باستخدام صبغة الفلورسنت، رودامين B، لدراسة القدرة التنافسية التزاوج في الذكور Aedes aegypti البعوض

Summary

هنا، نقدم بروتوكولا لدراسة القدرة التنافسية التزاوج من الذكور Aedes aegypti باستخدام صبغة الفلورسنت كعلامة. وتتعرض البعوض الإناث للذكور على حد سواء ملحوظ وغير ملحوظ لcopulation. بعد التزاوج ، يتم فحص الحيوانات المنوية تحت المجهر الفلوري لتحديد شريكهم في التزاوج.

Abstract

يعتمد نجاح برامج قمع السكان العقيمة أو غير المتوافقة القائمة على تقنية الحشرات على قدرة الذكور المفرج عنهم على التنافس على الإناث من النوع البري والحث على العقم في السكان المستهدفين. ومن ثم، فإن التقييم المختبري للقدرة التنافسية للتزاوج بين الذكور أمر ضروري لتقييم لياقة سلالة الإطلاق قبل الإطلاق الميداني. تقليديا، يتم إجراء مثل هذا الفحص عن طريق تحديد نسبة البيض قابلة للحياة التي تنتجها الإناث بعد التعرض في وقت واحد لمجموعتين من الذكور (البرية من نوع وسلالات الإفراج) لcopulation. ومع ذلك، هذه العملية تستغرق وقتا طويلا وشاقة بسبب الحاجة إلى تغذية الدم أولا الإناث لإنتاج البيض ومن ثم يفقس وعدد البيض فقست لتحديد صلاحية البيض.

وعلاوة على ذلك، لا يمكن لهذه الطريقة أن تميز درجة القدرة التنافسية بين خطين معقمين أو مصابين بالبعوض من وولباشيالأن البعوض الأنثوي البري لن ينتج بويضات غير قابلة للحياة إلا عند التزاوج مع كليهما. للتحايل على هذه القيود، تصف هذه الورقة طريقة أكثر مباشرة لقياس القدرة التنافسية لتزاوج البعوض الذكور في البيئات المختبرية باستخدام صبغة الفلورسنت، رودامين B (RhB)، والتي يمكن استخدامها لوضع علامة على الذكور عن طريق إطعامهم في محلول السكروز الذي يحتوي على RhB. بعد فحص التزاوج ، يمكن استخدام وجود منوية مفلورة في الحيوانات المنوية للأنثى لتحديد شريكها في التزاوج. هذه الطريقة فعالة من حيث التكلفة، ويقلل من الوقت التجريبي بنسبة 90٪ ويسمح مقارنة اللياقة البدنية التزاوج بين اثنين من خطوط عقيمة أو وولباشياالمصابة.

Introduction

ويجري حاليا تقييم تربية وإطلاق الذكور العقيمة أو غير المتوافقة لقمع مجموعات البعوض الزاعجة في هذا المجال كأداة جديدة لمنع تفشي حمى الضنك وغيرها من الأمراض المنقولة بالزاعجة¹. استراتيجيات قمع إطلاق الذكور التي هي حاليا في التجارب الميدانية تشمل استخدام الطريقة الوراثية²، التشعيع (تقنية الحشرات العقيمة ، SIT)³، البكتيريا التكافلية وولباشيا (تقنية الحشرات غير المتوافقة ، IIT)⁴، أو مزيج من التقنيتين الأخيرتين^5،6. ويعتمد نجاح هذه النهج إلى حد كبير على قدرة الذكور المفرج عنهم على ال تفوق الذكور من النوع البري والبحث عن الإناث لتأمين الجماع. وإلا، لا يمكن أن يحدث العقم في السكان المستهدفين.

في برنامج SIT الكلاسيكي ، على سبيل المثال ، قد تتأثر لياقة التزاوج الذكوري بعوامل مثل جرعة الإشعاع^7و8و 9 و بروتوكول^تربيةجماعي ومدى التكاثر الداخلي في المستعمرة^{10و11و12و13و14}. وعلاوة على ذلك، قد توفر الدراسات المتعلقة بالقدرة التنافسية للتزاوج معرفة هامة بشأن سلوك تزاوج البعوض الذي يمكن استخدامه لإثراء استراتيجيات مكافحة ناقلات الأمراض.

