Крио-ЭМ и анализ одиночных частиц с помощью Scipion

Резюме

Одночастичный анализ в криоэлектронной микроскопии является одним из основных методов, используемых для определения структуры биологических ансамблей с высоким разрешением. Scipion предоставляет инструменты для создания всего конвейера для обработки информации, полученной микроскопом, и достижения 3D-реконструкции биологического образца.

Аннотация

Криоэлектронная микроскопия стала одним из важнейших инструментов в биологических исследованиях для выявления структурной информации макромолекул при околоатомном разрешении. При анализе одной частицы остеклованный образец визуализируется электронным пучком, и детекторы в конце колонки микроскопа производят пленки этого образца. Эти фильмы содержат тысячи изображений одинаковых частиц в случайных ориентациях. Данные должны пройти через рабочий процесс обработки изображений с несколькими шагами, чтобы получить окончательный 3D-реконструированный том. Целью рабочего процесса обработки изображений является определение параметров сбора, чтобы иметь возможность реконструировать исследуемый образец. Scipion предоставляет все инструменты для создания этого рабочего процесса с использованием нескольких пакетов обработки изображений в интегративной структуре, что также позволяет отслеживать результаты. В этой статье весь рабочий процесс обработки изображений в Scipion представлен и обсужден с данными, поступающими из реального тестового случая, давая все детали, необходимые для перехода от фильмов, полученных микроскопом, к окончательной 3D-реконструкции с высоким разрешением. Также обсуждается целесообразность использования консенсусных инструментов, позволяющих комбинировать методы, и подтверждать результаты на каждом этапе рабочего процесса, повышая точность получаемых результатов.

Введение

В криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ) анализ одиночных частиц (SPA) остеклованных замороженно-гидратированных образцов является одним из наиболее широко используемых и успешных вариантов визуализации биологических макромолекул, поскольку позволяет понять молекулярные взаимодействия и функцию биологических ^{ансамблей1}. Это благодаря недавним достижениям в этой технике визуализации, которые привели к «революции разрешения»² и позволили успешно определить биологические 3D-структуры с почти атомным разрешением. В настоящее время самое высокое разрешение, достигнутое в SPA cryo-EM, составляет 1,15 Å для апоферритина3 (запись EMDB: 11668). Эти технологические достижения включают усовершенствования в подготовке ^{образцов4}, получении ^{изображения5} и методах обработки ^{изображений6}. Эта статья посвящена этому последнему пункту.

Вкратце, целью методов обработки изображений является идентификация всех параметров сбора для инверсии процесса визуализации микроскопа и восстановления 3D-структуры изучаемого биологического образца. Этими параметрами являются усиление камеры, движение, индуцированное лучом, аберрации микроскопа (в основном расфокусировка), 3D-угловая ориентация и трансляция каждой частицы, а также конформационное состояние в случае наличия образца с конформационными изменениями. Однако количество параметров очень велико и крио-ЭМ требует использования низкодозных изображений, чтобы избежать радиационного повреждения, что значительно снижает отношение сигнал/шум (SNR) полученных изображений. Таким образом, задача не может быть однозначно решена и все параметры, подлежащие расчету, могут быть только оценками. В ходе рабочего процесса обработки изображения следует определить правильные параметры, отбросив оставшиеся, чтобы наконец получить 3D-реконструкцию с высоким разрешением.

Данные, генерируемые микроскопом, собираются в кадрах. Упрощая, кадр содержит количество электронов, которые достигли определенного положения (пикселя) на изображении, всякий раз, когда используются детекторы подсчета электронов. В определенном поле зрения собирается несколько кадров и это называется фильмом. Поскольку низкие дозы электронов используются, чтобы избежать радиационного повреждения, которое может разрушить образец, SNR очень низкий, и кадры, соответствующие одному и тому же фильму, должны быть усреднены для получения изображения, раскрывающего структурную информацию о образце. Однако применяется не только простое среднее значение, образец может страдать от сдвигов и других видов движений во время визуализации из-за движения, вызванного лучом, которое необходимо компенсировать. Кадры со смещенной компенсацией и усредненные кадры создают микрофотографию.

Как только микроснимки получены, нам нужно оценить аберрации, введенные микроскопом для каждого из них, называемые контрастной передаточной функцией (CTF), которая представляет изменения контраста микрофотографии как функцию частоты. Затем частицы могут быть выбраны и извлечены, что называется отбором частиц. Каждая частица должна представлять собой небольшое изображение, содержащее только одну копию исследуемого образца. Существует три семейства алгоритмов выбора частиц: 1) те, которые используют только некоторую базовую параметризацию внешнего вида частицы, чтобы найти их во всем наборе микроснимков (например, размер частиц), 2) те, которые узнают, как выглядят частицы от пользователя или предварительно обученного набора, и 3) те, которые используют шаблоны изображений. Каждая семья имеет разные свойства, которые будут показаны позже.

Извлеченный набор частиц, обнаруженных на микроснимках, будет использоваться в процессе 2D-классификации, который имеет две цели: 1) очистка набора частиц путем отбрасывания подмножества, содержащего чистые шумовые изображения, перекрывающиеся частицы или другие артефакты, и 2) усредненные частицы, представляющие каждый класс, могут быть использованы в качестве начальной информации для расчета начального объема 3D.

Расчет начального объема в 3D является следующим важным шагом. Проблему получения 3D-структуры можно рассматривать как задачу оптимизации в многомерном ландшафте решений, где глобальный минимум является лучшим 3D-объемом, представляющим исходную структуру, но можно найти несколько локальных минимумов, представляющих неоптимальные решения, и где очень легко попасть в ловушку. Начальный объем представляет собой отправную точку для процесса поиска, поэтому плохая первоначальная оценка объема может помешать нам найти глобальный минимум. Из начального объема этап 3D-классификации поможет обнаружить различные конформационные состояния и снова очистить набор частиц; цель состоит в том, чтобы получить структурно однородную популяцию частиц. После этого этап 3D-уточнения будет отвечать за уточнение угловых и трансляционных параметров для каждой частицы, чтобы получить наилучший возможный 3D-объем.

Наконец, на последних этапах полученную 3D-реконструкцию можно заточить и отполировать. Резкость - это процесс повышения высоких частот реконструируемого объема, а полировка - это шаг для дальнейшего уточнения некоторых параметров, таких как CTF или компенсация движения, вызванная пучком, на уровне частиц. Кроме того, некоторые процедуры проверки могут быть использованы для лучшего понимания достигнутого решения в конце рабочего процесса.

