوطة عرض عدة أدوات توافقية، يمكن أن تكون مفيدة جدا لتجنب المشاكل ومواصلة المعالجة ببيانات دقيقة. وبفضل استخدام توافق في الآراء بين عدة أساليب، يمكننا تجاهل البيانات التي يصعب انتقاؤها وتصنيفها ومواءمتها، وما إلى ذلك، وهو ما قد يكون مؤشرا على ضعف البيانات. ومع ذلك، إذا كانت هناك عدة طرق قادرة على الاتفاق في الناتج الناتج، فمن المحتمل أن تحتوي هذه البيانات على معلومات قيمة يمكن من خلالها مواصلة المعالجة.

نحن نشجع القارئ على تنزيل المزيد من مجموعات البيانات ومحاولة معالجتها وفقا للتوصيات الواردة في هذه المخطوطة وإنشاء سير عمل مماثل يجمع بين حزم المعالجة باستخدام Scipion. محاولة معالجة مجموعة البيانات هي أفضل طريقة لمعرفة قوة أدوات المعالجة المتاحة في أحدث الوسائل في Cryo-EM ، لمعرفة أفضل القواعد للتغلب على العيوب المحتملة التي تظهر أثناء المعالجة ، وتعزيز أداء الأساليب المتاحة في كل حالة اختبار محددة.