في SIT و IIT ، يتم تقييم القدرة التنافسية للتزاوج بين البعوض الذكور عادة من خلال السماح لكل من سلالة البرية والإطلاق بالمنافسة على الإناث البرية في قفص^{8و11و15و16}. ثم يتم تغذية الإناث بالدم وتفقس بيضهن لتحديد الجدوى. ويفترض أن الإناث اللاتي يضعن بيضا أو بيضا غير قابل للحياة بمعدل فقس منخفض قد تزاوجن مع ذكور سلالة الإطلاق، في حين يفترض أن الإناث اللاتي ينتجن بيضا قابلا للحياة قد تزاوجن مع ذكور من النوع البري. ثم يتم حساب القدرة التنافسية التزاوج مع مؤشر المقلية¹⁷. لسوء الحظ ، فإن هذه الطريقة كثيفة الموارد وتستغرق وقتا طويلا ، ويمكن أن يتأثر مؤشر Fried العام بعوامل الخلط الخارجية التي تؤثر على صلاحية البيض مثل سوء التعامل مع البيض والإفراط في الجفاف يمكن أن يؤدي إلى انخفاض معدل الفتحة في صليب التوافق الذي قد يؤدي بعد ذلك إلى مؤشر مقلي منخفض بشكل مصطنع.

وعلاوة على ذلك، فإن هذه الطريقة لا تسمح بالمقارنة المباشرة بين القدرة التنافسية للتزاوج بين بعوض الزاعجة المصاب بسلالات مختلفة من وولباشيا أو التي تتعرض لجرعات مختلفة من الإشعاع. ومن ثم، يلزم استخدام طريقة مباشرة أكثر للتصدي لهذه التحديات. وقد أظهرت الدراسات الحديثة^18،19 فعالية استخدام صبغة الفلورسنت ، RhB ، للاحتفال السائل المنوي للبعوض الذكور. يتم نقل السائل المنوي المميز وتخزينه في الحيوانات المنوية للبعوض الأنثوي عند التزاوج الناجح ، مما يسمح بالقياس المباشر لتفاعل التزاوج الأنثوي مع الذكور المميزين. رودامين B هو صبغة الفلورون التفاعلية ثيول تستخدم عادة كعلامة بيولوجية لدراسات البحوث الإيكولوجية والسلوكية في الحيوانات بما في ذلك الحشرات20. لدراسات البعوض، يتم إدخال RhB عن طريق التغذية بالسكر أو العسل الذي يحتوي على مسحوق RhB المذاب^{18،19،21،22،23،24}. عند الإقبال ، ترتبط صبغة RhB بالبروتينات ، وتلطخ أنسجة الجسم ببقعة وردية حمراء تفلور البرتقال الساطع تحت مصدر ضوء فلوري.

تسمح الإشارة الفلورية القوية واستقرار الوسم ، إلى جانب قدرته على وصم السوائل المنوية الحشرية ، بمراقبة نقل السائل المنوي المميز من الذكر المسمى إلى أعضاء تخزين الحيوانات المنوية للحشرة الأنثوية لدراسات التزاوج^{18و19و21و24}. استخدام RhB في اختبار القدرة التنافسية التزاوج الذكور لا يسمح فقط قياس مباشر للتفاعل التزاوج من الإناث مع الذكور إما ملحوظ وغير ملحوظ، ولكن يمكن أيضا الحصول على النتائج في غضون 24 ساعة لأنها تتجنب عملية تحديد صلاحية البيض، والتي تتطلب عادة حوالي 10 إلى 14 يوما. وعلاوة على ذلك ، تتغلب هذه الطريقة على الخسارة المحتملة للبيانات عندما لا تتغذى البعوض الأنثوية على الدم أو تموت قبل التمثيل. وهذا أمر بالغ الأهمية لأنه في التجارب شبه الميدانية، حيث تكون البعوضات عرضة للتلف والموت أثناء جمع ما بعد التزاوج باستخدام حقيبة ظهر أو متنفس ميكانيكي. لمعالجة القيود الحالية لاستخدام خصوبة الإناث نقدم طريقة بديلة تستخدم تلطيخ RhB لقياس القدرة التنافسية لتزاوج البعوض الذكور بشكل مباشر. وتبسط هذه الطريقة سير العمل، وتقصير الوقت التجريبي من حوالي أسبوعين إلى يوم واحد، مما يسمح بإجراء المزيد من النسخ التجريبية ويسمح بإجراء مقارنة بين سلالتي إطلاق. وسيكون هذا البروتوكول مناسبا للمختبرات التي تشرع في برامج قمع أعداد البعوض القائمة على إطلاق البعوض، ويمكن استخدامه في مراقبة الجودة الروتينية وتقييم السلالات.