После всех этих этапов процессы трассировки и ^{стыковки7} помогут придать биологический смысл полученной 3D-реконструкции, путем построения атомных моделей de novo или подгонки существующих моделей. Если будет достигнуто высокое разрешение, эти процессы расскажут нам о положении биологических структур, даже различных атомов, в нашей структуре.

^Scipion8 позволяет создать весь рабочий процесс, объединяя наиболее релевантные пакеты обработки изображений интегративным способом. ^Xmipp9, ^Relion10, CryoSPARC11, ^Eman12, ^Spider13, ^Cryolo14, ^Ctffind15, CCP416, ^Phenix17 и многие другие пакеты могут быть включены в Scipion. Кроме того, он включает в себя все необходимые инструменты для улучшения интеграции, совместимости, прослеживаемости и воспроизводимости, чтобы обеспечить полное отслеживание всего рабочего процесса обработки ^{изображений8}.

Одним из самых мощных инструментов, которые Scipion позволяет нам использовать, является консенсус, что означает сравнение результатов, полученных несколькими методами на одном этапе обработки, делая комбинацию информации, передаваемой различными методами, для получения более точного вывода. Это может помочь повысить производительность и улучшить достигнутое качество в расчетных параметрах. Обратите внимание, что более простой рабочий процесс может быть построен без использования консенсусных методов; однако мы видели мощь этого ^{инструмента22,25}, и рабочий процесс, представленный в этой рукописи, будет использовать его в несколько этапов.

Все шаги, которые были кратко изложены в предыдущих пунктах, будут подробно объяснены в следующем разделе и объединены в полный рабочий процесс с использованием Scipion. Кроме того, будет показано, как использовать инструменты консенсуса для достижения более высокого согласия в генерируемых результатах. С этой целью был выбран пример набора данных рибосомы Plasmodium falciparum 80S (запись EMPIAR: 10028, запись EMDB: 2660). Набор данных состоит из 600 фильмов по 16 кадров размером 4096x4096 пикселей при размере пикселя 1,34Å, снятых на FEI POLARA 300 с камерой FEI FALCON II, с заявленным разрешением в EMDB ^3,2Å18 .

протокол

1. Создание проекта в Scipion и импорт данных

1. Откройте Scipion и нажмите Create Project, укажите имя проекта и место, где он будет сохранен (дополнительный рисунок 1). Scipion откроет окно проекта, показывая холст с левой стороны панелью со списком доступных методов, каждый из которых представляет собой один инструмент обработки изображений, который можно использовать для управления данными.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ctrl+F можно использовать для поиска метода, если он не отображается в списке.
2. Для импорта фильмов, снятых микроскопом, выберите pwem - импорт фильмов на левой панели (или введите его при нажатии Ctrl+F).
3. Откроется новое окно (дополнительный рисунок 2). Там включите путь к данным и параметры сбора. В этом примере используйте следующую настройку: напряжение микроскопа 300 кВ, сферическая аберрация 2,0 мм, амплитудная контрастность 0,1, скорость увеличения 50000, режим частоты дискретизации в от изображения и размер пикселя 1,34 Å. Когда все параметры в форме будут заполнены, нажмите на кнопку Выполнить .
   ПРИМЕЧАНИЕ: При запуске метода на холсте появляется поле желтого цвета с пометкой «выполняется». Когда метод завершается, поле становится зеленым, а метка — готовой. В случае ошибки во время выполнения метода, поле появится красным цветом, помеченное как failed. В этом случае проверьте нижнюю часть холста, на вкладке Журнал вывода появится объяснение ошибки.
4. Когда метод завершится, проверьте результаты в нижней части холста на вкладке Сводка . Здесь представлены выходы, сгенерированные методом, в данном случае набор фильмов. Нажмите на кнопку «Анализировать результаты », и появится новое окно со списком фильмов.

2. Выравнивание фильмов: от фильмов до микрофотографий

1. Используйте метод xmipp3 - оптическое выравнивание , которое реализует Optical ^flow19. Используйте следующие параметры для заполнения формы (дополнительный рисунок 3): Input Movies — это те, которые получены на шаге 1, диапазон в Frames to ALIGN — от 2 до 13, остальные параметры остаются со значениями по умолчанию. Выполните программу.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры, выделенные жирным шрифтом в форме, должны быть всегда заполнены. Остальные будут иметь значение по умолчанию или не будут обязательными. В верхней части окна формы можно найти поля, в которых распределены вычислительные ресурсы, как потоки, MPI или графические процессоры.
2. Нажмите на Analyze Results (Анализировать результаты ), чтобы проверить полученные микроснимки и траекторию предполагаемых сдвигов (рисунок 1). Для каждой увиденной микроснимки: посмотрите на спектральную плотность мощности (PSD), полученные траектории для выравнивания фильма (одна точка на кадр) в декартовых и полярных координатах, а также название файла полученной микрофотографии (нажав на нее, микрофотографию можно осмотреть). Обратите внимание, что частицы образца гораздо более заметны на микрофотографии, по сравнению с одним кадром фильма.

3. Оценка CTF: расчет аберраций микроскопа

1. Для начала воспользуйтесь методом григорьеффлаба – ctffind15. Настройка такова: входные микроснимки являются выходом шага 2, коэффициент понижения разрешения CTF вручную установлен на 1,5, а диапазон разрешения варьируется от 0,06 до 0,42. Кроме того, в разделе Дополнительные параметры (которые можно найти, выбрав этот вариант в Экспертном уровне формы) установите размер окна равным 256. Остальные параметры остаются со значениями по умолчанию (дополнительный рисунок 4).
   ПРИМЕЧАНИЕ: В большинстве методов в Scipion опция Advanced показывает больше параметров конфигурации. Используйте эти опции осторожно, когда программа для запуска полностью известна и смысл параметров понятен. Некоторые параметры может быть трудно заполнить, не взглянув на данные; в этом случае Scipion показывает волшебную палочку с правой стороны, которая покажет окно мастера (дополнительный рисунок 5). Например, в поле Разрешение такая форма особенно полезна, так как эти значения следует выбирать, чтобы приблизительно охватить область от первого нуля до последнего заметного кольца PSD.
2. Нажмите На Execute и на Analyze Results (Рисунок 2), когда метод закончится. Убедитесь, что расчетный CTF совпадает с экспериментальным. С этой целью посмотрите на PSD и сравните оценочные кольца в углу с теми, которые исходят из данных. Также проверьте полученные значения расфокусировки, чтобы найти какие-либо неожиданные значения, и соответствующие микроснимки могут быть отброшены или пересчитаны. В этом примере может быть использован весь набор микроснимков.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте кнопки в нижней части окна, чтобы сделать подмножество микрофотографий (с красной кнопкой Micrographs ) и пересчитать CTF (с красной кнопкой Пересчитать CTF ), в случае необходимости.
3. Для уточнения предыдущей оценки используйте xmipp3 - ctf ^estimation20. Выберите в качестве входных микроснимков вывод шага 2, выберите опцию Использовать defoci из предыдущей оценки CTF, так как предыдущая оценка CTF выберет выход grigoriefflab - ctffind, и, в расширенном уровне, измените размер окна на 256 (дополнительный рисунок 6). Запустите его.
4. Нажмите « Анализировать результаты», чтобы проверить полученные CTF. С помощью этого метода больше данных оценивается и представляется в некоторых дополнительных столбцах. Поскольку ни один из них не показывает неправильных оценочных значений, все микроснимки будут использоваться на следующих этапах.