الشكل 1 - الأرقام 1- الأرقام 1 نتيجة محاذاة الفيلم. (أ) النافذة الرئيسية للنتائج، مع قائمة بجميع الصور الدقيقة المولدة ومعلومات إضافية: كثافة الطيفية للقوة، ومسار المحاذاة المقدرة في الإحداثيات القطبية، ونفس الإحداثيات الديكارتية، واسم الملف للميكروجراف المولد. (ب) مسار المحاذاة الممثل في الإحداثيات الديكارتية. (ج) المجهر المتولد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2 - الأرقام 2- الأرقام التي تم تقدير CTF مع نتيجة Ctffind. وتشمل النافذة الرئيسية التي تتضمن النتائج رقما مع تقدير شعبة القطاع الخاص (في زاوية) إلى جانب شعبة القطاع الخاص القادمة من البيانات، والعديد من المظلات defocus. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3 - الأرقام 3- الأرقام التي يمكن أن نوافذ الانتقاء اليدوية مع Xmipp. (أ) النافذة الرئيسية التي بها قائمة بالخطوط الدقيقة التي يتعين معالجتها وبعض البارامترات الأخرى. (ب) التقاط الجسيمات يدويا داخل منطقة من ميكروجراف. (ج) و (د) الجسيمات التي يتم انتقاؤها تلقائيا ليتم الإشراف عليها لإنشاء مجموعة من جزيئات التدريب لطريقة الانتقاء التلقائي Xmipp. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4 - الأرقام 4- الأرقام التي تم ال اختيار توافق عميق مع نتيجة Xmipp. المعلمة zScoreDeepLearning يعطي وزنا لخير الجسيمات وأنه هو المفتاح لاكتشاف الجسيمات السيئة. (أ) ترتبط أدنى قيم zScores مع القطع الأثرية. (ب) ترتبط أعلى الدرجات بالجزيئات التي تحتوي على الجزيئات الكبيرة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5 - الأرقام 5- الأرقام التي تم تصنيف 2D مع نتيجة كريوسبارك. وتظهر الفئات المتولدة (متوسطات مجموعات فرعية من الجسيمات القادمة من نفس الاتجاه). العديد من الفئات الجيدة التي تم اختيارها باللون الأحمر (مع بعض مستوى التفاصيل) وبعض الفئات السيئة غير المحددة (فصول صاخبة وغير مركزة). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6 - الأرقام 6- الأرقام 10 حجم 3D الأولي مع نتيجة إجماع سرب. وجهة نظر من حجم 3D الأولية التي تم الحصول عليها بعد تشغيل أداة توافق الآراء xmipp3 -- سرب توافق الآراء ، وذلك باستخدام التقديرات السابقة حجم 3D الأولية من Xmipp وRelion. (أ) يتم تمثيل وحدة التخزين بشرائح. (ب) التصور ثلاثي الأبعاد للمجلد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 7 - الأرقام 7- الأرقام التي تم صقل حجم 3D الأولي مع نتيجة Relion. (أ) منحنى FSC الذي تم الحصول عليه، متجاوزا العتبة عند 4.5 ألف، تقريبا. (ب) التغطية الزاويه التي تظهر كرؤية عليا للمجال ثلاثي الأبعاد. في هذه الحالة ، حيث لا يوجد تماثل ، يجب أن تغطي الجسيمات المخصصة المجال بأكمله. (ج) الحجم المكرر الذي تمثله الشرائح. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 8 - الأرقام 8- الأرقام التي تم محاذاة ثلاثية الأبعاد على أساس التعلم العميق مع نتيجة Xmipp. النتائج التي تم إنشاؤها بواسطة xmipp3 - طريقة المحاذاة العميقة للمحاذاة ثلاثية الأبعاد. (أ) الاحالة الزاوية لكل جسيم في شكل مصفوفة تحويل. (ب) التغطية الزاوي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 9 - الأرقام 10-199 نتيجة توافق الآراء محاذاة 3D. (أ) قائمة بالجسيمات التي لها اختلافات محصل عليها في معلمات الإزاحة والزوايا. (ب) قطعة من الاختلافات الزاوي لكل جسيم. (ج) رسم فرق التحول لكل جسيم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 10 - الأرقام 10- الأرقام التي تم 1 التكرار النهائي لنتيجة التحسين ثلاثي الأبعاد. (أ) منحنى FSC. (ب) حجم تم الحصول عليه بدقة كاملة حسب الشرائح. