Scipion ile Kriyo-EM ve Tek Parçacık Analizi

Özet

Kriyo-elektron mikroskopisinde tek parçacık analizi, biyolojik toplulukların yapısını yüksek çözünürlükte belirlemek için kullanılan ana tekniklerden biridir. Scipion, mikroskop tarafından elde edilen bilgileri işlemek ve biyolojik numunenin 3D yeniden yapılandırılmasını sağlamak için tüm boru hattını oluşturmak için araçlar sağlar.

Özet

Kriyo-elektron mikroskopisi, makromoleküllerin yapısal bilgilerini atoma yakın çözünürlükte ortaya çıkarmak için biyolojik araştırmalarda en önemli araçlardan biri haline gelmiştir. Tek parçacıklı analizde, vitrifiye numune bir elektron ışını tarafından görüntülenir ve mikroskop sütununun sonundaki dedektörler bu örneğin filmlerini üretir. Bu filmler rastgele yönelimlerde aynı parçacıkların binlerce görüntüsü içerir. Verilerin, son 3D yeniden yapılandırılmış birimi elde etmek için birden çok adıma sahip bir görüntü işleme iş akışından geçmesi gerekir. Görüntü işleme iş akışının amacı, incelenmek üzere numuneyi yeniden oluşturabilmek için edinme parametrelerini tanımlamaktır. Scipion, tümleştirici bir çerçevede çeşitli görüntü işleme paketleri kullanarak bu iş akışını oluşturmak için tüm araçları sağlar ve ayrıca sonuçların izlenebilirliğine izin verir. Bu makalede, Scipion'daki tüm görüntü işleme iş akışı, mikroskop tarafından elde edilen filmlerden yüksek çözünürlüklü bir son 3D rekonstrüksiyonuna gitmek için gerekli tüm ayrıntıları vererek gerçek bir test durumundan gelen verilerle sunulmakta ve tartışılmaktadır. Ayrıca, yöntemlerin birleştirilmesine izin veren konsensüs araçlarını kullanmanın ve iş akışının her adımı boyunca sonuçları onaylamanın, elde edilen sonuçların doğruluğunu artırmanın gücü tartışılmaktadır.

Giriş

Kriyo-elektron mikroskopisinde (kriyo-EM), vitrifiye dondurulmuş nemlendirilmiş örneklerin tek parçacık analizi (SPA), moleküler etkileşimleri ve biyolojik toplulukların işlevini anlamaya izin verdiği için biyolojik makromoleküller için görüntülemenin en yaygın kullanılan ve başarılı varyantlarından ^biridir1. Bu, "çözünürlük devrimi"^2'ye yol açan ve atoma yakın çözünürlükle biyolojik 3D yapıların başarılı bir şekilde belirlenmesine izin veren bu görüntüleme tekniğindeki son gelişmeler sayesindedir. Şu anda SPA cryo-EM'de elde edilen en yüksek çözünürlük apoferritin3 için 1,15 şidi (EMDB girişi: 11668). Bu teknolojik gelişmeler, örnek ^hazırlama4, görüntü ^alma5 ve görüntü işleme yöntemlerinde iyileştirmeler ^içerir6. Bu makale bu son noktaya odaklanmıştır.

Kısaca, görüntü işleme yöntemlerinin amacı, mikroskopun görüntüleme sürecini tersine çevirmek ve incelenmekte olan biyolojik örneğin 3D yapısını kurtarmak için tüm edinme parametrelerini tanımlamaktır. Bu parametreler, kameranın kazancı, ışın kaynaklı hareket, mikroskop sapmaları (özellikle defokus), her parçacığın 3D açısal yönelimi ve çevirisi ve konformasyonel değişikliklere sahip bir numuneye sahip olması durumunda konformasyonel durumdur. Bununla birlikte, parametre sayısı çok yüksektir ve cryo-EM radyasyon hasarını önlemek için düşük dozlu görüntüler kullanmayı gerektirir, bu da elde edilen görüntülerin Sinyal-Gürültü Oranını (SNR) önemli ölçüde azaltır. Bu nedenle, sorun kesin olarak çözülemez ve hesaplanacak tüm parametreler yalnızca tahminler olabilir. Görüntü işleme iş akışı boyunca, sonunda yüksek çözünürlüklü bir 3D yeniden yapılandırma elde etmek için kalanları atarak doğru parametreler tanımlanmalıdır.

Mikroskop tarafından oluşturulan veriler çerçeveler halinde toplanır. Basitleştirici olan çerçeve, elektron sayma dedektörleri kullanıldığında görüntüde belirli bir konuma (piksel) ulaşan elektron sayısını içerir. Belirli bir görüş alanında, birkaç kare toplanır ve buna film denir. Numuneyi yok edebilecek radyasyon hasarını önlemek için düşük elektron dozları kullanıldığından, SNR çok düşüktür ve örnek hakkında yapısal bilgileri ortaya çıkaran bir görüntü elde etmek için aynı filme karşılık gelen karelerin ortalamasının alınması gerekir. Bununla birlikte, sadece basit bir ortalama uygulanmaz, numune, denge edilmesi gereken ışın kaynaklı hareket nedeniyle görüntüleme süresi boyunca kaymalara ve diğer hareket türlerine maruz kalabilmemektedir. Kaydırma telafisi ve ortalama çerçeveler bir mikrografiden kaynaklanır.

Mikrograflar elde edildikten sonra, mikroskop tarafından her biri için tanıtılan sapmaları tahmin etmemiz gerekir, kontrast aktarım fonksiyonu (CTF), bu da mikro grafiğin kontrastındaki değişiklikleri frekansın bir işlevi olarak temsil eder. Daha sonra, parçacık toplama adı verilen parçacıklar seçilebilir ve çıkarılabilir. Her parçacık, incelenmekte olan numunenin sadece bir kopyasını içeren küçük bir görüntü olmalıdır. Parçacık toplama için üç algoritma ailesi vardır: 1) parçacığın görünümünün sadece bazı temel parametrelendirmesini kullanarak tüm mikrografi kümesinde (örneğin, parçacık boyutu), 2) parçacıkların nasıl göründüğünü kullanıcıdan veya önceden eğitilmiş bir kümeden öğrenenler ve 3) görüntü şablonlarını kullananlar. Her ailenin daha sonra gösterilecek farklı özellikleri vardır.

Mikrograflarda bulunan çıkarılan parçacık kümesi, iki hedefi olan bir 2B sınıflandırma işleminde kullanılacaktır: 1) saf gürültü görüntüleri, çakışan parçacıklar veya diğer eserler içeren alt kümeyi atarak parçacık kümesinin temizlenmesi ve 2) her sınıfı temsil eden ortalama parçacıklar, 3B başlangıç hacmini hesaplamak için ilk bilgi olarak kullanılabilir.

3D başlangıç hacmi hesaplaması bir sonraki önemli adımdır. 3B yapıyı elde etme sorunu, küresel minimumun orijinal yapıyı temsil eden en iyi 3B birim olduğu, ancak yetersiz çözümleri temsil eden birkaç yerel minimanın bulunabildiği ve tuzağa düşmenin çok kolay olduğu çok boyutlu bir çözüm ortamında optimizasyon sorunu olarak görülebilir. başlangıç hacmi, arama işleminin başlangıç noktasını temsil eder, bu nedenle kötü başlangıç hacmi tahmini, genel minimum noktayı bulmamızı engelleyebilir. İlk hacimden itibaren, 3D sınıflandırma adımı farklı konformasyon durumlarını keşfetmeye ve parçacık kümesini tekrar temizlemeye yardımcı olacaktır; amaç yapısal olarak homojen bir parçacık popülasyonu elde etmektir. Bundan sonra, mümkün olan en iyi 3D hacmi elde etmek için her parçacık için açısal ve çeviri parametrelerini rafine etmekten bir 3D iyileştirme adımı sorumlu olacaktır.

Son olarak, son adımlarda, elde edilen 3D rekonstrüksiyon keskinleştirilebilir ve parlatılabilir. Keskinleştirme, yeniden inşa edilen hacmin yüksek frekanslarını artırma işlemidir ve parlatma, CTF veya ışın kaynaklı hareket telafisi olarak bazı parametreleri parçacıklar düzeyinde daha da iyileştirmek için bir adımdır. Ayrıca, iş akışının sonunda elde edilen çözünürlüğü daha iyi anlamak için bazı doğrulama yordamları kullanılabilir.