4. Отбор частиц: поиск частиц на микроснимках

1. Перед началом сбора проведите предварительную обработку микрофотографий. Откройте xmipp3 - препроцессируйте микрофотографии, установите в качестве входных микроснимков те, которые получены на шаге 2 и выберите опции Удалить плохие пиксели? с кратным Stddev до 5 и Downsample микрофотографий? с коэффициентом даунсамплинга 2 (Дополнительный рисунок 7). Нажмите «Выполнить» и проверьте, что размер полученных микроснимков был уменьшен.
2. Для комплектации используйте xmipp3 - ручной подбор (шаг 1) и xmipp3 - автоподбор (шаг 2)²¹. Ручная комплектация позволяет вручную подготовить набор частиц, с помощью которых на этапе автоподбора будет изучен и сгенерирован полный набор частиц. Во-первых, запустите xmipp3 - ручной отбор (шаг 1) с input Micrographs в качестве микроснимков, полученных в предыдущем препроцессе. Нажмите на Execute , и появится новое интерактивное окно (рисунок 3).
3. В этом окне представлен список микроснимков (рисунок 3a) и другие опции. Измените размер (px) на 150, это будет размер коробки, содержащей каждую частицу. Выбранная микрофотография появится в большом окне. Выберите область и все видимые частицы в ней (рисунок 3b). Затем нажмите Активировать обучение , чтобы начать обучение. Остальные области микрофотографии выбираются автоматически (рисунок 3c). Проверьте выбранные частицы и включите больше, нажав на него, или удалите неправильные с помощью shift + clicking, если это необходимо.
4. Выберите следующую микрофотографию в первом окне. Микрофотография будет выбрана автоматически. Проверьте еще раз, чтобы включить или удалить некоторые частицы, если это необходимо. Повторите этот шаг примерно с 5 микроснимками, чтобы создать репрезентативный тренировочный набор.
5. Как только это будет сделано, нажмите на Координаты в главном окне, чтобы сохранить координаты всех выбранных частиц. Обучающий набор частиц готов к автоподбору, чтобы завершить процесс для всех микроснимков.
6. Открыть xmipp3 - автоподбор (шаг 2), указывающий в Xmipp на подбор частиц запустить предыдущую ручную комплектацию, а микрофотографии выбрать как То же самое, что контролируется. Нажмите кнопку Выполнить. Этот метод сгенерирует в качестве выходных данных набор из около 100000 координат.
7. Применяйте консенсусный подход, поэтому проведите второй метод отбора, чтобы выбрать частицы, в которых согласны оба метода. Откройте sphire - cryolo ^picking14 и выберите предварительно обработанные микроснимки в качестве входных микрофотографий, используйте общую модель? до Да, с порогом достоверности 0,3 и размером коробки 150 (дополнительный рисунок 8). Запустите его. Этот метод должен генерировать также около 100000 координат.
8. Запуск xmipp3 - глубокий консенсусный ^выбор22. В качестве входных координат включают вывод sphire - криоло комплектация (шаг 4.7) и xmipp3 - автоподбор (шаг 4.6), установите для параметра Выбрать тип модели значение Pretrained, а также Пропустить обучение и забить непосредственно с предварительно обученной моделью? Да (дополнительный рисунок 9). Запустите его.
9. Нажмите «Анализировать результаты» и в новом окне на значке глаза рядом с пунктом «Выбрать частицы/координаты с высокими значениями «zScoreDeepLearning1». Откроется новое окно со списком всех частиц (рисунок 4). Значения zScore в столбце дают представление о качестве частицы, низкие значения означают плохое качество.
   1. Нажмите на метку_xmipp_zScoreDeepLearning чтобы упорядочить частицы от самого высокого к самому низкому zScore. Выберите частицы с zScore выше 0,75 и нажмите « Координаты», чтобы создать новое подмножество. Это должно создать подмножество с приблизительно 50000 координат.
10. Open xmipp3 - очиститель глубокой микрофотографии. Выберите в качестве Входные координаты подмножество, полученное на предыдущем шаге, Источник микрофотографий такой же, как координаты, и сохраните Пороговое значение 0,75. Запустите его. Проверьте на вкладке Сводка , что количество координат было уменьшено, хотя в этом случае удаляется только несколько координат.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг способен дополнительно очистить набор координат и может быть очень полезен при очистке других наборов данных с большим количеством артефактов фильма в виде углеродных зон или больших примесей.
11. Run xmipp3 - извлечение частиц (Дополнительный рисунок 10). Укажите в качестве входных координат координаты, полученные после предыдущего шага, Источник микрофотографий как другие, Входные микроснимки как выход шага 2, Оценку CTF как выход оценки xmipp3 - ctf, Коэффициент понижения дискретизации до 3 и Размер коробки частиц до 100. На вкладке Предварительная обработка формы выберите Да всем. Запустите его.
12. Убедитесь, что выходные данные должны содержать частицы уменьшенного размера 100x100 пикселей и размера пикселя 4.02Å/px.
13. Запустите снова xmipp3 - извлеките частицы , изменив следующие параметры: коэффициент понижения дискретизации до 1, а размер коробки частиц до 300. Убедитесь, что на выходе находится тот же набор частиц, но теперь в полном разрешении.