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 11 - الأرقام 11- الأرقام التي تم 1 تحليل الدقة المحلية مع نتيجة Xmipp. نتائج الأسلوب xmipp3 - MonoRes المحلية. (أ) بعض الشرائح التمثيلية الملونة بقيمة الدقة لكل voxel، كما هو مبين في رمز اللون. (ب) الرسم البياني المحلي للدقة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 12 - الأرقام 12- الأرقام التي تم 1 شحذ مع نتيجة Xmipp. نتائج xmipp3 - طريقة شحذ localdeblur . (أ) قائمة وحدات التخزين التي تم الحصول عليها لكل تكرار. (ب) وحدة تخزين ثلاثية الأبعاد تم الحصول عليها بعد التكرار الأخير ممثلة بشرائح. (ج) تمثيل ثلاثي الأبعاد للمجلد النهائي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 13 - الأرقام 13- الأرقام التي تم 1 التحقق من صحة أداة الاحتواء الزائد في نتيجة Xmipp. نتائج xmipp3 - التحقق من الصحة overfitting. الخط الأخضر يتوافق مع إعادة الإعمار من البيانات، والخط الأحمر من الضوضاء. (أ) عكس الدقة التربيعية مع لوغارتم عدد الجسيمات. (ب) الاستبانة بعدد الجسيمات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 14 - الأرقام 14- الأرقام التي تم العرف تمثيلات ثلاثية الأبعاد متعددة للحجم الذي تم الحصول عليه. (أ) حجم المعالجة المسبقة. (ب) حجم ما بعد المعالجة. (ج) الدقة المحلية، والأصوات الزرقاء الداكنة هي تلك التي لها دقة أعلى (2.75 ألف) والأصوات الحمراء الداكنة هي تلك التي لها دقة أقل (10.05Å). (د) تكبير حجم ما بعد المعالجة حيث يمكن رؤية ألفا الحلزون (البيضاوي الأحمر). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 15 - الأرقام 15- الأرقام التي تم 1 مثال على إعادة بناء 3D سيئة. (أ) منحنى FSC مع هبوط حاد وعبور العتبة عند دقة منخفضة. (ب) الرسم البياني المحلي للدقة. (ج) حجم 3D حسب الشرائح. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 16 - الأرقام 16- الأرقام التي تم 1 مثال على الفئات 2D. (أ) فصول دراسية جيدة تبين مستوى معين من التفاصيل. (ب) الطبقات السيئة التي تحتوي على الضوضاء والتحف (الجزء العلوي التي تم الحصول عليها مع Xmipp، وانخفاض مع CryoSparc). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 17 - الأرقام 17- الأرقام التي تم 1 مثال على حجم 3D الأولية مع الصفات المختلفة. (أ) حجم أولي جيد حيث يمكن ملاحظة شكل الجزيئات الكبيرة. (ب) الحجم الأولي السيئ حيث يختلف الشكل الذي تم الحصول عليه تماما عن الشكل المتوقع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي 1- الزيادة في النسبة إلى 100 في المائة من ال إنشاء مشروع Scipion. نافذة معروضة من قبل Scipion حيث يمكن تحديد مشروع قديم أو يمكن إنشاء مشروع جديد يعطي اسما وموقعا لهذا المشروع. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل التكميلي 2- الأرقام التكميلية 2- الأرقام التكميلية 2- ال استيراد طريقة الأفلام. نافذة عرضها من قبل Scipion عندما pwem -- استيراد الأفلام مفتوحة. هنا ، يجب تضمين معلمات الاستحواذ الرئيسية للسماح للأفلام المتاحة لمعالجتها في Scipion. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل التكميلي 3- الأرقام التكميلية 3- الأرقام التكميلية 3- ال طريقة محاذاة الفيلم. النافذة المعروضة من قبل Scipion عند استخدام xmipp3 - المحاذاة البصرية . يجب تعبئة أفلام الإدخال ونطاق الإطارات التي يتم النظر فيها للمحاذاة وبعض المعلمات الأخرى لمعالجة الأفلام. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل التكميلي 4- الأرقام التكميلية 4- الأرقام التكميلية 4- ال CTF طريقة التقدير مع Ctffind. النموذج في Scipion مع كافة الحقول الضرورية لتشغيل برنامج Ctffind. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل التكميلي 5- الأرقام التكميلية 5- الأرقام التكميلية 5- ال ساحر في سيبيون. معالج لمساعدة المستخدم على تعبئة بعض المعلمات في النموذج. في هذه الحالة، المعالج هو لإكمال حقل الدقة في الأسلوب غريغوريفلاب - ctffind . الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل التكميلي 6- الزيادة في النسبة إلى 10 في المائة من النسبة CTF طريقة الصقل مع Xmipp. شكل xmipp3 - تقدير ctf مع جميع المعلمات لجعل صقل CTF المقدرة سابقا .