Protocol

1. تربية البعوض

1. إجراء جميع تربية البعوض وتقيس القدرة التنافسية للتزاوج الذكور في ظل ظروف حشرية قياسية من 27 ± 1 درجة مئوية والرطوبة النسبية 75-80٪، مع فوتوبرود من 12 ساعة: 12 ساعة ضوء: دورات الظلام.
2. تعيين مجموعتين من الذكور المتنافسة على النحو المحدد A ومجموعة B لتسهيل الرجوع إليها في المنهجية الموصوفة في هذه الورقة. تربية البعوض في ظل ظروف موحدة لضمان مقارنة عادلة لياقتهم البدنية أثناء الفحص. تربية البعوض في كثافة يرقات 500 يرقة في 2 لتر من الماء وإطعامهم بمسحوق طعام السمك المطحون libitum.
   ملاحظة: لتوليد النتائج التمثيلية، كانت المجموعة A و Set B هي الذكور الأصيلين والمعبرين من Ae المصابة ب Wolbachia. Aegypti، على التوالي.
3. الجنس الذكور والإناث البعوض في مرحلة pupal، وتحتوي عليها بشكل منفصل في أقفاص (انظر جدول المواد)من أبعاد W 32.5 سم × D 32.5 سم × H 32.5 سم، مع حجم شبكة من 150 × 150 وفتحة 160 ميكرومتر. الحفاظ على جميع البعوض البالغ مع محلول السكروز 10٪.

2. إعداد البعوض الذكور والإناث

1. الجنس البعوض الذكور والإناث في مرحلة pupal وفقا لاختلافات حجمها (الخوادر الذكور يجري أصغر من الإناث pupae) (الشكل 1).
2. لكل مجموعة من البعوض (مجموعة A أو مجموعة B)، نقل 100 من الجراء الذكور كل في قفص prelabelled لتغذية السكروز أو RhB-السكروز التغذية.
3. وضع الخوادر الإناث في دفعات صغيرة من 40-50 لكل قفص. عند ظهور imagoes ، تحقق من الأقفاص لوجود البعوض الذكور.
   ملاحظة: البعوض الذكور البالغين أصغر من الإناث ولها هوائيات أكثر شجيرات وشعرا(الشكل 2). استخدام البعوض الإناث العذراء فقط لارساء القدرة التنافسية التزاوج. إن استخدام الإناث قبل تلقيحهن سيجعل جميع البيانات الناتجة غير صالحة. وهكذا، يجب توخي الحذر الشديد أثناء ممارسة الجنس في مرحلة الخوادر. لا تستخدم البعوض الأنثوي من قفص ملوث بالبعوض الذكوري. وينبغي إعداد أقفاص إضافية من الإناث.

3. إعداد 0.2٪ RhB - محلول السكروز

ملاحظة: RhB هو مسحوق أخضر في شكل جاف والوردي المحمر في الحل. يجب ارتداء معدات الحماية الشخصية القياسية (PPE: ثوب حماية المختبر ، قفازات النتريل ، وحماية العين) عند التعامل مع هذه المادة الكيميائية. لتجنب الاستنشاق، وزن مسحوق RHB في غطاء الدخان.

1. لإعداد محلول 0.2٪ ث / v RhB-السكروز، حل 200 ملغ من مسحوق RhB لكل 100 مل من محلول 10٪ ث / v / السكروز. تخلط جيدا لضمان حل كل مسحوق.
   ملاحظة: بما أن RhB حساس للضوء، استخدم زجاجات العنبر، أو قم بتغليف زجاجات واضحة تماما مع رقائق الألومنيوم.

4. تغذية البعوض الذكور

ملاحظة: يتم تقديم البيانات من التغذية RhB-السكروز الأمثل في المواد التكميلية، القسم 1.