5. 2D классификация: группировка похожих частиц вместе

1. Откройте метод cryosparc2 - 2d классификации11 с Input частицами, полученными на шаге 4.11 и, во вкладке 2D Классификация, Число классов до 128, сохраните все остальные параметры со значениями по умолчанию. Запустите его.
2. Нажмите На Analyze Results (Анализировать результаты ), а затем на значке глаза рядом с пунктом Display class particle with Scipion (рисунок 5). Такая классификация поможет очистить множество частиц, так как несколько классов будут казаться шумными или с артефактами. Выберите классы, содержащие хорошие представления. Нажмите на Частицы (красная кнопка в нижней части окна), чтобы создать подмножество очистителей.
3. Теперь откройте xmipp3 - cl2d23 и установите в качестве Входные изображения изображения, полученные на предыдущем шаге и Количество классов как 128. Нажмите кнопку Выполнить.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эта вторая классификация используется в качестве дополнительной стадии очистки набора частиц. Обычно полезно удалить как можно больше шумных частиц. Однако, если требуется более простой рабочий процесс, можно использовать только один метод 2D-классификации.
4. Когда метод закончится, проверьте 128 сгенерированных классов, щелкнув Анализ результатов и Что показывать: классы. Большинство сгенерированных классов показывают проекцию макромолекулы с некоторым уровнем детализации. Однако некоторые из них выглядят шумными (в этом примере примерно 10 классов). Выберите все хорошие классы и нажмите кнопку Классы, чтобы создать новое подмножество только с хорошими. Это подмножество будет использоваться в качестве входных данных для одного из методов для создания начального тома. С теми же выбранными классами нажмите на Частицы, чтобы создать более чистое подмножество после удаления тех, которые принадлежат к плохим классам.
5. Open pwem - подмножество с полным набором элементов в качестве выхода 4.13 (все частицы в полном размере), Make random subset to No, Other set как подмножество частиц, созданных на предыдущем шаге, и Set operation as intersection. Это позволит извлечь предыдущее подмножество из частиц с полным разрешением.

6. Первоначальная оценка объема: построение первого угадывания 3D-объема

1. На этом этапе оцените два начальных тома с помощью различных методов, а затем используйте инструмент консенсуса для создания окончательного расчетного 3D-объема. Open xmipp3 - реконструируйте метод ^{significant24} с классами Input, полученными после шага 5, группа Symmetry как c1, и сохраните оставшиеся параметры со значениями по умолчанию (дополнительный рисунок 11). Выполните его.
2. Нажмите «Анализировать результаты». Убедитесь, что получен объем низкого разрешения размером 100x100x100 пикселей и размер пикселя 4.02Å/px.
3. Open xmipp3 - обрезка/изменение размера томов (дополнительный рисунок 12), используя в качестве входных томов тот, который был получен на предыдущем шаге, Изменить размер томов? на Да, Изменить размер параметра на частоту дискретизации и Изменить частоту дискретизации до 1,34 Å/px. Запустите его. Проверьте на вкладке Сводка , что выходной том имеет правильный размер.
4. Теперь создайте второй начальный том. Открытый релион - 3D начальная ^{модель10}, так как входные частицы используют хорошие частицы с полным разрешением (выход 5,5) и устанавливают диаметр маски частиц на 402Å, сохраняют остальные параметры со значениями по умолчанию. Запустите его.
5. Нажмите «Анализировать результаты», а затем в разделе Отображаемый том с: фрагментами. Убедитесь, что получен объем с низким разрешением, но с основной формой структуры (Дополнительный рисунок 13).
6. Теперь откройте pwem - объединить наборы , чтобы объединить два сгенерированных начальных тома для создания входных данных для метода консенсуса. Просто укажите Volumes в качестве типа Input и выберите два начальных тома в наборе Input. Запустите его. Выходные данные должны представлять собой набор, содержащий два элемента с обоими томами.
7. Инструмент консенсуса включен в xmipp3 - swarm ^consensus25. Откройте. Используйте в качестве полноразмерных изображений хорошие частицы в полном разрешении (выход 5,5), так как начальные объемы множества с двумя элементами, сгенерированными на предыдущем шаге, и убедитесь, что группа симметрии равна c1. Нажмите кнопку Выполнить.
8. Нажмите «Анализировать результаты». Убедитесь, что получен более подробный выходной объем (рисунок 6). Хотя вокруг структуры больше шума, наличие более подробной информации на карте структуры поможет следующим шагам уточнения, чтобы избежать локальных минимумов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если UCSF ^Chimera26 доступен, используйте последнюю иконку в верхней части окна, чтобы сделать 3D визуализацию полученного объема.
9. Откройте и выполните relion - 3D auto-refine10, чтобы сделать первое 3D угловое назначение частиц. Выберите в качестве входных частиц выход 5,5 и установите диаметр маски частиц равным 402Å. На вкладке Эталонная 3D-карта выберите в качестве Входного объема тот, который был получен на предыдущем шаге, Симметрия как c1 и Начальный фильтр нижних частот до 30Å (Дополнительный рисунок 14).
10. Нажмите «Анализировать результаты». В новом окне выберите final как Volume для визуализации и нажмите на Display volume with: slices, чтобы увидеть полученный объем. Проверьте также корреляцию оболочки Фурье (FSC), щелкнув Графики разрешения дисплея в окне результатов и угловое покрытие в Display angular distribution: 2D plot (Рисунок 7). Реконструированный объем содержит гораздо больше деталей (вероятно, с некоторыми размытыми областями во внешней части структуры), а FSC пересекает порог 0,143 около 4,5Å. Угловое покрытие охватывает всю 3D-сферу.

7.3D классификация: обнаружение конформационных состояний

1. Используя консенсусный подход, если в данных есть разные конформационные состояния, можно обнаружить. Открытый релион - 3D классификация10 (Дополнительный рисунок 15). В качестве входных частиц используют только что полученные в 6,10, и устанавливают диаметр маски частиц на 402Å. На вкладке Эталонная 3D-карта используйте в качестве входного объема тот, который получен после шага 6.10, установите для параметра Симметрия значение c1, а для начального фильтра нижних частот значение 15Å. Наконец, на вкладке Оптимизация установите для параметра Количество классов значение 3. Запустите его.
2. Проверьте результаты, нажав на Анализ результатов, выберите Показать классификацию в Scipion. Показаны три сгенерированных класса и некоторые интересные меры. Первые два класса должны иметь одинаковое количество назначенных изображений (столбец размера ) и выглядеть очень похожими, в то время как третий имеет меньше изображений и более размытый внешний вид. Кроме того, rlnAccuracyRotations и rlnAccuracyTranslations должны быть явно лучше для первых двух классов. Выберите два лучших класса и нажмите кнопку Классы, чтобы создать подмножество, содержащее их.
3. Повторите шаги 7.1 и 7.2, чтобы создать вторую группу хороших классов. И то, и другое будет вкладом в инструмент консенсуса.
4. Откройте и запустите xmipp3 - консенсусные классы 3D и выберите в качестве входных классов два подмножества, сгенерированные на предыдущих шагах.
5. Нажмите «Анализировать результаты». Представлено число совпадающих частиц между классами: первое значение — это число совпадающих частиц в первом классе подмножества 1 и первом классе подмножества 2, второе значение — количество совпадающих частиц в первом классе подмножества 1 и втором классе подмножества 2 и т. д. Убедитесь, что частицы случайным образом распределены по классам один или два, что означает, что метод 3D-классификации не способен найти конформационные изменения. Учитывая этот результат, весь набор частиц будет использоваться для продолжения обработки.