Tüm bu adımlardan sonra, izleme ve yerleştirme ^işlemleri7 , atomik modeller de novo inşa ederek veya mevcut modelleri sığdırarak elde edilen 3D rekonstrüksiyona biyolojik bir anlam kazandırmaya yardımcı olacaktır. Yüksek çözünürlük elde edilirse, bu süreçler bize biyolojik yapıların, hatta farklı atomların yapımızdaki konumlarını söyleyecektir.

^Scipion8, en alakalı görüntü işleme paketlerini bütünleştirici bir şekilde birleştirerek tüm iş akışının oluşturulmasına olanak tanır. ^Xmipp9, Relion10, CryoSPARC11, ^Eman12, ^Spider13, ^Cryolo14, Ctffind15, CCP416, Phenix17 ve daha birçok paket Scipion'a dahil edilebilir. Ayrıca, tüm görüntü işleme iş akışının tam bir izlemesini yapmak için entegrasyon, birlikte çalışabilirlik, izlenebilirlik ve tekrarlanabilirlik için gerekli tüm araçları ^içerir8.

Scipion'un kullanmamıza izin verdiği en güçlü araçlardan biri, işlemin bir adımında elde edilen sonuçları birkaç yöntemle karşılaştırmak ve daha doğru bir çıktı oluşturmak için farklı yöntemlerle aktarılan bilgilerin bir kombinasyonunu yapmak anlamına gelen fikir birliğidir. Bu, tahmini parametrelerde performansı artırmaya ve elde edilen kaliteyi artırmaya yardımcı olabilir. Konsensüs yöntemleri kullanılmadan daha basit bir iş akışının oluşturabileceğini unutmayın; ancak, bu aracın gücünü ^{gördük22,25} ve bu yazıda sunulan iş akışı birkaç adımda kullanacaktır.

Önceki paragraflarda özetlenen tüm adımlar aşağıdaki bölümde ayrıntılı olarak açıklanacak ve Scipion kullanılarak eksiksiz bir iş akışında birleştirilecektir. Ayrıca, oluşturulan çıktılarda daha yüksek bir anlaşma elde etmek için konsensüs araçlarının nasıl kullanılacağı gösterilecektir. Bu amaçla, Plasmodium falciparum 80S Ribozom'un örnek veri kümesi seçilmiştir (EMPIAR girişi: 10028, EMDB girişi: 2660). Veri kümesi, 4096x4096 piksel boyutunda 16 karelik 600 filmden oluşur ve FEI FALCON II kameralı bir FEI POLARA 300'de çekilen 1.34şpiksel boyutunda, EMDB'de bildirilen çözünürlük ^3.2Å18 'dir.

Protokol

1. Scipion'da bir proje oluşturma ve verileri içe aktarma

1. Scipion'u açın ve Proje Oluştur'a tıklayın, projenin adını ve kaydedileceği konumu belirtin (Ek Şekil 1). Scipion, sol tarafta, kullanılabilir yöntemlerin listesini içeren bir panel içeren bir tuval gösteren proje penceresini açar, her biri verileri yönetmek için kullanılabilecek bir görüntü işleme aracını temsil eder.
   NOT: Ctrl+F , listede görünmüyorsa bir yöntem bulmak için kullanılabilir.
2. Mikroskop tarafından çekilen filmleri içe aktarmak için pwem ' i seçin - sol panelde filmleri içe aktarın (veya Ctrl+F tuşlarına basarken yazın).
3. Yeni bir pencere açılacaktır (Ek Şekil 2). Burada, verilerin yolunu ve edinme parametrelerini ekleyin. Bu örnekte, aşağıdaki kurulumu kullanın: Mikroskop voltajı 300 kV, Küresel sapma 2,0 mm, Genlik Kontrastı 0,1, Büyütme hızı 50000, Örnekleme hızı modundan Görüntüden'e ve Piksel boyutu 1,34 Å. Formdaki tüm parametreler doldurulduğu zaman Yürüt düğmesini tıklatın.
   NOT: Bir yöntem başlatıldığında, tuvalde çalışıyor olarak etiketlenmiş sarı renkte bir kutu görünür. Bir yöntem tamamlandığında, kutu yeşile, etiket de tamamlandı olarak değişir. Bir yöntemin yürütülmesi sırasında bir hata olması durumunda, kutu başarısız olarak etiketlenmiş kırmızı olarak görünür. Bu durumda, tuvalin alt kısmını kontrol edin, Çıktı Günlüğü sekmesinde hatanın açıklaması görünecektir.
4. Yöntem tamamlandığında, Özet sekmesinde tuvalin alt kısmındaki sonuçları kontrol edin. Burada, yöntem tarafından oluşturulan çıktılar sunulur, bu durumda, film kümesi. Sonuçları Analiz Et düğmesine tıklanın ve filmlerin listesiyle birlikte yeni bir pencere görünecektir.

2. Film hizalaması: filmlerden mikrograflara

1. Optik ^akış19 uygulayan xmipp3 - optik hizalama yöntemini kullanın. Formu doldurmak için aşağıdaki parametreleri kullanın (Ek Şekil 3): Giriş Filmleri adım 1'de elde edilenlerdir, KARELER'de HIZALAMA aralığı 2 ile 13 arasındadır, diğer seçenekler varsayılan değerlerle kalır. Programı yürütün.
   NOT: Formdaki kalın parametreler her zaman doldurulmalıdır. Diğerleri varsayılan bir değere sahip olacak veya zorunlu olarak gerekli olmayacaktır. Form penceresinin üst kısmında, hesaplama kaynaklarının dağıtıldığı alanlar iş parçacıkları, MPI'ler veya GPU'lar olarak bulunabilir.
2. Elde edilen mikro grafikleri ve tahmini kaymaların yörüngesini kontrol etmek için Sonuçları Analiz Et'e tıklayın (Şekil 1). Görülen her mikrograf için: güç spektral yoğunluğuna (PSD), filmi (kare başına bir nokta) kartezyen ve kutupsal koordinatlarda hizalamak için elde edilen yörüngelere ve elde edilen mikro grafiğin dosya adına bakın (üzerine tıklayarak mikro grafik incelenebilir). Numunenin parçacıklarının, filmin tek bir karesine kıyasla mikrografide çok daha görünür olduğuna dikkat edin.

3. CTF tahmini: mikroskop sapmalarının hesaplanması

1. İlk olarak, grigoriefflab - ctffind15 yöntemini kullanın. Kurulum şudur: Giriş Mikrografları adım 2'nin çıktısıdır, Manuel CTF AltÖrnekleme faktörü 1,5 olarak ayarlanır ve Çözünürlük aralığı 0,06'dan 0,42'ye çıkar. Ayrıca, Gelişmiş seçeneklerinde (formun Uzman Düzeyinde bu seçim seçilerek bulunabilir), Pencere boyutunu 256 olarak ayarlayın. Kalan parametreler varsayılan değerlerle kalır (Ek Şekil 4).
   NOT: Scipion'daki yöntemlerin çoğunda Gelişmiş seçeneği daha fazla yapılandırma parametresi gösterir. Başlatılacak program tamamen bilindiğinde ve parametrelerin anlamı anlaşıldığında bu seçenekleri dikkatlice kullanın. Bazı parametrelerin verilere bakmadan doldurulması zor olabilir; Bu durumda, Scipion sağ tarafta bir sihirbaz penceresi gösterecek sihirli bir değnek gösterir (Ek Şekil 5). Örneğin, bu formun Çözünürlük alanında, bu değerlerin bölgeyi psd'nin ilk sıfırdan son fark edilen halkasına kadar yaklaşık olarak kapsayacak şekilde seçilmesi gerektiğinden, özellikle yararlıdır.
2. Yöntem tamamlandığında Sonuçları Yürüt'e ve Analiz Et'e (Şekil 2) tıklayın. Tahmini CTF'nin deneysel olanla eşleşerek eşleşmediğini kontrol edin. Bu amaçla, PSD'ye bakın ve köşedeki tahmini halkaları verilerden gelenlerle karşılaştırın. Ayrıca beklenmeyen değerleri bulmak için elde edilen defokus değerlerini kontrol edin ve ilgili mikro grafikler atılabilir veya yeniden hesaplanabilir. Bu örnekte, tüm mikrografi seti kullanılabilir.
   NOT: Mikrografların bir alt kümesini ( Mikrograflar kırmızı düğmeli) yapmak ve gerektiğinde bir CTF'yi (CTF'leri yeniden hesapla kırmızı düğmesiyle) yeniden hesaplamak için pencerenin alt kısmındaki düğmeleri kullanın.
3. Önceki tahmini iyileştirmek için xmipp3 - ctf estimation20 kullanın. Giriş Mikrografları olarak adım 2'nin çıktısını seçin, Önceki CTF tahmini grigoriefflab - ctffind çıktısını seçtiğinden önceki CTF tahmininden defoci kullan seçeneğini belirleyin ve Gelişmiş düzeyde Pencere boyutunu 256 olarak değiştirin (Ek Şekil 6). Çalıştırın.
4. Elde edilen CTF'leri kontrol etmek için Sonuçları Analiz Et'e tıklayın. Bu yöntemle, daha fazla veri tahmin edilir ve bazı ek sütunlarda temsil edilir. Hiçbiri yanlış tahmini değerler göstermez, tüm mikro grafikler aşağıdaki adımlarda kullanılacaktır.

