蛍光色素、ローダミンBを用いて、オス のアエデスアエジプティ 蚊の交配競争力を研究する

要約

ここでは、蛍光色素をマーカーとして用いた雄 のAedes aegypti の交配性を研究するためのプロトコルを提示する。雌の蚊は、交尾のためにマークされた男性と無印の両方の雄にさらされます。交配後、それらの精子は、交配パートナーを決定するために蛍光顕微鏡下で検査される。

要約

無菌または相容れない昆虫技術ベースの集団抑制プログラムの成功は、放出された男性が野生型のメスを競い合い、標的集団で不妊を誘発する能力に依存する。したがって、男性の交配競争力の実験室評価は、フィールドリリース前にリリース株の適性を評価するために不可欠です。従来、このようなアッセイは、雌が同時に2組の雄(野生型および放出株)に曝露された後に生じる生存卵の割合を決定することによって行われる。しかし、このプロセスは、最初に卵の生産のためにメスに血液を供給し、次に孵化卵を孵化させ、列挙して卵の生存率を決定する必要があるため、時間がかかり、面倒です。

さらに、この方法は、野生型の雌の蚊が両方と交配したときにのみ生存不可能な卵を産生するので、2つの無菌または ウォルバキア感染した蚊の間の競争力の程度を識別することはできません。これらの制限を回避するために、本論文は、RhBを含むスクロース溶液に供給することによって男性をマークするために使用できる蛍光色素、ローダミンB(RhB)を使用して実験室の設定で雄の蚊の交配競争力を測定するより直接的な方法を説明する。交配アッセイの後、女性の精子中の蛍光精子の存在は、彼女の交配パートナーを決定するために使用することができる。この方法は費用対効果が高く、実験時間を90%短縮し、2つの無菌または ウォルバキア感染ライン間の交配適性の比較を可能にする。

概要

Aedes蚊集団の抑制のための無菌または非適合性の雄の飼育および放出は、デング熱および他のAedes-媒介性疾患¹の発生を防ぐための新しいツールとして現在この分野で評価されている。現在試験中の男性放出抑制戦略は、遺伝的方法²の使用、放射線照射(滅菌昆虫技術、SIT)3、内生菌ウォルバキア(侵入不適合技術、IIT)4、または後者の2つの技術の組み合わせ^5、6を含む。これらのアプローチの成功は、野生型の男性を上回り、交尾を確保するために女性を求める解放された男性の能力に大きく依存しています。それ以外の場合、無菌は標的集団に誘導することができない。

古典的なSITプログラムでは、例えば、男性の交配適性は、照射線量^7、8、9、集団飼育プロトコル及びコロニー10、11、12、13、14における近親交配の程度などの要因の影響を受ける可能性がある。さらに、交配の競争力に関する研究は、ベクター制御戦略を知らせるために使用できる蚊の交配行動に関する重要な知識を提供するかもしれない。

SITおよびIITでは、オスの蚊の交配競争力は、典型的には、野生型と放出株の両方がケージ^{8、11、15、16}で野生型のメスを競うことを可能にすることによって評価される。その後、メスは血液を与えられ、卵は孵化して生存率を決定します。生存不可能な卵や孵化率の低い卵を産むメスは放出株オスと交配していると考えられ、生存可能な卵を産生する雌は野生型の雄と交配したと仮定される。交配の競争力は、揚げインデックス¹⁷で計算されます。残念ながら、この方法はリソースを消費し、時間がかかり、全体的なフライドインデックスは、卵の取り扱いが不十分で、過度の乾燥などの卵の生存率に影響を与える外部交配因子の影響を受ける可能性があり、その後、人工的に低いフライドインデックスにつながる可能性があります。

さらに、この方法は、ウォルバキアの異なる株に感染しているか、照射の異なる用量にさらされているAedes蚊間の交配競争力の直接比較を可能にしません。したがって、これらの課題に対処するには、より直接的な方法が必要です。最近の研究^18、19は、蛍光色素RhBを使用して雄の蚊の精液をマークする効果を実証している。マークされた精液は、交配が成功すると雌の蚊の精子に移され、保存され、マークされた男性との女性の交配相互作用を直接測定することができます。ローダミンBは、昆虫20を含む動物の生態学的および行動研究のためのバイオマーカーとして一般的に使用されるチオール反応性フルオロロン色素である。蚊の研究のために、RhBは溶解RhB粉末^{18、19、21、22、23、24}を含む砂糖または蜂蜜水^を供給することによって導入される。取り込み時に、RhB色素はタンパク質に結合し、蛍光光源の下で明るいオレンジ色を蛍光する赤みを帯びたピンクの染色で体組織を染色します。