الشكل التكميلي 7- الزيادة في النسبة إلى 100 في المائة من ال طريقة التصوير المجهري للمعالجة المسبقة. شكل xmipp3 - ميكروجرافات المعالجة المسبقة التي تسمح بتنفيذ بعض العمليات عليها. في هذا المثال، إزالة بكسل سيئة و micrographs داونسامبل هو واحد مفيد. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل التكميلي 8- الأرقام التكميلية 8- الأرقام التكميلية 8- ال طريقة الانتقاء مع Cryolo. النموذج لتشغيل طريقة اختيار Cryolo باستخدام شبكة مدربة مسبقا. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل التكميلي 9- الزيادة في النسبة إلى 100 في المائة من ال توافق الآراء اختيار الأسلوب مع Xmipp. شكل xmipp3 - انتقاء توافق عميق على أساس التعلم العميق لحساب توافق الآراء من الإحداثيات، وذلك باستخدام شبكة مدربة مسبقا على عدة مجموعات من الإحداثيات التي تم الحصول عليها مع أساليب الانتقاء المختلفة. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل التكميلي 10- الأرقام التكميلية 10- الأرقام التكميلية 10- ال استخراج الجسيمات الأسلوب. إدخال وعلامات التبويب المعالجة المسبقة من xmipp3 - استخراج الجسيمات. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل التكميلي 11.3D طريقة الحجم الأولي مع Xmipp. شكل الأسلوب xmipp3 - إعادة بناء كبيرة للحصول على خريطة 3D الأولية. يتم عرض علامتي التبويب الإدخال والمعايير . الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل التكميلي 12- الأرقام التكميلية 12- الأرقام التكميلية 12- ال تغيير حجم أسلوب وحدة التخزين. النموذج الذي يتم إجراء اقتصاص أو تغيير حجم وحدة تخزين. في هذا المثال، يتم استخدام هذا الأسلوب لإنشاء وحدة تخزين كاملة الحجم بعد xmipp3 - إعادة بناء كبيرة. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل التكميلي 13.3D المجلد الأولي مع نتيجة Relion. طريقة عرض للحجم الأولي ثلاثي الأبعاد الذي تم الحصول عليه باستخدام relion - طريقة النموذج الأولي ثلاثي الأبعاد بواسطة الشرائح. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل التكميلي 14- الأرقام التكميلية 14- الأرقام التكميلية 14- ال صقل الحجم الأولي مع Relion. شكل relion الأسلوب -- 3D لصناعة السيارات في صقل. في هذا المثال، تم استخدامه لتحسين حجم أولي مقدر بعد توافق الآراء. يتم عرض علامتي التبويب خريطة ثلاثية الأبعاد الإدخال والمرجع. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل التكميلي 15.3D طريقة التصنيف. شكل relion - تصنيف ثلاثي الأبعاد. يتم عرض علامات التبويب الإدخال والخريطة ثلاثية الأبعاد المرجعية والتحسين . الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل التكميلي 16.3D المحاذاة على أساس طريقة التعلم العميق. فتح النموذج للأسلوب xmipp3 - محاذاة عميقة. هنا من الضروري تدريب شبكة مع مجموعة التدريب، ثم أن الشبكة سوف التنبؤ الاحالة الزاوي لكل جسيم. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل التكميلي 17.3D طريقة الصقل. شكل xmipp3 - طريقة highres. يتم عرض إدخال علامات التبويب والتعيين الزاوي. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل التكميلي 18- الأرقام التكميلية 18- الأرقام التكميلية 18- ال التكرار الأول لنتيجة التحسين ثلاثي الأبعاد. (أ) منحنى FSC. (ب) الحجم المحصل عليه (بحجم أصغر من الحجم الكامل) الممثل كشرائح. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل التكميلي 19- الأرقام التكميلية 19- الأرقام التكميلية 19- ال التكرار الأول لتحليل ارتباط الصقل ثلاثي الأبعاد. تظهر نافذة جديدة بالنقر فوق رمز الشريط في الجزء العلوي من النافذة مع قائمة الجسيمات. في إطار أعمدة الرسم يمكن إنشاء رسم بياني للمعلمة المقدرة المطلوبة. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل التكميلي 20- الأرقام التكميلية 20- الأرقام التكميلية 20- ال أداة التثبيت فوق المصادقة. شكل xmipp3 - التحقق من صحة طريقة الاحتواء الزائد . الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Discussion