4. Parçacık toplama: mikrograflarda parçacık bulma

1. Toplama başlamadan önce, mikrografların bir ön işlemesini gerçekleştirin. Xmipp3'ü açın - önişlem mikrografları, adım 2'de elde edilen giriş mikrografları olarak ayarlanır ve stddev'in katları ile 5'e kadar bozuk pikselleri kaldır ve 2'lik bir Altörnekleme faktörüyle mikrografları aşağı örnekle (Ek Şekil 7) seçeneklerini belirleyin. Yürüt'e tıklayın ve elde eden mikro grafiklerin boyutunun küçültülmüş olup olmadığını kontrol edin.
2. Malzeme çekme için xmipp3 - manuel çekme (adım 1) ve xmipp3 - otomatik çekme (adım 2)²¹ kullanın. Manuel toplama, otomatik toplama adımının tüm parçacık kümesini öğreneceği ve üreteceği bir parçacık kümesini manuel olarak hazırlamaya izin verir. İlk olarak, önceki önişlemde elde edilen mikrograflar olarak Giriş Mikrografları ile xmipp3 - manuel çekme (adım 1) çalıştırın. Yürüt'e tıklanın ve yeni bir etkileşimli pencere görünecektir (Şekil 3).
3. Bu pencerede mikrografların bir listesi (Şekil 3a) ve diğer seçenekler sunulmuştur. Boyutu (px) 150 olarak değiştirin, bu her parçacığı içeren kutunun boyutu olacaktır. Seçilen mikrograf daha büyük bir pencerede görünür. Bir bölge seçin ve içinde görünen tüm parçacıkları seçin (Şekil 3b). Ardından, öğrenmeye başlamak için Eğitimi Etkinleştir'e tıklayın. Mikrografinin kalan bölgeleri otomatik olarak seçilir (Şekil 3c). Seçilen parçacıkları kontrol edin ve üzerine tıklayarak daha fazlasını ekleyin veya gerekirse shift+tıklama ile yanlış olanları kaldırın.
4. İlk pencerede bir sonraki mikro grafiği seçin. Mikrograf otomatik olarak seçilecektir. Gerekirse bazı parçacıkları dahil etmek veya çıkarmak için tekrar kontrol edin. Temsili bir eğitim seti oluşturmak için bu adımı yaklaşık 5 mikrografi ile tekrarlayın.
5. Bu yapıldıktan sonra, seçilen tüm parçacıkların koordinatlarını kaydetmek için ana penceredeki Koordinatlar'a tıklayın. Parçacıkların eğitim seti, tüm mikrografilerin işlemini tamamlamak için otomatik toplama işlemine gitmeye hazırdır.
6. Xmipp3'ü açın - Xmipp parçacık toplamada gösterilen otomatik toplama (adım 2), önceki manuel malzeme çekmeyi çalıştırır ve Denetlenenle Aynı olarak seçecek Mikrografiler. Yürüt'e tıklayın. Bu yöntem, yaklaşık 100000 koordinatlardan oluşan bir çıkış kümesi olarak oluşturulur.
7. Konsensüs yaklaşımı uygulayın, bu nedenle her iki yöntemin de kabul ettiği parçacıkları seçmek için ikinci bir toplama yöntemi gerçekleştirin. Sfenk - cryolo ^toplama14 açın ve Giriş Mikrografları olarak önceden işlenmiş mikrografları seçin, Genel modeli kullanın? Çalıştırın. Bu yöntem ayrıca yaklaşık 100000 koordinat oluşturmalıdır.
8. Xmipp3 - derin konsensüs ^{toplama22 çalıştırın}. Giriş koordinatları sphire - cryolo toplama (adım 4.7) ve xmipp3 - otomatik toplama (adım 4.6) çıktısını içerdiğinden, Select model türünü Önceden Eğitilmiş olarak ayarlayın ve eğitimi atlayın ve doğrudan önceden eğitilmiş modelle puanlayın? Evet'e (Ek Şekil 9). Çalıştırın.
9. Sonuçları Analiz Et'e tıklayın ve yeni pencerede, Yüksek 'zScoreDeepLearning1' değerlerine sahip parçacıkları/koordinatları seç'in yanındaki göz simgesine tıklayın. Tüm parçacıkların listesiyle yeni bir pencere açılacaktır (Şekil 4). Sütundaki zScore değerleri bir parçacığın kalitesi hakkında bir fikir verir, düşük değerler kötü kalite anlamına gelir.
   1. Parçacıkları en yüksekten en düşük zScore'a sipariş etmek için etikete_xmipp_zScoreDeepLearning tıklayın. 0,75'ten yüksek zScore içeren parçacıkları seçin ve yeni alt kümeyi oluşturmak için Koordinatlar'a tıklayın. Bu, yaklaşık 50000 koordinatlı bir alt küme oluşturmalıdır.
10. Xmipp3'i açın - derin mikrografi temizleyici. Giriş önceki adımda elde edilen alt kümeyi koordine ederken, Mikro grafikler kaynağı koordinatlarla aynı olarak seçin ve Eşiği 0,75'te tutun. Çalıştırın. Özet sekmesinde koordinat sayısının azaltıldığını denetleyin, ancak bu durumda yalnızca birkaç koordinat kaldırılır.
    NOT: Bu adım ayrıca koordinat kümesini temizleyebilir ve karbon bölgeleri veya büyük safsızlıklar olarak daha fazla film yapıtıyla diğer veri kümelerini temizlemede çok yararlı olabilir.
11. Xmipp3 çalıştırın - parçacıkları ayıklayın (Ek Şekil 10). Giriş önceki adımdan sonra elde edilen koordinatları koordine ederken, Mikro grafikler diğer olarak kaynak, Adım 2'nin çıktısı olarak giriş mikrografları, xmipp3 - ctf tahmini çıktısı olarak CTF tahmini, 3'e altörnekleme faktörü ve 100'e parçacık kutusu boyutu olarak belirtin. Formun Önişlem sekmesinde Tümüne Evet'i seçin. Çalıştırın.
12. Çıktının 100x100 piksel ve piksel boyutu 4,02Å/px olan parçacıkları içermesi gerektiğini kontrol edin.
13. Tekrar çalıştırın xmipp3 - aşağıdaki parametreleri değiştiren parçacıkları ayıklayın : Altörnekleme faktörü 1'e ve Parçacık kutusu boyutu 300'e. Çıktının aynı parçacık kümesi olup olmadığını kontrol edin, ancak şimdi tam çözünürlükte.