1. إعداد 20 زجاجة تغذية السكر مع الفتيل. إضافة 10 مل من السكروز 10٪ في 10 زجاجات التغذية و 10 مل من محلول RhB-sucrose 0.2٪ في زجاجات التغذية الأخرى 10 (استخدام زجاجات العنبر، أو التفاف الزجاجات في رقائق الألومنيوم).
2. ضع زجاجات التغذية في أقفاص الذكور المعنية (5 زجاجات لكل قفص) المعدة في الخطوتين 2.2 و 2.3. السماح للبعوض الذكور لإطعام لمدة ثلاثة أيام قبل تجربة التزاوج.

5. التحقق من وجود مضان RhB في البعوض الذكور

1. أسبيرات RhB-السكروز تغذية البعوض الذكور، ومراقبتها تحت المجهر ستيريو مضان لضمان أن جميع البعوض الذكور RhB-السكروز التي تغذيها قد تم وضع علامة بنجاح مع RhB.
2. قم بتشغيل مصباح موقد الزئبق والمجهر الاستريو. السماح لمصدر الضوء للمصباح الموقد الزئبق لتحقيق الاستقرار لمدة 10 دقيقة. تعيين مرشحات مضان للبروتين مضان أحمر 1 (RFP1) (الطول الموجي الإثارة 540 نانومتر، الطول الموجي للانبعاثات 625 نانومتر).
3. يستنشق عددا صغيرا من البعوض (أربعة أو خمسة) في وقت واحد في الأنبوب الزجاجي للطامحين الفمويين. من خلال الأنبوب الزجاجي ، لاحظ جسم البعوض الذكر تحت المجهر ستيريو مضان. استبعاد البعوض الذكور غير ملحوظ مع RhB من التجربة.
   ملاحظة: سوف تظهر بطن البعوض الذكور ملحوظ مع RhB الوردي تحت الضوء الأبيض (الشكل 3A) وتوهج برتقالي مشرق تحت ضوء الفلورسنت (الشكل 3B).
4. نقل مجموعة البعوض الذكور في 12 أكواب الورق المضمون مع المعاوضة (حجم شبكة 150 × 150، 160 فتحة ميكرومتر)؛ 6 أكواب لكل منها 10 بعوض ذكور يتغذى على السكروز و6 أكواب أخرى لكل منها 10 بعوض ذكور يتغذى على RhB-sucrose. كرر هذه الخطوة للبعوض الذكور تعيين B.