8.3D уточнение: уточнение угловых назначений однородной популяции

1. Опять же, примените консенсусный подход на этом этапе. Во-первых, откройте и запустите pwem - подмножество с полным набором элементов на выходе 6.9, Make random subset to Yes, и Number of elements to 5000. При этом создается подмножество изображений с предыдущим выравниванием для обучения методу, используемому на следующем шаге.
2. Open xmipp3 - глубокое выравнивание, установите Входные изображения как выход хороших частиц, полученных в 5.5, Объем как полученный после 6.10, Входное обучение, как созданное на предыдущем шаге, Целевое разрешение на 10Å, и сохраните остальные параметры со значениями по умолчанию (Дополнительный рисунок 16). Нажмите кнопку Выполнить.
3. Нажмите на Analyze Results (Анализировать результаты), чтобы проверить полученное угловое распределение, где нет пропущенных направлений, а угловое покрытие немного улучшается по сравнению с 6.10 (рисунок 8).
4. Откройте и выполните xmipp3 - сравните углы и выберите в качестве Входные частицы 1 выход 6.9 и Входные частицы 2 выход 8.2, убедитесь, что группа Симметрия c1. Этот метод вычисляет соглашение между xmipp3 - глубокое выравнивание и relion - 3D автоочистка.
5. Нажмите на Анализ результатов, отображается список частиц, с полученными различиями в сдвигах и углах. Нажмите на иконку панели в верхней части окна, откроется другое окно, позволяющее сделать графики вычисляемых переменных. Выберите _xmipp_angleDiff и нажмите «График», чтобы увидеть представление угловых различий на частицу. Проделайте то же самое с _xmipp_shiftDiff. На этих рисунках примерно в половине частиц оба метода сходятся (рисунок 9). Выберите частицы с угловыми разностями ниже 10º и создайте новое подмножество.
6. Теперь откройте xmipp3 - highres27, чтобы произвести локальную доработку заданных углов. Во-первых, выберите в качестве Полноразмерные изображения изображения, полученные на предыдущем шаге, и в качестве Начальных объемов вывод 6,9, установите Радиус частицы на 150 пикселей и группу Симметрия как c1. На вкладке Угловое назначение задайте для параметров Выравнивание изображения значение Локальный, Для числа итераций значение 1 и Для параметров Макс. Целевое разрешение 5Å/px (дополнительный рисунок 17). Запустите его.
7. На вкладке Сводка убедитесь, что выходной объем меньше 300x300x300 пикселей и имеет немного больший размер пикселя.
8. Нажмите « Анализировать результаты», чтобы увидеть полученные результаты. Нажмите на Графики разрешения дисплея, чтобы увидеть FSC, и на Дисплей тома: Реконструировано , чтобы увидеть полученный том (Дополнительный рисунок 18). Получается хороший объем разрешения, близкий к 4-3,5А.
9. Нажмите на Дисплей выходных частиц и в окне со списком частиц нажмите на значок панели. В новом окне выберите Ввести как гистограмму со 100 корзинами, выберите метку _xmipp_cost и, наконец, нажмите Plot (Дополнительный рисунок 19). Таким образом, представляется гистограмма метки затрат , которая содержит корреляцию частицы с выбранным для нее направлением проекции. В этом случае получается функция унимодальной плотности, которая является признаком отсутствия разных популяций в множестве частиц. Таким образом, все они будут использованы для продолжения доработки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В случае просмотра мультимодальной функции плотности, следует выбрать набор частиц, принадлежащих к более высокому максимуму, чтобы продолжить рабочий процесс только с ними.
10. Открыть и выполнить снова xmipp3 - высокие разрешения с Продолжить из предыдущего запуска? Значение Да, установите в качестве Полноразмерные изображения , полученные после версии 8.5, и выберите предыдущий запуск с предыдущим выполнением Xmipp Highres. На вкладке Угловое назначение установите для параметра Выравнивание изображения значение Локальное с 1 итерацией и 2,6Å/px в качестве целевого разрешения (полное разрешение).
11. Теперь вывод должен содержать объем в полном разрешении (размер 300x300x300 пикселей). Нажмите « Анализировать результаты», чтобы еще раз проверить полученный объем и FSC, который теперь должен быть объемом с высоким разрешением около 3Å (рисунок 10).

9. Оценка и постобработка

1. Открыть xmipp3 - локальный MonoRes28. Этот метод вычисляет разрешение локально. Установите в качестве Входного тома тот, который получен после 8.10, установите Вы хотите использовать половинные тома? на Да, и Диапазон разрешения от 1 до 10Å. Запустите его.
2. Нажмите «Анализировать результаты» и выберите «Показать гистограмму разрешения» и «Показать цветные фрагменты» (рисунок 11). Показано разрешение в разных частях тома. Большинство вокселей центральной части структуры должны представлять разрешения около 3Å, в то время как худшие разрешения достигаются во внешних частях. Также показана гистограмма разрешений на воксель с пиком около (даже ниже) 3Å.
3. Откройте и запустите xmipp3 - локальную заточку29 для применения заточки. Выберите в качестве Входной карты тот, который получен в 8.10, и в качестве Карты разрешения, полученный на предыдущем шаге с MonoRes.
4. Нажмите на Анализ результатов , чтобы проверить полученные тома. Откройте последнюю, соответствующую последней итерации алгоритма. Рекомендуется открывать том с помощью других инструментов, таких как UCSF ^Chimera26, чтобы лучше увидеть особенности тома в 3D (рисунок 12).
5. Наконец, откройте инструмент проверки, включенный в xmipp3 - validate overfitting30, который покажет, как меняется разрешение с количеством частиц. Откройте его и включите в качестве входных частиц частицы, полученные на шаге 8.5, установите Расчет шума, связанного с разрешением? Да, с начальным 3D эталонным объемом в качестве выхода 8.10. В дополнительных параметрах установите для параметра Число частиц значение "500 1000 1500 2000 3000 5000 10000 15000 20000" (Дополнительный рисунок 20). Запустите его.
6. Нажмите на Анализ результатов. Два графика появятся (рисунок 13) с эволюцией разрешения, в зеленой линии, по мере роста количества частиц, используемых в реконструкции. Красная линия представляет разрешение, достигнутое с помощью реконструкции выровненного гауссовского шума. Разрешение улучшается с количеством частиц и наблюдается большая разница реконструкции из частиц по сравнению с таковой из шума, что является показателем наличия частиц с хорошей структурной информацией.
7. Из предыдущих результатов можно было бы провести подгонку модели в переобработанном объеме, что позволило бы обнаружить биологические структуры макромолекулы.