5. 2D sınıflandırma: benzer parçacıkları birlikte gruplandırma

1. Cryosparc2 - 2d ^{classification11} yöntemini, adım 4.11'de elde edilenler olarak Giriş parçacıklarıyla açın ve 2D Sınıflandırma sekmesinde, sınıf sayısı 128'e, diğer tüm parametreleri varsayılan değerlerle tutun. Çalıştırın.
2. Sonuçları Analiz Et'e ve ardından Parçacık sınıflarını Scipion ile görüntüle'nin yanındaki göz simgesine tıklayın (Şekil 5). Bu sınıflandırma, birkaç sınıf gürültülü veya yapıtlarla görüneceğinden, parçacık kümesini temizlemeye yardımcı olacaktır. İyi görünümler içeren sınıfları seçin. Daha temiz alt kümeyi oluşturmak için Parçacıklar'a (pencerenin alt kısmındaki kırmızı düğme) tıklayın.
3. Şimdi, xmipp3 - cl2d23'ü açın ve önceki adımda elde edilen görüntüleri giriş görüntüleri ve sınıf sayısı 128 olarak ayarlayın. Yürüt'e tıklayın.
   NOT: Bu ikinci sınıflandırma, parçacık kümesinin ek temizleme adımı olarak kullanılır. Genellikle mümkün olduğunca gürültülü parçacıkları çıkarmak için yararlıdır. Ancak, daha basit bir iş akışı isteniyorsa, yalnızca bir 2D sınıflandırma yöntemi kullanılabilir.
4. Yöntem tamamlandığında, Sonuçları Çözümle'ye ve Gösterilecekler: sınıflar'a tıklayarak oluşturulan 128 sınıfı denetleyin. Oluşturulan sınıfların çoğu, makromolekülün bir ayrıntı düzeyiyle projeksiyonu gösterir. Ancak, bazıları gürültülü görünür (bu örnekte yaklaşık 10 sınıf). Tüm iyi sınıfları seçin ve yalnızca iyi sınıflarla yeni bir alt küme oluşturmak için Sınıflar düğmesine tıklayın. Bu alt küme, başlangıç birimi oluşturma yöntemlerinden birine giriş olarak kullanılacaktır. Aynı seçili sınıflarla , kötü sınıflara ait olanları kaldırdıktan sonra daha temiz bir alt küme oluşturmak için Parçacıklar'ı tıklatın.
5. Pwem'i açın - 4.13 çıktısı olarak tam öğe kümesine sahip alt küme (tam boyuttaki tüm parçacıklar), Önceki adımda oluşturulan parçacıkların alt kümesi olarak Rastgele alt kümeyi Hayır, Diğer küme olarak yapın ve İşlemi kesişim olarak ayarlayın. Bu, önceki alt kümeyi parçacıklardan tam çözünürlükte ayıklar.

6. İlk hacim tahmini: 3D hacmin ilk tahminini oluşturma

1. Bu adımda, farklı yöntemlerle iki başlangıç birimini tahmin edin ve ardından son tahmini 3D birimi oluşturmak için bir konsensüs aracı kullanın. Xmipp3 'ü açın - adım 5'den sonra elde edilenler olarak Input sınıfları ile ^önemli24 yöntemini yeniden yapılandırın, Simetri grubu c1 olarak ve kalan parametreleri varsayılan değerleriyle tutun (Ek Şekil 11). İdam edin.
2. Sonuçları Analiz Et'e tıklayın. 100x100x100 piksel boyutunda ve 4,02Å/px piksel boyutunda düşük çözünürlüklü bir hacim elde olup olmadığını kontrol edin.
3. Xmipp3 'ü açın - birimleri kırpın/yeniden boyutlandırın (Ek Şekil 12), giriş birimleri olarak kullanarak önceki adımda elde edilen, Birimleri Yeniden Boyutlandır? Çalıştırın. Özet sekmesinde çıktı biriminin doğru boyuta sahip olduğunu denetleyin.
4. Şimdi, ikinci başlangıç hacmini oluşturun. Açık relion - 3D ilk ^model10, Giriş parçacıkları iyi parçacıkları tam çözünürlükte (5,5 çıkış) kullandığından ve Parçacık maskesi çapını 402şolarak ayarladıktan sonra, kalan parametreleri varsayılan değerlerle tutun. Çalıştırın.
5. Sonuçları Analiz Et'e tıklayın ve ardından Ses düzeyini şu şekilde görüntüle: dilimler. Düşük çözünürlüklü bir hacim elde olup olmadığını, ancak yapının ana şekline sahip olup olmadığını kontrol edin (Ek Şekil 13).
6. Şimdi, konsensüs yöntemine giriş oluşturmak için oluşturulan iki başlangıç birimini birleştirmek için pwem - birleştirme kümelerini açın. Birimleri Giriş türü olarak belirtin ve Giriş kümesindeki iki başlangıç birimini seçin. Çalıştırın. Çıktı, her iki birime sahip iki öğe içeren bir küme olmalıdır.
7. Konsensüs aracı xmipp3 - sürü konsensüsü25'te bulunan ^araçtır. Aç. Tam Boyutlu Görüntüler olarak iyi parçacıkları tam çözünürlükte (5,5 çıktı) kullanın, çünkü İlk birimler seti önceki adımda oluşturulan iki öğeyle birimler ve Simetri grubunun c1 olduğundan emin olun. Yürüt'e tıklayın.
8. Sonuçları Analiz Et'e tıklayın. Daha ayrıntılı bir çıktı hacmi elde olup olmadığını kontrol edin (Şekil 6). Yapıyı çevreleyen daha fazla gürültü olmasına rağmen, yapı haritasında daha fazla ayrıntıya sahip olmak, yerel minimayı önlemek için aşağıdaki iyileştirme adımlarına yardımcı olacaktır.
   NOT: UCSF ^Chimera26 varsa, elde edilen birimin 3D görselleştirmesini yapmak için pencerenin üst kısmındaki son simgeyi kullanın.
9. Parçacıkların ilk 3D açısal atamasını yapmak için relion - 3D otomatik rafine10'u açın ve yürütün. Giriş parçacıkları olarak 5,5 çıkışını seçin ve Parçacık maskesi çapını 402şolarak ayarlayın. Başvuru 3D harita sekmesinde, önceki adımda elde edilen Giriş hacmi, c1 olarak Simetri ve 30Å'ya başlangıç düşük geçiş filtresi olarak seçin (Ek Şekil 14).
10. Sonuçları Analiz Et'e tıklayın. Yeni pencerede, görselleştirmek için Birim olarak son'u seçin ve elde edilen birimi görmek için Ses düzeyini görüntüle: dilimler'i tıklatın. Ayrıca, sonuçlar penceresindeki Görüntü çözünürlüğü çizimlerine ve Açısal dağılım: 2D çizimdeki açısal kapsama alanına tıklayarak Fourier kabuk korelasyonunu (FSC) kontrol edin: 2D çizim (Şekil 7). Yeniden yapılanan hacim çok daha fazla ayrıntı içerir (muhtemelen yapının dış kısmındaki bazı bulanık alanlarla) ve FSC 4.5şcivarında 0.143 eşiğini geçer. Açısal kapsama alanı tüm 3D küreyi kapsar.

7.3D sınıflandırması: konformasyon durumlarını keşfetme

1. Bir konsensüs yaklaşımı kullanılarak, verilerde farklı konformasyon durumları varsa bulunabilir. Açık relion - 3D ^{sınıflandırma10} (Ek Şekil 15). Giriş parçacıkları 6.10'da elde edilenleri kullandığında ve Parçacık maskesi çapı 402şolarak ayarlanır. Başvuru 3D eşleme sekmesinde, 6.10 adımından sonra elde edilen giriş hacmi olarak kullanın, Simetri'yi c1'e ve İlk düşük geçişli filtreyi 15Å'ya ayarlayın. Son olarak, En İyiLeştirme sekmesinde sınıf sayısını 3 olarak ayarlayın. Çalıştırın.
2. Sonuçları Analiz Et'e tıklayarak sonuçları kontrol edin, Scipion'da sınıflandırmayı göster'i seçin. Oluşturulan üç sınıf ve bazı ilginç önlemler gösterilmiştir. İlk iki sınıf benzer sayıda atanmış görüntüye (boyut sütunu) sahip olmalı ve çok benzer görünmelidir, üçüncüsü ise daha az görüntüye ve daha bulanık bir görünüme sahiptir. Ayrıca, rlnAccuracyRotations ve rlnAccuracyTranslations ilk iki sınıf için açıkça daha iyi olmalıdır. En iyi iki sınıfı seçin ve bunları içeren bir alt küme oluşturmak için Sınıflar düğmesini tıklatın.
3. İkinci bir iyi sınıf grubu oluşturmak için 7.1 ve 7.2 adımlarını yineleyin. Her ikisi de konsensüs aracının girişi olacaktır.
4. xmipp3 - konsensüs sınıfları 3D'yi açın ve çalıştırın ve önceki adımlarda oluşturulan iki alt kümeyi Giriş Sınıfları olarak seçin.
5. Sonuçları Analiz Et'e tıklayın. Sınıflar arasındaki çakışan parçacıkların sayısı sunulur: birinci değer, alt küme 1'in birinci sınıfındaki çakışan parçacıkların sayısı ve alt küme 2'nin ilk sınıfı, ikinci değer ise alt küme 1'in birinci sınıfındaki çakışan parçacıkların sayısıdır. Parçacıkların bir veya iki sınıfa rasgele atandığını kontrol edin, bu da 3D sınıflandırma yönteminin konformasyon değişikliklerini bulamadığı anlamına gelir. Bu sonuç göz önüne alındığında, tüm parçacık kümesi işlemeye devam etmek için kullanılacaktır.