6. التزاوج القدرة التنافسية المقايسة

1. إعداد 12 W 60 سم × D 60 سم × H 60 سم أقفاص مع حجم شبكة 44 × 32، 650 ميكرومتر الفتحة للتزاوج. في كل من الأقفاص الستة ، تشمل 10 بعوض ذكوري من المجموعة A (علامة RhB) ، و 10 بعوض ذكوري من النوع B (غير ملحوظ) ، و 10 بعوضة أنثى برية عذراء. وفي الأقفاص الستة الأخرى، تشمل 10 بعوض ذكوري من المجموعة ألف (غير المعلمة)، و10 بعوض ذكوري من النوع باء (ملحوظ بعلامة RhB)، و10 بعوضات إناث برية عذراء. تسمية هذه الأقفاص للتمييز بوضوح بين الجمع بين اثنين من التزاوج.
   ملاحظة: بناء على الخبرة، تم استخدام قفص 60 سم × 60 سم × 60 سم لإجراء فحص التزاوج حيث أن القفص الأصغر قد يشجع التزاوج المختلط.
2. ضع أكواب الذكور المعنية المعدة في الخطوة 5.4 في أقفاص التزاوج وفقا للتسمية في الخطوة 6.1. إزالة المعاوضة والاستفادة بلطف من الكأس لتزاحم الذكور للخروج من الكأس. قم بإزالة الكوب الورقي والمعاوضة بعناية من القفص لضمان عدم هروب البعوض من القفص. السماح للبعوض الذكور بالتأقلم في قفص التزاوج لمدة ساعة على الأقل.
3. باستخدام جهاز التنفس الفموي ، قم بنقل البعوض الأنثوي البري البكر إلى 12 كوبا ورقيا ، مع احتواء كل كوب على 10 بعوض.
4. بعد فترة التأقلم للبعوض الذكور ، نقل كوب واحد من الإناث في كل قفص التزاوج وإزالة المعاوضة. تزاحم بلطف الكأس لتشجيع أي البعوض الإناث المتبقية للخروج من الكأس. قم بإزالة الكوب الورقي والمعاوضة بعناية من القفص لضمان عدم هروب البعوض من القفص.
5. السماح للتزاوج أن يحدث لمدة 3 ساعة.
   ملاحظة: تم تحديد مدة التزاوج الموصى بها من خلال الملاحظات المسبقة من نوع البرية Ae. aegypti. في التجارب التي شملت 10 إناث و 20 من الذكور محتجزين في قفص 60 سم × 60 سم × 60 سم ، تم تحقيق 90٪ من التلقيح الأنثوي في 3 ح (المواد التكميلية ، القسم 2). لا تزعج القفص خلال هذه الفترة حيث يمكن أن يؤدي الهياج إلى تزاوج متقطع ومختلط. التزاوج المختلط (حيث تزاوجت الأنثى مع كل من الذكور ملحوظ وغير ملحوظ) يؤدي إلى التحيز نحو الذكور RhB ملحوظ كما أنه من الصعب التمييز بين الحيوانات المنوية التي لا تحمل علامات من الحيوانات المنوية RhB ملحوظ تحت المجهر الفلوري.
6. لإنهاء تجربة التزاوج ، قم بإزالة جميع البعوض من كل قفص باستخدام جهاز التنفس الميكانيكي. تخدير بارد للبعوض على الجليد لمدة 5 دقائق على الأقل. عندما يتم تخدير البعوض بالكامل ، التقط البعوض الأنثوي بلطف واؤوه في كوب ورق منفصل مؤمن بالمعاوضة (حجم الشبكة 150 × 150 ، فتحة 160 ميكرومتر). تسمية كوب الورق عن طريق نقل التسمية المعنية من قفص التزاوج على كوب من الورق.
   ملاحظة: من الممكن إيقاف التجربة مؤقتا عند هذه النقطة والحفاظ على الإناث مع محلول السكروز بنسبة 10٪. سيبقى السائل المنوي الذي يحمل علامة RhB مستقرا داخل الحيوانات المنوية الأنثوية لمدة أسبوع على الأقل. فمن الأفضل للحفاظ على الإناث على قيد الحياة قبل تشريح كما عينات ميتة ومجففة من الصعب تشريح.
7. لتسجيل الحيوانات المنوية الإناث، التخدير البارد البعوض الإناث على الجليد لمدة 5 دقائق على الأقل قبل تشريح تحت مجهر ستيريو(فيديو 1). فحص الحيوانات المنوية تحت المجهر ضوء مركب (التكبير 100x) لحالة التلقيح بهم(الشكل 4). بالنسبة للأفراد الذين تم تلقيحهم، حدد ما إذا كانت الحيوانات المنوية تحتوي على سائل أساسي يحمل علامة RhB من خلال فحصها تحت المجهر الاستريو الفلوري المجهز بتصفية RFP1 ونظام تصوير الكاميرا.
   ملاحظة: عند استخدام مجهر ستيريو مضان مع نظام تصوير متصل، يوصى باستخدام وقت التعرض المطول (5 s) لزيادة حساسية الكشف. إذا تزاوج البعوض الإناث مع ذكر ملحوظ، فإن الحيوانات المنوية لها فلوريس برتقالي مشرق(الشكل 5A). ومع ذلك ، إذا تزاوج البعوض الأنثوي مع ذكر غير معلم ، فلن تفلور الحيوانات المنوية التي تم تلقيحها(الشكل 5B).

7. التخلص من نفايات RhB

1. معالجة النفايات RhB مائي مع الكربون المنشط²⁵ قبل تصريفها كماء الصرف الصحي العام. التخلص من النفايات RHB الصلبة (البعوض ملحوظ مع RhB، والمناشف الورقية، والفتيل غارقة مع RhB) والنفايات الكيميائية. دون معدات الوقاية الشخصية القياسية عند التعامل مع النفايات RHB.

النتائج

ث AlbB-SG هو محلي (سنغافورة) Ae. aegypti خط مصابة بشكل ثابت مع سلالة wAlbB من وولباشيا. باستخدام البروتوكول الموصوف في هذه الورقة ، قمنا بتقييم القدرة التنافسية للتزاوج الذكوري لخط أصيل ومعبر من wAlbB-SG لتحديد ما إذا كان التزاوج الداخلي يؤدي إلى خسارة في لياقة التزاوج بين الذكور. وقد تم الحفاظ على الخط الأصيل لمدة 11 جيلا في الحشرات ، في حين تم إنشاء الخط المتقاطع عن طريق عبور الإناث مع Ae الذكور من النوع البري. aegypti. وتنافس الذكور من خطوط أصيلة وعبرت ضد بعضها البعض للتزاوج مع البرية من نوع البرية من نوع أنثى Ae. aegypti. وأجري تقييم القدرة التنافسية للتزاوج في ثلاث نسخ.