Результаты

Мы использовали набор данных Plasmodium falciparum 80S Ribosome (запись EMPIAR: 10028, запись EMDB: 2660) для проведения теста, и с протоколом Scipion, представленным в предыдущем разделе, был достигнут 3D-реконструированный объем макромолекулы с высоким разрешением в этом конкретном примере, начиная с информации, собранной микроскопом, которая состоит из очень шумных изображений, содержащих 2D-проекции в любой ориентации образца.

Основные результаты, полученные после запуска всего протокола, представлены на рисунке 10, рисунке 11 и рисунке 12. На рисунке 10 представлен полученный 3D-объем перед постобработкой. На рисунке 10a видно, что FSC равен 3 Å, что он очень близок к пределу Найквиста (с данными с размером пикселя 1,34 Å предел Найквиста равен 2,6 Å). На рисунке 10b показаны некоторые фрагменты реконструированного 3D-объема с высоким уровнем детализации и четко определенными структурами. На рисунке 11 представлены результаты после локального анализа разрешения полученного 3D-объема. Можно видеть, что большинство вокселей в структуре достигают разрешения ниже 3 Å, в основном те, которые расположены в центральной части структуры. Тем не менее, внешняя часть показывает худшие разрешения, что согласуется с размытием, появляющимся в этих областях на срезах рисунка 10b. На рисунке 12 показана та же 3D-карта после постобработки, которая способна выделить более высокие частоты объема, раскрывая больше деталей и улучшая представление, что можно увидеть особенно в 3D-представлении на рисунке 12c.

На рисунке 14 ^Chimera26 использовалась для просмотра 3D-представления полученного объема (рисунок 14a), постобработанного (рисунок 14b) и карты разрешения (рисунок 14c), окрашенной цветовым кодом локальных разрешений. Это может дать еще больше информации о полученной структуре. Этот инструмент очень полезен, чтобы получить представление о качестве полученного объема, так как можно увидеть очень мелкие детали во всем 3D-контексте структуры. Когда достигнутого разрешения достаточно, можно найти даже некоторые биохимические части структуры (например, альфа-спирали на рисунке 14d. На этом рисунке должно быть выделено высокое разрешение, достигнутое во всех центральных частях 3D-структуры, которое можно увидеть в виде темно-синих областей на рисунке 14c.

Все предыдущие результаты были достигнуты благодаря хорошей производительности всего протокола, но это может быть не так. Существует несколько способов выявления плохого поведения. В самом общем случае это происходит, когда полученная структура имеет низкое разрешение и не способна эволюционировать в лучшую. Один из примеров этого представлен на рисунке 15. Размытый объем (рисунок 15c) приводит к низкому FSC, который можно увидеть на кривой FSC (рисунок 15a) и гистограмме локальной оценки (рисунок 15b). Этот пример был сгенерирован с использованием метода 3D-уточнения с неправильными входными данными, так как он ожидал некоторых специфических свойств во входном наборе частиц, которые они не выполняют. Как видно, всегда очень важно знать, как различные методы ожидают получения данных и их правильной подготовки. В общем, при получении выходных данных, подобных показанному на рисунке 15 , может возникнуть проблема в рабочем процессе обработки или базовых данных.

В рабочем процессе есть несколько контрольных точек, которые можно проанализировать, чтобы узнать, правильно ли развивается протокол или нет. Например, сразу после отбора несколько методов, рассмотренных ранее, могут ранжировать частицы и дать оценку для каждой из них. В случае наличия плохих частиц эти методы позволяют идентифицировать и удалить их. Кроме того, 2D-классификация может быть хорошим показателем наличия плохого набора частиц. На рисунке 16 показан пример такого плохого набора. На рисунке 16a показаны хорошие классы, содержащие некоторые детали структуры, в то время как на рисунке 16b показаны плохие классы, которые являются шумными или невведенными, в этом последнем случае видно, что выбор был неправильным и две частицы, кажется, появляются вместе. Другой контрольной точкой является первоначальная оценка объема, на рисунке 17 показан пример хороших (рисунок 17a) и плохих (рисунок 17b) первоначальных оценок. Неправильная оценка была создана с использованием неправильной настройки метода. Необходимо учитывать, что все настройки должны быть сделаны тщательно, правильно выбирая каждый параметр в соответствии с анализируемыми данными. В случае отсутствия карты с некоторой минимальной структурной информацией, следующая доработка не сможет получить хорошую реконструкцию.

Когда проблема заключается в плохом приобретении, при котором фильмы не сохраняют структурную информацию, извлечь из них хорошие частицы и получить успешную обработку будет невозможно. В этом случае следует собрать больше фильмов, чтобы получить 3D-реконструкцию с высоким разрешением. Но, если это не так, есть несколько способов управления проблемами в рабочем процессе обработки. Если сбор недостаточно хорош, есть несколько способов попытаться исправить это, например, повторить сбор, используя различные методы или попытаться вручную собрать больше частиц, чтобы помочь методам учиться на них. Во время 2D-классификации, если только несколько классов хороши, подумайте также о том, чтобы повторить процесс комплектации. При первоначальной оценке объема попробуйте использовать несколько методов, если некоторые из них дали неточные результаты. То же самое относится и к 3D-уточнению. Следуя этим рассуждениям, в этой рукописи было представлено несколько инструментов консенсуса, которые могут быть очень полезны, чтобы избежать проблем и продолжить обработку с точными данными. Благодаря использованию консенсуса между несколькими методами мы можем отбрасывать данные, которые трудно выбрать, классифицировать, выровнять и т. Д., Что, вероятно, является показателем плохих данных. Однако, если несколько методов способны согласовать в сгенерированном выводе, вероятно, эти данные содержат ценную информацию, с помощью которой можно продолжить обработку.