8.3D iyileştirme: homojen bir popülasyonun açısal atamalarını rafine etme

1. Yine, bu adımda bir konsensüs yaklaşımı uygulayın. İlk olarak, pwem ' i açın ve çalıştırın - 6.9 çıktısı olarak tam öğe kümesine sahip alt küme, Evet'e rasgele alt küme yap ve Öğe sayısı 5000'e. Bununla, aşağıdaki adımda kullanılan yöntemi eğitmek için önceki hizalamaya sahip bir görüntü alt kümesi oluşturulur.
2. Xmipp3'ü açın - derin hizalayın, Giriş görüntülerini 5,5'te elde edilen iyi parçacıkların çıktısı, Hacim'i 6,10'dan sonra elde edilen olarak ayarlayın, Giriş eğitimi önceki adımda oluşturulan olarak ayarlanır, Hedef çözünürlük 10Å'ya ayarlanır ve kalan parametreleri varsayılan değerlerle saklayın (Ek Şekil 16). Yürüt'e tıklayın.
3. Elde edilen açısal dağılımı kontrol etmek için Sonuçları Analiz Et'e tıklayın, burada eksik yol tarifi yoktur ve açısal kapsama alanı 6.10'unkine göre biraz iyileşir (Şekil 8).
4. Xmipp3'ü açın ve yürütün - açıları karşılaştırın ve Giriş parçacıkları 1 6.9'un çıktısı ve Giriş parçacıkları 2 8.2'nin çıkışı olarak seçin, Simetri grubunun c1 olduğundan emin olun. Bu yöntem xmipp3 - derin hizalama ve relion - 3D otomatik iyileştirme arasındaki sözleşmeyi hesaplar.
5. Sonuçları Analiz Et'e tıklayın, kaymalarda ve açılarda elde edilen farklılıklarla parçacıkların listesi gösterilir. Pencerenin üst kısmındaki çubuk simgesine tıklayın, hesaplanan değişkenlerin çizimlerini yapmaya izin veren başka bir pencere açılacaktır. _xmipp_angleDiff seçin ve parçacık başına açısal farklılıkların bir gösterimini görmek için Çiz'e tıklayın. Aynısını _xmipp_shiftDiff de yap. Bu rakamlarda, parçacıkların yaklaşık yarısında her iki yöntem de aynı fikirdedir (Şekil 9). Açısal farklılıkları 10º'den düşük olan parçacıkları seçin ve yeni bir alt küme oluşturun.
6. Şimdi, atanan açılarda yerel bir iyileştirme yapmak için xmipp3 - highres27'yi açın. İlk olarak, Önceki adımda elde edilen görüntüleri Tam Boyutlu Görüntüler olarak seçin ve İlk birimler olarak 6,9 çıktısını, parçacığın Yarıçapını 150 piksele ve Simetri grubunu c1 olarak ayarlayın. Açısal atama sekmesinde, Görüntü hizalamasını Yerel, Yineleme sayısı 1 ve Maks. olarak ayarlayın. Hedef Çözünürlük 5Å/px olarak (Ek Şekil 17). Çalıştırın.
7. Özet sekmesinde, çıkış biriminin 300x300x300 pikselden küçük ve biraz daha yüksek piksel boyutuna sahip olduğunu denetleyin.
8. Elde edilen sonuçları görmek için Sonuçları Analiz Et'e tıklayın. FSC'yi görmek için Çözünürlük çizimlerini görüntüle'ye tıklayın ve Görüntü biriminde: Elde edilen birimi görmek için yeniden yapılandırıldı (Ek Şekil 18). 4-3.5Å'ya yakın iyi bir çözünürlük hacmi elde edilir.
9. Çıkış parçacıklarını görüntüle'ye tıklayın ve parçacık listesinin yer verdiği pencerede çubuk simgesine tıklayın. Yeni pencerede, 100 Depo Gözü ile Histogram Olarak Yaz'ı seçin, _xmipp_cost etiketi seçin ve son olarak Çiz'e basın (Ek Şekil 19). Bu şekilde, maliyet etiketinin histogramı sunulur, bu da parçacığın onun için seçilen projeksiyon yönüyle korelasyonunu içerir. Bu durumda, parçacık kümesinde farklı popülasyonlara sahip olmadığının bir işareti olan bir unimodal yoğunluk fonksiyonu elde edilir. Böylece hepsi arıtmaya devam etmek için kullanılacaktır.
   NOT: Çokmodal yoğunluk fonksiyonu görmeniz durumunda, iş akışına yalnızca onlarla devam etmek için daha yüksek maksimuma ait parçacık kümesi seçilmelidir.
10. Önceki çalıştırmadan devam et ile xmipp3 - highres açılıp yeniden yürütülür mü? evet olarak ayarlayın, 8.5'den sonra elde edilen Tam boyutlu Görüntüler olarak ayarlayın ve Xmipp Highres'in önceki yürütülmesiyle önceki çalıştırmayı seçin. Açısal atama sekmesinde, Görüntü hizalamasını 1 yineleme ve 2,6Å/px hedef çözünürlük (tam çözünürlük) olarak Yerel olarak ayarlayın.
11. Şimdi çıktı tam çözünürlükte bir birim içermelidir (boyut 300x300x300 piksel). Elde edilen hacmi ve şimdi yaklaşık 3Å'da yüksek çözünürlüklü bir hacim olması gereken FSC'yi tekrar kontrol etmek için Sonuçları Analiz Et'e tıklayın (Şekil 10).

9. Değerlendirme ve işlem sonrası

1. xmipp3 - yerel ^MonoRes28'i açın. Bu yöntem çözünürlüğü yerel olarak hesaplar. Giriş Hacmi olarak ayarlayın 8.10'dan sonra elde edilen, yarım birim kullanmak ister misiniz? Çalıştırın.
2. Sonuçları Analiz Et'e tıklayın ve Çözünürlük histogramını göster ve Renkli dilimleri göster'i seçin (Şekil 11). Birimin farklı bölümlerindeki çözünürlük gösterilir. Yapının orta kısmının voksellerinin çoğu 3şcivarında çözünürlükler sunmalı, en kötü çözünürlükler ise dış kısımlarda elde edilmelidir. Ayrıca, voksel başına çözünürlüklerin histogramı 3şetrafında (hatta aşağıda) bir zirve ile gösterilir.
3. Bir keskinleştirme uygulamak için xmipp3 - localdeblur sharpening29'u açın ve çalıştırın. 8.10'da elde edileni Giriş Haritası ve MonoRes ile önceki adımda elde edilen Çözünürlük Haritası olarak seçin.
4. Elde edilen birimleri kontrol etmek için Sonuçları Analiz Et'e tıklayın. Algoritmanın son yinelemesine karşılık gelen son olanı açın. Hacmin özelliklerini 3D olarak daha iyi görmek için hacmi UCSF ^Chimera26 gibi diğer araçlarla açmanızı öneririz (Şekil 12).
5. Son olarak, xmipp3'te bulunan doğrulama aracını açın - çözünürlüğün parçacık sayısıyla nasıl değiştiğini gösterecek overfitting30'u doğrulayın. Açın ve Giriş parçacıkları olarak ekleyin adım 8.5 elde edilen parçacıklar, ayarlamak Çözünürlük için bağlı gürültü hesapla? Gelişmiş seçeneklerde, parçacık sayısını "500 1000 1500 2000 3000 5000 10000 15000 20000" olarak ayarlayın (Ek Şekil 20). Çalıştırın.
6. Sonuçları analiz et'e tıklayın. Yeniden yapılandırmada kullanılan parçacıkların sayısı arttıkça, yeşil çizgide çözünürlüğün evrimi ile iki arsa görünecektir (Şekil 13). Kırmızı çizgi, hizalanmış Gauss gürültüsünün yeniden yapılandırılmasıyla elde edilen çözünürlüğü temsil eder. Çözünürlük, parçacık sayısı ile gelişir ve rekonstrüksiyonun parçacıklardan gürültüye kıyasla büyük bir farkı gözlenir, bu da iyi yapısal bilgilere sahip parçacıklara sahip olmanın bir göstergesidir.
7. Önceki sonuçlardan, makromolekülün biyolojik yapılarının keşfedilmesine izin verecek bir modelin işlenmiş hacme takılması gerçekleştirilebilir.