وأشارت النتائج إلى أن RhB لم يؤثر على لياقة الذكور لأن بيانات التلقيح الأنثوي لم تكن متحيزة تجاه أو ضد التزاوج مع الذكور الذين تغذيهم RhB-sucrose (الجدول 1 والشكل 6) حيث أن RhB لا يؤثر على لياقة التزاوج للذكور ، ونمضي في تحليل البيانات استنادا إلى النسبة المئوية للإناث النهمات المتزاوجات إما بالخط الأصيل أو المتقاطع(الجدول 2 والشكل 7). وكانت النتيجة عبر ثلاثية تجريبية متسقة; كان هناك نسبة أعلى بكثير من الإناث تزاوج مع الذكور outcross مما كانت عليه مع الذكور الأصيلة في جميع التكرارات الثلاثة (P ≤ 0.05، مان ويتني يو-اختبار). تشير هذه النتائج إلى فقدان محتمل في لياقة التزاوج بين الذكور بعد عدة أجيال من التكاثر الداخلي في المختبر.

الشكل 1:منظر عرضي ذكر (يسار) وأنثى (يمين) Aedes aegypti pupae. في ظل ظروف التربية نفسها، يمكن ممارسة الجنس مع Ae. aegypti في مرحلة الجرو وفقا للحجم. الذكور أصغر بكثير من الإناث. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2:تمييز الذكور (يسار) والإناث (يمين) Aedes aegypti البالغين. البعوض الذكور البالغين (يسار) لديها هوائيات أكثر شجيرات وشعرا من الأنثى البالغة. تشير الأسهم الحمراء إلى الهوائيات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: رودامين ب وسم البعوض الذكور. (أ) المجهر الخفيف; (ب) مضان المجهر. البعوض على اليسار غير ملحوظ (يتغذى مع 10٪ ث / الخامس السكروز)، في حين يتم وضع علامة على واحد على اليمين (تغذية مع 0.2٪ RhB-السكروز). البعوض ملحوظ لها بطن وردي مرئي تحت الضوء الأبيض (البعوض على اليمين في A)،الذي فلورسيس برتقالي مشرق تحت المجهر الفلوري(B). أشرطة المقياس = 5 مم اختصار: RhB = رودامين B. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4:تلقيح وغير تلقيح الحيوانات المنوية الإناث تحت المجهر ضوء مركب (100x التكبير). يمكن تحديد حالة التلقيح للبعوضة الأنثوية من خلال مراقبة الحيوانات المنوية تحت المجهر الخفيف المركب. ستحتوي البعوضة الأنثوية الملثونة على ما لا يقل عن منوي مملوء واحد في حين أن جميع الحيوانات المنوية الثلاثة للبعوضة الأنثوية غير الملموسة ستكون فارغة. سوف تكون الحيوانات المنوية المتحركة الشبيهة بالخيط مرئية في الحيوانات المنوية المملوءة تحت مجهر ضوء مركب. مقياس الشريط = 100 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5:أنثى البعوض spermathecae تلقيح مع السوائل المنوية تحت المجهر ستيريو مضان. (أ) RhB ملحوظ و (ب) الحيوانات المنوية لا تحمل علامات تلقيح مع السوائل المنوية RhB ملحوظ سوف تفلور البرتقالي الساطع تحت المجهر مضان. أشرطة المقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6:عدد الإناث البرية من النوع الذي تلقيحه الذكور الأصيلة أو المتقاطعة في ثلاثيات تجريبية مع علامات متبادلة. (أ) تم وضع علامة على الذكور الأصيلين مع RhB في حين أن الذكور خارج العلامات. (ب) تم وضع علامة على الذكور خارج مع RhB في حين أن الذكور الأصيلة كانت غير ملحوظة. ولوحظ أن عددا أكبر من الإناث قد تزاوجن مع الذكور المتقاطعن بغض النظر عن وضع علاماتهن. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 7: نسبةالإناث المنقوصات المتزاوجات مع الذكور الأصيلين أو المتقاطعين في 3 نسخ تجريبية. لكل تكرار تجريبي ، هناك نسبة أعلى بكثير من الإناث تزاوج مع الذكور outcross (P ≤ 0.05 ، مان ويتني يواختبار). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

فيديو 1: تشريح أنثى Aedes aegypti لالحيوانات المنوية تحت المجهر ستيريو الخفيفة. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو. 