حاليا، التبريد-EM هو أداة رئيسية للكشف عن هيكل 3D من العينات البيولوجية. عندما يتم جمع بيانات جيدة مع المجهر، وأدوات المعالجة المتاحة تسمح لنا للحصول على إعادة بناء 3D من الجزيئات الكلية قيد الدراسة. معالجة البيانات Cryo-EM قادرة على تحقيق دقة شبه ذرية، وهو أمر أساسي لفهم السلوك الوظيفي للجزيء الكلي، وهو أيضا أمر بالغ الأهمية في اكتشاف المخدرات.

Scipion هو برنامج يسمح بإنشاء سير العمل بأكمله يجمع بين حزم معالجة الصور الأكثر ملاءمة بطريقة تكاملية ، مما يساعد على تتبع وإعادة إنتاج سير عمل معالجة الصور بأكمله. Scipion يوفر مجموعة كاملة جدا من الأدوات لتنفيذ المعالجة؛ ومع ذلك، يعتمد الحصول على عمليات إعادة بناء عالية الدقة بشكل كامل على جودة البيانات المكتسبة وكيفية معالجة هذه البيانات.

للحصول على إعادة بناء ثلاثية الأبعاد عالية الدقة ، فإن المطلب الأول هو الحصول على أفلام جيدة من المجهر ، والتي تحافظ على المعلومات الهيكلية بدقة عالية. إذا لم يكن هذا هو الحال، سير العمل لن تكون قادرة على استخراج معلومات عالية الوضوح من البيانات. ثم، يجب أن يكون سير عمل المعالجة الناجح قادرا على استخراج الجسيمات التي تتوافق حقا مع البنية والعثور على اتجاهات هذه الجسيمات في الفضاء ثلاثي الأبعاد. إذا فشلت أي من الخطوات في سير العمل، سيتم تخفيض جودة وحدة التخزين المعاد بناؤها. يسمح Scipion باستخدام حزم مختلفة في أي من خطوات المعالجة ، مما يساعد على العثور على النهج الأكثر ملاءمة لمعالجة البيانات. وعلاوة على ذلك، وبفضل توفر العديد من الحزم، يمكن استخدام أدوات توافق الآراء، التي تعزز الدقة من خلال التوصل إلى اتفاق في النواتج المقدرة لمختلف الأساليب. كما تمت مناقشته بالتفصيل في قسم النتائج التمثيلية العديد من أدوات التحقق من الصحة وكيفية تحديد النتائج الدقيقة وغير الدقيقة في كل خطوة من سير العمل، للكشف عن المشاكل المحتملة، وكيفية محاولة حلها. هناك عدة نقاط تفتيش على طول البروتوكول التي يمكن أن تساعد على تحقيق ما إذا كان البروتوكول قيد التشغيل بشكل صحيح أم لا. بعض من أهمها: الانتقاء، التصنيف 2D، تقدير الحجم الأولي، والمحاذاة ثلاثية الأبعاد. التحقق من المدخلات، وتكرار الخطوة بطريقة مختلفة، أو باستخدام توافق الآراء، هي الخيارات المتاحة في Scipion التي يمكن للمستخدم استخدامها لإيجاد حلول عندما تظهر القضايا.

فيما يتعلق بالنهج السابقة لدمج الحزمة في مجال Cryo-EM ، ^Appion31 هو الوحيد الذي يسمح بالتكامل الحقيقي لحزم البرامج المختلفة. ومع ذلك ، يرتبط Appion بإحكام مع ^Leginon32 ، وهو نظام لجمع الصور الآلي من المجاهر الإلكترونية. الفرق الرئيسي مع Scipion هو أن نموذج البيانات والتخزين أقل اقترانا. في مثل هذه الطريقة ، لإنشاء بروتوكول جديد في Scipion ، يحتاج فقط إلى تطوير سيناريو Python. ومع ذلك، في Appion، يجب على المطور كتابة البرنامج النصي وتغيير قاعدة البيانات الأساسية. وباختصار، تم تطوير Scipion لتبسيط الصيانة والتمدد.

قدمنا في هذه المخطوطة سير عمل كامل لمعالجة Cryo-EM ، باستخدام مجموعة بيانات الحالة الحقيقية ل Plasmodium falciparum 80S Ribosome (إدخال EMPIAR: 10028 ، إدخال EMDB: 2660). يمكن تلخيص الخطوات التي تمت تغطيتها ومناقشتها هنا على أنها محاذاة الأفلام وتقدير CTF واختيار الجسيمات والتصنيف 2D وتقدير الخريطة الأولي والتصنيف ثلاثي الأبعاد والصقل ثلاثي الأبعاد والتقييم والمعالجة اللاحقة. واستخدمت مجموعات مختلفة من المقترحات، وطبقت أدوات توافق الآراء في العديد من هذه الخطوات. حقق المجلد النهائي المعاد بناؤه ثلاثي الأبعاد قرارا قدره 3 Å ، وفي حجم ما بعد المعالجة ، يمكن تمييز بعض الهياكل الثانوية ، مثل ألفا - helices ، مما يساعد على وصف كيفية ترتيب الذرات في الفضاء.

يوضح سير العمل المعروض في هذه المخطوطة كيف يمكن استخدام Scipion للجمع بين حزم Cryo-EM المختلفة بطريقة مباشرة ومتكاملة لتبسيط المعالجة ، والحصول على نتيجة أكثر موثوقية في نفس الوقت.

في المستقبل ، فإن تطوير أساليب وحزم جديدة سوف تستمر في النمو والبرمجيات مثل Scipion لدمج بسهولة كل منهم سيكون أكثر أهمية للباحثين. وستكون نهج توافق الآراء أكثر أهمية حتى في هذه الحالات، عندما تتوفر الكثير من الأساليب ذات الأساس المختلف، مما يساعد على الحصول على تقديرات أكثر دقة لجميع البارامترات التي تنطوي عليها عملية إعادة الإعمار في كريو -م. تتبع وإعادة إنتاجها هي المفتاح في عملية البحث وأسهل لتحقيق مع Scipion بفضل وجود إطار مشترك لتنفيذ مهام سير العمل كاملة.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
no material is used in this article	-	-	-