Sonuçlar

Plasmodium falciparum 80S Ribozom veri kümesini kullandık (EMPIAR girişi: 10028, EMDB girişi: 2660) testi yapmak ve önceki bölümde sunulan Scipion protokolü ile, örneğin herhangi bir yöneliminde 2D projeksiyonlar içeren çok gürültülü görüntülerden oluşan mikroskop tarafından toplanan bilgilerden başlayarak, bu özel örnekteki makromolekülün yüksek çözünürlüklü 3D yeniden yapılandırılmış hacmi elde edildi.

Tüm protokol çalıştırıldıktan sonra elde edilen ana sonuçlar Şekil 10, Şekil 11 ve Şekil 12'de sunulmuştur. Şekil 10, işlem sonrası elde edilen 3D birimi temsil eder. Şekil 10a'da, Nyquist sınırına çok yakın olduğu 3 Å'lık bir FSC görülebilir (piksel boyutu 1,34 şolan verilerle, Nyquist sınırı 2,6 Å'dır). Şekil 10b, yeniden yapılandırılmış 3B hacmin bazı dilimlerini yüksek düzeyde ayrıntılar ve iyi tanımlanmış yapılarla gösterir. Şekil 11'de elde edilen 3D hacmin çözünürlüğünü yerel olarak analiz ettikten sonraki sonuçlar sunulmuştur. Yapıdaki voksellerin çoğunun, esas olarak yapının orta kısmında bulunanlar olmak üzere 3 Å'nın altında bir çözünürlüğe ulaştığı görülebilir. Bununla birlikte, dış kısım, Şekil 10b dilimlerinde bu alanlarda görünen bulanıklıkla tutarlı olan daha kötü çözünürlükler gösterir. Şekil 12, işlem sonrası, hacmin daha yüksek frekanslarını vurgulayabilen, daha fazla ayrıntı ortaya koyan ve özellikle Şekil 12c'deki 3D sunumda görülebilen gösterimi geliştiren aynı 3D haritayı göstermektedir.

Şekil 14'te ^Chimera26, elde edilen hacmin (Şekil 14a), işlenmiş sonrası (Şekil 14b) ve yerel çözünürlüklerin renk koduyla renklenen çözünürlük haritasının (Şekil 14c) 3B gösterimini görmek için kullanılmıştır. Bu, elde edilen yapı hakkında daha fazla bilgi verebilir. Bu araç, yapının tüm 3D bağlamında çok küçük ayrıntılar görülebileceğinden, elde edilen hacmin kalitesi hakkında bir fikir edinmek için çok yararlıdır. Elde edilen çözünürlük yeterli olduğunda, yapının bazı biyokimyasal kısımları bile bulunabilir (örneğin, Şekil 14d'deki alfa-helikler). Bu şekilde, Şekil 14c'de koyu mavi alanlar olarak görülebilen 3D yapının tüm orta kısımlarında elde edilen yüksek çözünürlüğü vurgulamak gerekir.

Önceki tüm sonuçlar, tüm protokolün iyi bir performansı sayesinde elde edildi, ancak durum böyle olmayabilir. Kötü bir davranışı tanımlamanın birkaç yolu vardır. En genel durumda, elde edilen yapı düşük çözünürlüğe sahip olduğunda ve daha iyi bir yapıya evrilemediğinde bu olur. Bunun bir örneği Şekil 15'te sunulmuştur. Bulanık bir hacim (Şekil 15c), FSC eğrisinde (Şekil 15a) ve yerel tahminin histogramında görülebilen düşük bir FSC ile sonuçlanır (Şekil 15b). Bu örnek, yerine getirmedikleri parçacıkların giriş kümesindeki bazı belirli özellikleri beklediğinden, yanlış giriş verilerine sahip bir 3D iyileştirme yöntemi kullanılarak oluşturulmuştır. Görüldüğü gibi, farklı yöntemlerin verileri nasıl almayı ve düzgün bir şekilde hazırlamayı beklediğini bilmek her zaman çok önemlidir. Genel olarak, Şekil 15'teki gibi bir çıktı elde edildiğinde, işleme iş akışında veya temel alınan verilerde bir sorun olabilir.

İş akışı boyunca, protokolün düzgün bir şekilde gelişip gelişmediğini bilmek için analiz edilebilen birkaç denetim noktası vardır. Örneğin, toplamadan hemen sonra, daha önce tartışılan yöntemlerden bazıları parçacıkları derecelendirebilir ve her biri için bir puan verebilir. Kötü parçacıklara sahip olması durumunda, bu yöntemler bunları tanımlamaya ve çıkarmaya izin verir. Ayrıca, 2D sınıflandırması kötü bir parçacık kümesine sahip olmanın iyi bir göstergesi olabilir. Şekil 16'da böyle kötü bir set örneği göster görse. Şekil 16a'da yapının bazı ayrıntılarını içeren iyi sınıflar gösterilirken, Şekil 16b gürültülü veya girilmemiş kötü sınıfları gösterirken, bu son durumda toplamanın yanlış olduğu ve iki parçacığın bir arada göründüğü görülebilir. Başka bir kontrol noktası ilk hacim tahminidir, Şekil 17 iyi (Şekil 17a) ve kötü (Şekil 17b) ilk tahminlerin bir örneğini gösterir. Hatalı tahmin, yöntem için yanlış bir kurulum kullanılarak oluşturuldu. Analiz edilen verilere göre her parametreyi uygun şekilde seçerek tüm kurulumların dikkatlice yapılması gerektiği dikkate alınmalıdır. Bazı minimum yapısal bilgilere sahip bir haritaya sahip olmamak durumunda, aşağıdaki iyileştirme iyi bir yeniden yapılandırma elde edemeyecektir.

Sorun, filmlerin yapısal bilgileri korumadığı kötü bir kazanım olduğunda, onlardan iyi parçacıklar çıkarmak ve başarılı bir işlem elde etmek imkansız olacaktır. Bu durumda, yüksek çözünürlüklü bir 3D rekonstrüksiyon elde etmek için daha fazla film toplanmalıdır. Ancak, durum böyle değilse, işleme iş akışı boyunca sorunları yönetmenin birkaç yolu vardır. Toplama yeterince iyi değilse, düzeltmeye çalışmanın birkaç yolu vardır, örneğin, toplamayı tekrarlamak, farklı yöntemler kullanmak veya yöntemlerin onlardan öğrenmesine yardımcı olmak için daha fazla parçacığı manuel olarak toplamaya çalışmak. 2D sınıflandırma sırasında, sadece birkaç sınıf iyiyse, malzeme çekme işlemini de tekrarlamayı düşünün. İlk hacim tahmininde, bazıları yanlış sonuçlar verdiyse birkaç yöntem kullanmaya çalışın. Aynı şey 3D iyileştirme için de geçerlidir. Bu muhakemenin ardından, bu yazıda, sorunları önlemek ve doğru verilerle işlemeye devam etmek için çok yararlı olabilecek birkaç konsensüs aracı sunulmuştur. Çeşitli yöntemler arasında bir konsensüs kullanarak, muhtemelen zayıf verilerin bir göstergesi olan, seçimi, sınıflandırılması, hizalaması vb. Ancak, oluşturulan çıktıda birkaç yöntem kabul edebiliyorsa, büyük olasılıkla bu veriler işlemeye devam etmek için değerli bilgiler içerir.