	♀ x إنبريد (RhB) ♂	♀ x أوتكروس (غير معلمة) ♂ ب	♀ x إينبريد (غير ملحوظ) ♂ ج	♀ x أوتكروس (RhB) ♂ د	المعدل العام للتلقيح (أ+ب+ج+د/120)
تكرار 1	11	35	7	40	77.5% (93/120)
نسخ متماثل 2	6	29	8	31	61.7% (74/120)
نسخ متماثل 3	6	36	6	33	67.5% (81/120)

الجدول 1: عدد الإناث المتزاوجات مع الذكور الأصيلين والمعبرين عن الإناث الذين يحملون علامة RhB وغير المعلمة wAlbB-Sg Aedes aegypti. واستخدم في كل نسخة متماثلة ما مجموعه 120 أنثى.

	النسبة المئوية للإناث اللائي تلقيحن
	الذكور الأصيلة	الذكور خارج كروس
تكرار 1	19% (18/93)	81% (75/93)
نسخ متماثل 2	19% (14/74)	81% (60/74)
نسخ متماثل 3	15% (12/81)	85% (69/81)

الجدول 2: النسبة المئوية للإناث المنقوصات المتزاوجات مع الذكور الأصيلين والكروسيد من الزاعجة المصرية.

الشكل التكميلي S1: مقارنة سير العمل لنسبة القدرة التنافسية التقليدية القائمة على RhB. بالمقارنة مع المقايسة التقليدية القدرة التنافسية التزاوج، وسير العمل مبسطة ومختصرة ل RhB القائم على التزاوج القدرة التنافسية المقايسة يقلل بشكل كبير من المدة التجريبية. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل التكميلي S2: منحنيات بقاء كابلان ماير للذكور البالغين Aedes aegypti أثناء وبعد التغذية بنسبة 0.2٪ و 0.4٪ رودامين B-تغذية السكروز. البقاء على قيد الحياة في المئة من (أ) الذكور من النوع البري و (ب) ثAlbB-Sg Ae. aegypti خلال وبعد ثلاثة أيام من التغذية على 0.2٪ و 0.4٪ RhB-sucrose، مقارنة بالضوابط التي تم تغذيتها بالسكوروز فقط. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الجدول التكميلي S1: معدل التلقيح للإناث في قفص W 60 سم × D 60 سم × H 60 سم (نسبة 10 إناث إلى 20 ذكرا) عند نقاط زمنية 1-و 2 و 3-h. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول. 

Discussion

يستخدم الوسم عادة في البحوث الحشرات لدراسة ديناميات السكان الحشرات، والتشتت، والسلوك، وبيولوجيا التزاوج²⁶. في برامج SIT و IIT ، يتم وضع علامات للتمييز بين سلالة الإطلاق من سكان الميدان لدراسة تشتتهم وتحسين نسبة الإطلاق. وتشمل طرق وضع العلامات المستخدمة وضع علامات وراثية^27،28، ودمج النظائر في أغذية اليرقات^29،30، غبار الفلورسنت³¹، وصبغ³². لقمع مجموعات البعوض باستخدام SIT أو IIT ، حيث اللياقة البدنية التزاوج الذكور هو عنصر حاسم ، وقد استخدمت الأصباغ الفلورية كعلامات لدراسة بيولوجيا التزاوج البعوض^18،19.

ومن الناحية التقليدية، تم تقييم القدرة التنافسية لتزاوج الذكور من سلالة الإطلاق باستخدام مقايسات خصوبة الإناث. ومع ذلك، فإن هذا المقايسة تستغرق وقتا طويلا وتستهلك الكثير من العمالة بسبب العمليات التجريبية في مرحلة ما بعد التزاوج(الشكل التكميلي S1). وتشمل هذه العمليات تغذية الدم للإناث، وجمع البيض، وتفقيس البيض، وعدد من نسبة البيض فقست لتحديد صلاحية البيض. وفي المتوسط، يتطلب هذا الفحص 30 ساعة عمل وإسبوعين من العمل التجريبي (بدءا من إنشاء أقفاص مقايسة القدرة التنافسية) إلى التحديد النهائي للقدرة التنافسية للتزاوج بين الذكور.