Мы рекомендуем читателю загрузить больше наборов данных и попытаться обработать их в соответствии с рекомендациями, представленными в этой рукописи, и создать аналогичный рабочий процесс, объединяющий пакеты обработки с помощью Scipion. Попытка обработать набор данных — лучший способ изучить возможности инструментов обработки, доступных в современном состоянии в Cryo-EM, узнать лучшие правила для преодоления возможных недостатков, возникающих во время обработки, и повысить производительность доступных методов в каждом конкретном тестовом случае.

Рисунок 1. Результат выравнивания ролика. (a) Главное окно результатов со списком всех сгенерированных микроснимков и дополнительной информацией: плотность спектра мощности, траектория расчетного выравнивания в полярных координатах, то же самое в декартовых координатах, имя файла сгенерированной микрофотографии. b) траектория выравнивания, представленная в декартовых координатах. c) полученная микрофотография. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2. Оценка CTF с результатом Ctffind. Главное окно с результатами включает в себя рисунок с оценочным PSD (в углу) вместе с PSD, исходящим из данных, и несколько параметров расфокусировки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3. Ручной подбор окон с помощью Xmipp. а) главное окно со списком микрофотографий для обработки и некоторыми другими параметрами. b) ручной отбор частиц внутри области микрофотографии. (c) и (d) Автоматический отбор частиц для наблюдения для создания набора обучающих частиц для метода автоматического отбора Xmipp. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4. Глубокий консенсусный выбор с результатом Xmipp. Параметр zScoreDeepLearning придает вес полезности частицы и является ключом к обнаружению плохих частиц. (a) Самые низкие значения zScores связаны с артефактами. b) Самые высокие zScores связаны с частицами, содержащими макромолекулу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5. 2D классификация с результатом Cryosparc. Показаны сгенерированные классы (средние подмножеств частиц, поступающих из одной ориентации). Несколько хороших классов, выбранных красным цветом (с некоторым уровнем детализации) и некоторые плохие классы, не выбранные (шумные и невведенные классы). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6. 3D начальный объем с результатом консенсуса роя. Представление 3D начального объема, полученного после запуска инструмента консенсуса xmipp3 - swarm consensus, используя предыдущие 3D начальные оценки объема Xmipp и Relion. а) объем представлен срезами. b) 3D-визуализация объема. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 7. Доработка начального 3D объема с результатом Relion. а) полученная кривая FSC, пересекающая пороговое значение 4,5Å, приблизительно. b) Угловое покрытие, показанное как вид сверху 3D-сферы. В этом случае, поскольку симметрии нет, назначенные частицы должны охватывать всю сферу. c) Рафинированный объем, представленный срезами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 8. 3D-выравнивание на основе глубокого обучения с результатом Xmipp. Результаты, генерируемые xmipp3 - метод глубокого выравнивания для 3D выравнивания. а) угловое назначение для каждой частицы в виде матрицы преобразования. b) угловой охват. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 9. Результат консенсуса 3D выравнивания. а) Перечень частиц с полученными различиями в параметрах сдвига и углов. b) График угловых разностей на частицу. с) График разницы сдвигов на частицу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 10. Окончательная итерация результата 3D-уточнения. а) Кривая КФУ. b) полученный объем при полном разрешении по срезам. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 11. Анализ локального разрешения с результатом Xmipp. Результаты метода xmipp3 - локальные MonoRes. а) некоторые репрезентативные срезы, окрашенные значением разрешения на воксель, как указано в цветовом коде. b) Гистограмма местного разрешения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 12. Резкость с результатом Xmipp. Результаты xmipp3 - метода локальной заточки. (a) Список полученных томов по итерациям. (b) 3D-объем, полученный после последней итерации, представленный срезами. c) 3D-представление окончательного тома. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 13. Проверка перенастройки инструмента в результате Xmipp. Результаты xmipp3 - валидация перенастройки. Зеленая линия соответствует реконструкции по данным, красная линия по шуму. а) обратное квадратичное разрешение с логарифмом числа частиц. b) Разрешение с указанием числа частиц. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 14. Несколько 3D представлений полученного объема. а) предварительно обработанный объем. b) объем после обработки. c) Локальное разрешение, темно-синие воксели - это воксели с более высоким разрешением (2,75Å), а темно-красные воксели - с более низким разрешением (10,05Å). d) Увеличить объем после обработки, в котором можно увидеть альфа-спираль (красный овал). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 15. Пример плохой 3D реконструкции. а) кривая FSC с резким падением и пересечением порогового значения при низком разрешении. b) Гистограмма местного разрешения. c) 3D-объем по срезам. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 16. Пример 2D классов. а) Хорошие классы, демонстрирующие определенный уровень детализации. (b) Плохие классы, содержащие шум и артефакты (верхняя часть получена с помощью Xmipp, нижняя с CryoSparc). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 17. Пример 3D начального объема с различными качествами. а) хороший начальный объем, при котором может наблюдаться форма макромолекулы. b) плохой начальный объем, когда полученная форма полностью отличается от ожидаемой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный рисунок 1. Создание проекта Scipion. Окно, отображаемое Scipion, где можно выбрать старый проект или создать новый, указав имя и местоположение для этого проекта. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 2. Метод импорта фильмов. Окно, отображаемое Scipion, когда pwem - импорт фильмов открыт. Здесь должны быть включены основные параметры сбора, чтобы фильмы, доступные для обработки в Scipion. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 3. Метод выравнивания ролика. Окно, отображаемое Scipion при использовании xmipp3 - оптического выравнивания . Входные фильмы, диапазон кадров, рассматриваемых для выравнивания, и некоторые другие параметры для обработки фильмов должны быть заполнены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 4. Метод оценки CTF с ctffind. Форма в Scipion со всеми необходимыми полями для запуска программы Ctffind. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 5. Волшебник в Сципионе. Мастер, помогающий пользователю заполнять некоторые параметры в форме. В этом случае мастер должен заполнить поле разрешения в методе grigoriefflab - ctffind . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 6. Метод уточнения CTF с помощью Xmipp. Форма xmipp3 - ctf оценка со всеми параметрами для уточнения ранее оцененного CTF. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 7. Метод препроцессирования микрофотографий. Форма xmipp3 - препроцесс микрофотографии , что позволяет проводить над ними некоторые операции. В этом примере полезно удалить плохие пиксели и микроснимки Downsample . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 8. Метод комплектации с помощью Криоло. Форма для запуска метода комплектации Cryolo с использованием предварительно обученной сети. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 9. Метод выбора консенсуса с помощью Xmipp. Форма xmipp3 - глубокий консенсусный отбор , основанный на глубоком обучении для вычисления консенсуса координат, с использованием предварительно обученной сети по нескольким наборам координат, полученных с помощью различных методов подбора. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 10. Метод извлечения частиц. Вкладки ввода и препроцессирования xmipp3 - извлечение частиц. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 11.3D метод начального объема с помощью Xmipp. Форма метода xmipp3 - реконструкция значимой для получения исходной 3D карты. Отобразятся вкладки Ввод и Критерии . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 12. Метод изменения размера тома. Форма для обрезки или изменения размера тома. В этом примере этот метод используется для генерации полноразмерного тома после xmipp3 - reconstruct significant. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 13.3D начальный объем с результатом Relion. Вид полученного 3D начального объема с релионом - методом 3D начальной модели по срезам. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 14. Доработка начального тома с помощью Relion. Форма метода relion - 3D автопереработка. В этом примере он был использован для уточнения первоначального объема, оцененного после достижения консенсуса. Отображаются вкладки Входные и справочные 3D-карты . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 15.3D метод классификации. Форма релиона - 3D классификация. Отображаются вкладки Ввод, Эталонная 3D-карта и Оптимизация . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 16.3D выравнивание на основе метода глубокого обучения. Форма открыта для метода xmipp3 - глубокое выравнивание. Здесь необходимо обучить сеть с обучающим набором, тогда эта сеть будет предсказывать угловое назначение на частицу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 17.3D метод уточнения. Форма xmipp3 - метод хайрес . Отображаются вкладки Ввод и Угловое назначение . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 18. Первая итерация результата 3D уточнения. а) Кривая КФУ. b) полученный объем (меньшего размера, чем полное разрешение), представленный в виде срезов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 19. Первая итерация корреляционного анализа 3D уточнения. Новое окно появляется при нажатии на значок панели в верхней части окна со списком частиц. В окне График столбцов можно создать гистограмму нужного расчетного параметра. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 20. Инструмент проверки перенастройки. Форма xmipp3 - метод проверки перенастройки . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