Okuyucuyu daha fazla veri kümesi indirmeye ve bu yazıda sunulan önerileri izleyerek işlemeye ve Scipion kullanarak işleme paketlerini birleştiren benzer bir iş akışı oluşturmaya çalışmaya teşvik ediyoruz. Bir veri kümesini işlemeye çalışmak, Cryo-EM'deki en son teknoloji ürünü olan işleme araçlarının gücünü öğrenmenin, işleme sırasında ortaya çıkan olası dezavantajların üstesinden gelmek için en iyi kuralları bilmenin ve her belirli test durumunda kullanılabilir yöntemlerin performansını artırmanın en iyi yoludur.

Şekil 1. Film hizalama sonucu. (a) Oluşturulan tüm mikro grafiklerin bir listesi ve ek bilgilerle sonuçların ana penceresi: güç spektral yoğunluğu, kutupsal koordinatlardaki tahmini hizalamanın yörüngesi, kartezyen koordinatlarda aynı, oluşturulan mikro grafiğin dosya adı. (b) Kartezyen koordinatlarda temsil edilen hizalama yörüngesi. (c) Oluşturulan mikrograf. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2. Ctffind sonucu ile CTF tahmini. Sonuçların yer aldığı ana pencere, verilerden gelen PSD ile birlikte tahmini PSD (bir köşede) ve birkaç defocus params içeren bir rakam içerir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3. Xmipp ile manuel çekme pencereleri. (a) İşlenmek üzere mikrografların listesinin ve diğer bazı parametrelerin yer aldığı ana pencere. (b) Mikrografinin bir bölgesindeki parçacıkları manuel olarak toplamak. (c) ve (d) Xmipp otomatik toplama yöntemi için bir dizi eğitim parçacığı oluşturmak için denetlenecek parçacıkları otomatik olarak topladı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4. Xmipp sonucu ile derin fikir birliği toplama. zScoreDeepLearning parametresi bir parçacığın iyiliğine ağırlık verir ve kötü parçacıkları keşfetmenin anahtarıdır. (a) En düşük zScores değerleri yapıtlarla ilişkilidir. (b) En yüksek zScores makromolekül içeren parçacıklarla ilişkilidir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5. Cryosparc sonucu ile 2D sınıflandırma. Oluşturulan sınıflar (aynı yönden gelen parçacıkların alt kümelerinin ortalamaları) gösterilir. Kırmızı (bazı ayrıntı düzeyleriyle) olarak seçilen birkaç iyi sınıf ve seçilmemiş bazı kötü sınıflar (gürültülü ve girilmemiş sınıflar). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6. Sürü konsensüs sonucu ile 3D başlangıç hacmi. Xmipp ve Relion'un önceki 3D ilk hacim tahminleri kullanılarak konsensüs aracı xmipp3 - sürü konsensüsü çalıştırıldıktan sonra elde edilen 3D başlangıç hacminin bir görünümü. (a) Birim dilimlerle temsil edilir. (b) Birimin 3D görselleştirilmesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7. Relion sonucu ile 3D başlangıç hacminin iyileştirilmesi. (a) FSC eğrisi elde edildi, eşiği yaklaşık olarak 4,5Å'da geçti. (b) 3D kürenin üst görünümü olarak gösterilen açısal kapsama alanı. Bu durumda, simetri olmadığı için, atanan parçacıklar tüm küreyi kapsamalıdır. (c) Dilimlerle temsil edilen rafine birim. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 8. Xmipp sonucu ile derin öğrenmeye dayalı 3D hizalama. xmipp3 tarafından oluşturulan sonuçlar - 3D hizalama için derin hizalama yöntemi. (a) Dönüşüm matrisi şeklindeki her parçacık için açısal atama. (b) Açısal kapsama alanı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 9. 3D hizalama konsensüs sonucu. (a) Kayma ve açı parametrelerinde elde edilen farklılıklara sahip parçacıkların listesi. (b) Parçacık başına açısal farklılıkların grafiği. (c) Parçacık başına kayma farkının çizilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 10. 3D iyileştirme sonucunun son yinelemesi. (a) FSC eğrisi. (b) Dilimler halinde tam çözünürlükte elde edilen hacim. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 11. Xmipp sonucu ile yerel çözünürlük analizi. xmipp3 - yerel MonoRes yönteminin sonuçları. (a) Renk kodunda belirtildiği gibi, voksel başına çözünürlük değeriyle renklenmiş bazı temsili dilimler. (b) Yerel çözünürlük histogramı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 12. Xmipp sonucu ile keskinleştirme. xmipp3 sonuçları - localdeblur keskinleştirme yöntemi. (a) Yineleme başına elde edilen birimlerin listesi. (b) Dilimlerle temsil edilen son yinelemeden sonra elde edilen 3D birim. (c) Son birimin 3D gösterimi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 13. Xmipp sonucunda aşırı sığdırma aracını doğrulayın. xmipp3 sonuçları - doğrulama aşırı sığdırma. Yeşil çizgi, verilerden yeniden yapılanmaya, gürültüden gelen kırmızı çizgiye karşılık gelir. (a) Parçacık sayısının logaritmesi ile kare çözünürlüğün tersi. (b) Parçacık sayısı ile çözünürlük. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 14. Elde edilen birimin çeşitli 3D gösterimleri. (a) Önceden işlenmiş hacim. (b) İşlenmiş birim. (c) Yerel çözünürlük, koyu mavi vokseller daha yüksek çözünürlüğe (2.75Å) ve koyu kırmızı vokseller daha düşük çözünürlüğe (10.05Å) sahip olanlardır. (d) Alfa sarmalının (kırmızı oval) görülebileceği işlem sonrası hacmi yakınlaştırın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 15. Kötü bir 3D yeniden yapılandırma örneği. (a) Keskin bir düşüş ve düşük çözünürlükte eşiği geçen FSC eğrisi. (b) Yerel çözünürlük histogramı. (c) Dilimlere göre 3D ses düzeyi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 16. 2D sınıflar örneği. (a) Bazı ayrıntı düzeylerini gösteren iyi sınıflar. (b) Gürültü ve eserler içeren kötü sınıflar (üst kısım Xmipp ile elde edilir, CryoSparc ile daha düşüktür). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 17. Farklı niteliklere sahip 3D başlangıç hacmi örneği. (a) Makromolekülün şeklinin gözlemlenebildiği iyi başlangıç hacmi. (b) Elde edilen şeklin beklenenden tamamen farklı olduğu kötü başlangıç hacmi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1. Scipion projesi oluşturma. Scipion tarafından görüntülenen ve eski bir projenin seçilebileceği veya bu proje için bir ad ve konum veren yeni bir proje oluşturulabileceği pencere. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 2. Film yöntemini içe aktarın. Pwem - içe aktarma filmleri açıkken Scipion tarafından görüntülenen pencere. Burada, filmlerin Scipion'da işlenmesine izin vermek için ana alım parametreleri eklenmelidir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 3. Film hizalama yöntemi. Xmipp3 - optik hizalama kullanıldığında Scipion tarafından görüntülenen pencere. Giriş filmleri, hizalama için düşünülen kare aralığı ve filmleri işlemek için diğer bazı parametreler doldurulmalıdır. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 4. Ctffind ile CTF tahmin yöntemi. Scipion'daki form, Ctffind programını çalıştırmak için gerekli tüm alanları içeren form. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 5. Scipion'daki sihirbaz. Kullanıcının formdaki bazı parametreleri doldurmasına yardımcı olacak bir sihirbaz. Bu durumda, sihirbaz grigoriefflab - ctffind yöntemindeki çözünürlük alanını tamamlamaktır. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 6. Xmipp ile CTF arıtma yöntemi. Xmipp3 formu - daha önce tahmin edilen bir CTF'nin inceltilmesini yapmak için tüm parametrelerle ctf tahmini.