マーキングの強い蛍光シグナルと安定性は、昆虫精液を染色する能力と相まって、交配研究^{18、19、21、24}のための女性昆虫の精子貯蔵器官への標識された精液の移動をモニタリングすることを可能にする。男性の交配競技アッセイでRhBを使用すると、マークされた男性と無印の男性との女性の交配相互作用を直接測定できるだけでなく、卵の生存率を決定するプロセスを排除するため、24時間以内に結果を得ることができます。さらに、この方法は、雌の蚊が卵子を動かす前に血液を与えたり死んだりしない場合のデータの潜在的な損失を克服する。これは、雌の蚊がバックパックや機械的吸引器を使用して交配後収集中に損傷を受け、死亡する傾向がある半フィールド試験では特に重要です。女性の生殖能力を使用する現在の制限に対処するために、我々は直接オスの蚊の交配の競争力を測定するためにRhB染色を使用する代替方法を提示します。この方法は、ワークフローを簡素化し、実験時間を約2週間から1日に短縮し、より多くの実験的複製を行うことを可能にし、2つのリリース株間の比較を可能にする。このプロトコルは、男性の放出ベースの蚊の個体数抑制プログラムに着手している実験室に適しており、定期的な品質管理とひずみの評価に使用することができます。

プロトコル

1. 蚊の飼育

1. 27±1 °Cおよび75-80%相対湿度の標準的な昆虫条件下ですべての蚊の飼育と男性の交配競争力アッセイを行い、光周期は12時間:12時間光:暗いサイクル。
2. 競合する 2 組の男性をセット A とセット B として指定し、このペーパーで説明する方法論で簡単に参照できます。標準化された条件下で蚊を飼育し、アッセイ中の適性を公正に比較します。2 Lの水の中で500匹の幼虫の幼虫密度で蚊を飼育し、挽いた魚の食品粉末 アドリビタムでそれらを供給します。
   注:代表的な結果の生成のために、セットAとセットBは ウォルバキアの近親およびアウトクロス男性でした - 感染 したAe。アエジプティ、それぞれ。
3. プパル段階でオスとメスの蚊をセックスし、サイズの寸法W 32.5 cm x D 32.5 cm x H 32.5 cmのケージ( 材料表を参照)に別々に含み、メッシュサイズは150 x 150と160 μmの開口部を持ちます。10%のスクロース溶液ですべての成虫の蚊を維持します。

2. オスとメスの蚊の調製

1. そのサイズの違いに応じて、プパル段階でオスとメスの蚊をセックスする(雄の子犬は雌の子犬より小さい)(図1)。
2. 蚊のセット(セットAまたはセットB)ごとに、100個のオスの子犬を、スクロース給餌またはRhB-sucrose給餌のために事前にラベル付けされたケージにそれぞれ移します。
3. ケージあたり40〜50の小さなバッチにメスの子犬を置きます。イマゴの出現時に、オスの蚊の存在がないかケージをチェックしてください。
   注:雄の雄の蚊は雌よりも小さく、ふさふさした毛状のアンテナを持っています(図2)。交配競争力アッセイには、処女雌の蚊のみを使用してください。授精前の女性を使用すると、結果として得られるすべてのデータが無効になります。したがって、極端な注意は、子犬の段階でセックス中に取られなければなりません。オスの蚊に汚染されたケージから雌の蚊を使用しないでください。女性の余分なケージを準備する必要があります。

3. 0.2% RhB - スクロース溶液の調製

注:RhBは乾燥した形の緑色の粉末で、溶液中の赤みを帯びたピンクです。標準的な個人用保護具(PPE:実験室保護ガウン、ニトリル手袋、および眼保護)は、この化学物質を取り扱う際に着用する必要があります。吸入を避けるために、ヒュームフードでRhB粉末の重量を量る。

1. 0.2%w/v RhB-sucrose溶液を調製するには、100 mLの100 mL毎に200mgのRhB粉末を溶解し、スクロース溶液を10%w/v/スクロース溶液にします。すべての粉末が溶解していることを確認するためによく混合します。
   注:RhBは光に敏感なので、アンバーボトルを使用するか、透明なボトルをアルミホイルで完全に包みます。

4. オスの蚊の餌

注: RhB-sucrose の供給最適化のデータは 補足資料、セクション 1に示されています。

1. 芯付きの20個の砂糖フィーダーボトルを準備します。10本のフィーダーボトルに10%のスクロース10mL、他の10本のフィーダーボトルに0.2%RhB-ショ糖溶液10mLを加えます(アンバーボトルを使用するか、ボトルをアルミホイルで包みます)。
2. ステップ2.2および2.3で準備したそれぞれのオスケージ(ケージあたり5本)にフィーダーボトルを入れます。オスの蚊が交配実験の前に3日間餌を与えることを許可する。

5. 雄の蚊の蛍光の検査

1. RhB-sucroseを供給した雄の蚊を吸引し、蛍光ステレオ顕微鏡で観察し、RhB-sucroseを供給されたすべての雄の蚊がRhBで正常にマークされていることを確認します。
2. 水銀バーナーランプとステレオ顕微鏡をオンにします。水銀バーナーランプの光源を10分間安定させます。赤色蛍光タンパク質1(RFP1)の蛍光フィルター(励起波長540nm、発光波長625nm)を設定します。
3. 口腔吸引器のガラス管に一度に少数の蚊(4または5)を吸引する。ガラス管を通して、蛍光ステレオ顕微鏡でオスの蚊の体を観察します。RhBでマークされていないオスの蚊を実験から除外します。
   注: RhB でマークされたオスの蚊の腹部は、白色光の下にピンク色に表示され(図3A)、蛍光灯下で明るいオレンジ色に輝きます(図3B)。
4. 移管セットAオスの蚊を12個の紙コップに入れ、網で固定(メッシュサイズ150 x 150、160 μm開口)それぞれ6カップに10個のショ糖を与えたオスの蚊と、他の6カップにそれぞれ10個のRhB-sucroseを与えたオスの蚊を入れた。セットBオスの蚊に対してこの手順を繰り返します。