ورقته يعرض استخدام صبغة الفلورسنت، RhB، (تغذية 0.2٪ RhB-السكروز للبعوض، الشكل التكميلي S2) لقياس مباشرة التفاعلات التزاوج بين الإناث والذكور RhB- ملحوظ. في حين أن هذا البروتوكول يتطلب مجهر ستيريو مضان، فإنه يغني عن الحاجة إلى إجراء الإجراءات التجريبية التي تستغرق وقتا طويلا المذكورة أعلاه. في المتوسط، يتطلب هذا الفحص القائم على RhB ما يقرب من 10 ساعات عمل وحوالي يوم واحد للحصول على بيانات تعادل تلك الموجودة من مقايسات خصوبة الإناث. هذا >90٪ وفورات الوقت يسمح للباحثين لإجراء تكرارات تجريبية متعددة، وتوفير التحقق من صحة أكثر قوة من اللياقة البدنية التزاوج الذكور. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام هذا المقايسة لمقارنة القدرة التنافسية للتزاوج بين خطين معقمين أو البعوض المصاب بالوولباشيا.

وهذا النوع من المقارنة غير ممكن مع المقايسات التقليدية لخصوبة الإناث، لأن الإناث ينتجن بويضات غير قابلة للحياة عند التزاوج مع هذين الخطين.  على الرغم من ذلك ، فإن أي تزاوج مختلط في التجربة سيؤدي إلى التحيز تجاه السكان الملحوظين لأنه من الصعب تحديد الحيوانات المنوية التي لا تحمل علامات في الحيوانات المنوية الأنثوية التي تحتوي على السائل المنوي من الذكور الذين يتميزون ب RhB ولا تحمل علامات. وتوصلت دراسة لتقييم القدرة التنافسية للتزاوج بين أنوفيليس غامبيا باستخدام RhB¹⁸إلى استنتاج مماثل، حيث تبين أن نسبة أكبر من الإناث في فحص التزاوج تزاوجت من قبل ذكور ملحوظين. كما polyandry هو أكثر عرضة للحدوث في الإناث التي كانت قد شاركت سابقا في التزاوج توقف³³، تم تقليل احتمال حدوث ذلك في هذه الدراسة باستخدام عدد أقل من البعوض (20 من الذكور إلى 10 إناث) في حجم قفص أكبر (0.216 م³⁾في هذه التجارب.

ولم تظهر النتائج أي تحيز تجاه السكان الذين تميزهم نسبة ال RHB، مما يشير إلى أن التزاوج المختلط محدود. وباختصار، فإن إدماج RhB لوضع علامة على الذكور في اختبار القدرة التنافسية للتزاوج هو طريقة اقتصادية وسريعة لتقييم لياقة التزاوج بين الذكور. كما تسمح هذه الطريقة بالمقارنة المباشرة للتنافسية بين الذكور المعرضين لجرعات مختلفة من الإشعاع ، أو الذين تربوا في أنظمة تربية مختلفة ، أو المصابين بسلالات مختلفة من وولباشيا، مما يجعلها أداة قيمة لتقييم لياقة التزاوج الذكوري لأي برنامج لقمع البعوض القائم على إطلاق البعوض.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Compound light microscope	Olympus	CX23	To score for spermathecae insemination
Dissection forceps	Bioquip	Rubis forceps (4524)
Fluorescence stereo-light microscope with RFP1 filter	Olympus	SZX16	To check for Rhodamine B fluorescence signal
Mosquito cages	Bugdorm	4F3030	W 32.5 cm x D 32.5 cm x H 32.5 cm; mesh size of 150 x 150; 160 µm aperture For holding of male and female adult mosquitoes prior to mating assay
6M610	W 60 cm x D 60 cm x H 60 cm; mesh size of 44 x 32; 650 µm aperture For mating competitiveness assay
Mosquito netting			150 x 150, 160 µm aperture
Rhodamine B	Sigma Aldrich	R6626	≥95% (HPLC)
Stereo-light microscope	Olympus	SZ61	For spermathecae dissection
Sucrose	MP Biomedicals	SKU 029047138	Food grade
TetraMin tropical flakes	Tetra	77101	Fish food for feeding larvae