Ek Şekil 7. Önişlem mikrografi yöntemi. xmipp3 formu - onlar üzerinde bazı işlemlerin yapılmasına izin veren ön işleme mikrografları. Bu örnekte, Bozuk pikselleri kaldır ve Altörnek mikro grafikleri yararlı olanıdır. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 8. Cryolo ile toplama yöntemi. Önceden eğitilmiş bir ağ kullanarak Cryolo toplama yöntemini çalıştırmak için form. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 9. Xmipp ile konsensüs toplama yöntemi. xmipp3 formu - farklı toplama yöntemleriyle elde edilen çeşitli koordinat kümeleri üzerinde önceden eğitilmiş bir ağ kullanarak, koordinatların bir konsensüs hesaplamak için derin öğrenmeye dayalı derin konsensüs toplama. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 10. Parçacıklar yöntemini ayıklayın. xmipp3'ün giriş ve önişlem sekmeleri - parçacıkları ayıklayın. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 11.3D Xmipp ile ilk hacim yöntemi. Xmipp3 yönteminin formu - ilk 3D haritayı elde etmek için önemli yeniden yapılandırın. Giriş ve Ölçüt sekmeleri gösterilir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 12. Ses düzey yöntemini yeniden boyutlandırın. Bir birimi kırpmak veya yeniden boyutlandırmak için form. Bu örnekte, bu yöntem xmipp3 - reconstruct significant sonra tam boyutlu bir birim oluşturmak için kullanılır. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 13.3D Relion sonucu ile ilk hacim. Elde edilen 3D başlangıç hacminin dilimlere göre relion - 3D ilk model yöntemiyle görünümü. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 14. Relion ile ilk hacmin iyileştirilmesi. Yöntemin formu relion - 3D otomatik rafine. Bu örnekte, konsensüs sonrası tahmin edilen bir başlangıç hacmini iyileştirmek için kullanılmıştır. Giriş ve Referans 3D harita sekmeleri gösterilir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 15.3D sınıflandırma yöntemi. Relion formu - 3D sınıflandırma. Giriş, Referans 3D harita ve Optimizasyon sekmeleri gösterilir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 16.3D derin öğrenme yöntemine dayalı hizalama. xmipp3 - deep align yöntemi için açılan form. Burada bir ağı bir eğitim kümesiyle eğitmek gerekir, daha sonra bu ağ parçacık başına açısal atamayı tahmin edecektir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 17.3D arıtma yöntemi. xmipp3 - highres yönteminin formu. Sekmeler Girişi ve Açısal atama gösterilir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 18. 3D iyileştirme sonucunun ilk yinelemesi. (a) FSC eğrisi. (b) Elde edilen birim (tam çözünürlükten daha küçük boyutlu) dilimler olarak temsil edilir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 19. 3D arıtma korelasyon analizinin ilk yinelemesi. Pencerenin üst kısmındaki çubuk simgesine parçacık listesiyle birlikte tıklayarak yeni bir pencere görüntülenir. Sütunları çiz penceresinde, istenen tahmini parametrenin histogramı oluşturulabilir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 20. Doğrulama aşırı sığdırma aracı. xmipp3 formu - aşırı sığdırma yöntemini doğrulayın. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Tartışmalar

Şu anda, kriyo-EM biyolojik örneklerin 3D yapısını ortaya çıkarmak için önemli bir araçtır. Mikroskopla iyi veriler toplandığında, mevcut işleme araçları, incelenmekte olan makromolekülün 3D yeniden yapılandırılmasını elde etmemizi sağlayacaktır. Cryo-EM veri işleme, bir makromolekülün işlevsel davranışını anlamanın anahtarı olan ve ilaç keşfinde de çok önemli olan atoma yakın çözünürlük elde edebilir.

Scipion, en alakalı görüntü işleme paketlerini bütünleştirici bir şekilde birleştirerek tüm iş akışının oluşturulmasına izin veren ve tüm görüntü işleme iş akışının izlenebilirliğine ve tekrarlanabilirliğine yardımcı olan bir yazılımdır. Scipion, işlemi gerçekleştirmek için çok eksiksiz bir araç seti sağlar; ancak, yüksek çözünürlüklü rekonstrüksiyonlar elde etmek tamamen elde edilen verilerin kalitesine ve bu verilerin nasıl işlendiğini bağlıdır.

Yüksek çözünürlüklü bir 3D rekonstrüksiyon elde etmek için ilk gereksinim, yapısal bilgileri yüksek çözünürlüğe koruyan mikroskoptan iyi filmler elde etmektir. Bu durumda, iş akışı verilerden yüksek tanımlı bilgileri ayıklayamaz. Daha sonra, başarılı bir işleme iş akışı, yapıya gerçekten karşılık gelen parçacıkları çıkarabilmeli ve bu parçacıkların 3D alandaki yönelimlerini bulmalıdır. İş akışındaki adımlardan herhangi biri başarısız olursa, yeniden yapılanan birimin kalitesi düşer. Scipion, işleme adımlarından herhangi birinde farklı paketler kullanılmasına izin verir, bu da verileri işlemek için en yeterli yaklaşımı bulmaya yardımcı olur. Ayrıca, birçok paketin mevcut olması sayesinde, farklı yöntemlerin tahmini çıktılarında bir anlaşma bularak doğruluğu artıran konsensüs araçları kullanılabilir. Ayrıca, Temsili Sonuçlar bölümünde çeşitli doğrulama araçları ve iş akışının her adımında doğru ve yanlış sonuçların nasıl belirlenacağı, olası sorunların nasıl tespit edilerek nasıl çözülmeye çalışılacağı ayrıntılı olarak ele alınmıştır. Protokol boyunca, protokolün düzgün çalıştırılıp çalışmadığını anlamaya yardımcı olabilecek birkaç denetim noktası vardır. En alakalı olanlardan bazıları şunlardır: malzeme çekme, 2D sınıflandırma, ilk hacim tahmini ve 3D hizalama. Girişleri denetlemek, adımı farklı bir yöntemle yinelemek veya fikir birliğini kullanmak, Scipion'da kullanıcının sorunlar göründüğünde çözüm bulmak için kullanabileceği seçeneklerdir.

Cryo-EM alanındaki paket entegrasyonuna yönelik önceki yaklaşımlarla ilgili olarak ^Appion31 , farklı yazılım paketlerinin gerçek entegrasyonuna izin veren tek yaklaşımdır. Bununla birlikte, Appion, elektron mikroskoplarından otomatik görüntü toplama sistemi olan ^Leginon32 ile sıkı bir şekilde bağlantılıdır. Scipion ile temel fark, veri modeli ve depolamanın daha az birleştirilmiş olmasıdır. Bu şekilde, Scipion'da yeni bir protokol oluşturmak için yalnızca bir Python komut dosyası geliştirilmesi gerekir. Ancak, Appion'da geliştiricinin komut dosyasını yazması ve temel veritabanını değiştirmesi gerekir. Özetle, Scipion bakım ve genişletilebilirliği basitleştirmek için geliştirilmiştir.

Bu yazıda , Plasmodium falciparum 80S Ribozom'un gerçek durum veri kümesini kullanarak Cryo-EM işleme için eksiksiz bir iş akışı sunduk (EMPIAR girişi: 10028, EMDB girişi: 2660). Burada ele alınan ve tartışılan adımlar film hizalaması, CTF tahmini, parçacık toplama, 2D sınıflandırma, ilk harita tahmini, 3D sınıflandırma, 3D iyileştirme, değerlendirme ve işlem sonrası olarak özetlenebilir. Bu adımların birkaçında farklı paketler kullanılmış ve konsensüs araçları uygulanmıştır. Son 3D yeniden inşa edilen hacim 3 şçözünürlüğe ulaştı ve işlendikten sonra, atomların uzayda nasıl düzenlendiğini açıklamaya yardımcı olan alfa-helikler gibi bazı ikincil yapılar ayırt edilebilir.

Bu yazıda sunulan iş akışı, Scipion'un farklı Cryo-EM paketlerini basitleştirmek ve aynı zamanda daha güvenilir bir sonuç elde etmek için basit ve bütünleştirici bir şekilde birleştirmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.

Gelecekte, yeni yöntem ve paketlerin geliştirilmesi büyümeye devam edecek ve Scipion gibi yazılımların hepsini kolayca entegre etmesi araştırmacılar için daha da önemli olacaktır. Konsensüs yaklaşımları, farklı temellere sahip birçok yöntemin mevcut olacağı ve Cryo-EM'deki yeniden yapılanma sürecinde yer alan tüm parametrelerin daha doğru tahminlerinin elde edilmesine yardımcı olacaktır. Takip ve tekrarlanabilirlik, araştırma sürecinde anahtardır ve eksiksiz iş akışlarının yürütülmesi için ortak bir çerçeveye sahip olması sayesinde Scipion ile elde etmek daha kolaydır.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
no material is used in this article	-	-	-