В настоящее время крио-ЭМ является ключевым инструментом для выявления 3D-структуры биологических образцов. При сборе хороших данных с помощью микроскопа имеющиеся инструменты обработки позволят получить 3D-реконструкцию исследуемой макромолекулы. Крио-ЭМ обработка данных способна достичь почти атомного разрешения, что является ключом к пониманию функционального поведения макромолекулы, а также имеет решающее значение в открытии лекарств.

Scipion - это программное обеспечение, которое позволяет создать весь рабочий процесс, объединяющий наиболее релевантные пакеты обработки изображений интегративным образом, что помогает прослеживаемости и воспроизводимости всего рабочего процесса обработки изображений. Scipion предоставляет очень полный набор инструментов для проведения обработки; однако получение реконструкций с высоким разрешением полностью зависит от качества полученных данных и способа их обработки.

Чтобы получить 3D-реконструкцию с высоким разрешением, первым требованием является получение хороших фильмов из микроскопа, которые сохраняют структурную информацию до высокого разрешения. Если это не так, рабочий процесс не сможет извлекать информацию высокой четкости из данных. Затем успешный рабочий процесс обработки должен иметь возможность извлекать частицы, которые действительно соответствуют структуре, и находить ориентации этих частиц в 3D-пространстве. Если какой-либо из шагов рабочего процесса завершится ошибкой, качество восстановленного тома будет ухудшаться. Scipion позволяет использовать различные пакеты на любом из этапов обработки, что помогает найти наиболее адекватный подход к обработке данных. Кроме того, благодаря наличию большого количества пакетов, можно использовать инструменты консенсуса, которые повышают точность, находя согласие в предполагаемых результатах различных методов. Кроме того, в разделе «Репрезентативные результаты» подробно обсуждаются несколько инструментов проверки и способы выявления точных и неточных результатов на каждом этапе рабочего процесса, выявления потенциальных проблем и способов их решения. Вдоль протокола есть несколько контрольных точек, которые могут помочь понять, работает ли протокол правильно или нет. Некоторые из наиболее актуальных: комплектация, 2D-классификация, первоначальная оценка объема и 3D-выравнивание. Проверка входных данных, повторение шага с помощью другого метода или использование консенсуса — это варианты, доступные в Scipion, которые пользователь может использовать для поиска решений при возникновении проблем.

Что касается предыдущих подходов к интеграции пакетов в области Cryo-EM, ^Appion31 является единственным, который позволяет реально интегрировать различные программные пакеты. Однако Appion тесно связан с ^Leginon32, системой автоматизированного сбора изображений с электронных микроскопов. Основное отличие от Scipion заключается в том, что модель данных и хранилище менее связаны. Таким образом, чтобы создать новый протокол в Scipion, нужно разработать только скрипт Python. Однако в Appion разработчик должен написать сценарий и изменить базовую базу данных. Таким образом, Scipion был разработан для упрощения обслуживания и расширяемости.

В этой рукописи мы представили полный рабочий процесс для обработки Cryo-EM, используя реальный набор данных Plasmodium falciparum 80S Ribosome (запись EMPIAR: 10028, запись EMDB: 2660). Этапы, рассмотренные и обсуждаемые здесь, могут быть обобщены как выравнивание фильма, оценка CTF, выбор частиц, 2D-классификация, первоначальная оценка карты, 3D-классификация, 3D-уточнение, оценка и постобработка. Были использованы различные пакеты, и на нескольких из этих шагов были применены инструменты консенсуса. Окончательный 3D-реконструированный объем достиг разрешения 3 Å, и в постобработанном объеме можно выделить некоторые вторичные структуры, такие как альфа-спирали, что помогает описать, как атомы расположены в пространстве.

Рабочий процесс, представленный в этой рукописи, показывает, как Scipion может быть использован для объединения различных пакетов Cryo-EM простым и интегративным способом, чтобы упростить обработку и одновременно получить более надежный результат.

В будущем разработка новых методов и пакетов будет продолжать расти, а программное обеспечение, такое как Scipion, для легкой интеграции всех из них будет еще более важным для исследователей. Консенсусные подходы будут более актуальными уже тогда, когда будет доступно множество методов с различной базой, помогающих получить более точные оценки всех параметров, задействованных в процессе реконструкции в Крио-ЭМ. Отслеживание и воспроизводимость являются ключевыми в исследовательском процессе и их легче достичь с помощью Scipion благодаря наличию общей структуры для выполнения полных рабочих процессов.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
no material is used in this article	-	-	-