6. 競争力の合体アッセイ

1. 12 W 60 cm x D 60 cm x H 60 cm ケージをメッシュサイズ 44 x 32,650 μm のアパーチャーで設定します。6つのケージのそれぞれに、10セットA(RhBマーク)オスの蚊、10セットB(無印)オスの蚊、10匹の処女野生型メス蚊が含まれています。他の6つのケージには、10セットA(無印)のオスの蚊、10セットB(RhBマーク)オスの蚊、および10個の処女野生型雌蚊が含まれます。これらのケージにラベルを付け、2つの交配の組み合わせを明確に区別します。
   注:経験に基づいて、60 cm x 60 cm x 60 cmケージは、より小さなケージが混合交配を奨励する可能性があるため、交配アッセイに使用されました。
2. ステップ5.4で準備したオスのそれぞれのカップをステップ6.1のラベルに従って交配ケージに入れます。網を取り出し、カップを軽くタップして、オスをカップから出します。ケージから蚊が逃げないように、慎重に紙コップと網をケージから取り外します。オスの蚊が交配ケージに少なくとも1時間順応するようにします。
3. 経口吸引器を使用して、処女野生型メスの蚊を12個の紙コップに移し、各カップに10個の蚊を含みます。
4. オスの蚊の順応期間の後、すべての交配ケージにメスの1カップを移し、網を取り除きます。カップから残っているメスの蚊を励ますために、カップをそっと揺らします。ケージから蚊が逃げないように、慎重に紙コップと網をケージから取り外します。
5. 3時間の交配を行うことを許可します。
   注:推奨交配期間は、野生型 Aeaegyptiの以前の観察によって決定されました。60cm x 60cm x 60cmケージに収容されている10人の女性と20人の男性を含む実験では、90%の女性授精が3時間(補足材料、セクション2)で達成された。攪拌が中断し、混合交配につながる可能性がありますので、この期間中にケージを邪魔しないでください。混合交配(女性がマークされた男性とマークされていない男性の両方と交配した場所)は、蛍光顕微鏡の下でRhBマークされた精子と無印の精子を区別することが困難であるため、RhBマークされた男性に偏りをもたらす。
6. 交配実験を終了するには、機械吸引器を使用して各ケージからすべての蚊を取り除きます。氷上の蚊を少なくとも5分間冷たい麻酔をします。蚊が完全に麻酔されたら、雌の蚊をそっと拾い、網で固定された別の紙コップに入れます(メッシュサイズ150 x 150、160 μm開口)。合間ケージから用紙カップにそれぞれのラベルを転送して、紙コップにラベルを付けます。
   注:この時点で実験を一時停止し、10%のスクロース溶液でメスを維持することが可能です。RhBマークされた精液は、少なくとも1週間は女性の精子の中で安定したままである。死んだ標本や乾燥した標本が解剖が困難であるため、解剖前にメスを生き続けることが最善です。
7. 女性の精子を採点するには、氷上の雌の蚊を少なくとも5分間氷上で麻酔してから、ステレオ顕微鏡で解剖する(ビデオ1)。その授精状態について、化合物の光顕微鏡(倍率100x)の下で精子を調べる(図4)。授精された個体の場合、RFP1フィルターとカメライメージングシステムを備えた蛍光ステレオ顕微鏡の下で検査することにより、精子にRhB印の精液が含まれているかどうかを判断します。
   注:画像システムを取り付けた蛍光ステレオ顕微鏡を使用する場合、長時間の露光時間(5)を利用して検出感度を高めることが推奨されます。雌の蚊がマークされた男性と交尾した場合、彼女の精子は明るいオレンジ色を蛍光します(図5A)。しかし、メスの蚊が無印の雄と交尾した場合、彼女の授精精子は蛍光を発しない(図5B)。

7. RhB廃棄物の処分

1. 活性炭²⁵ でRhB水性廃棄物を一般排水として排出する前に処理します。固形RhB廃棄物(RhBでマークされた蚊、ペーパータオル、RhBを浸した芯)を化学廃棄物として処分します。RhB廃棄物を処理する際は、標準PPEを使用してください。

結果

wAlbB-SGは、ウォルバキアのwAlbB株に安定して感染した局所的な(シンガポール )Ae.ae.aegypti ラインである。本論文に記載されたプロトコルを用いて、近交生の男性交配競争力と wAlbB-SGの外交線を評価し、近親交配が男性の交配フィットネスの損失をもたらすかどうかを判断した。近親交配ラインは昆虫の中で11世代維持されていたが、外交線は野生型の雄Aeでメスを裏切ることによって生成された。アエジプティ。近交系と外線の雄は、野生型の野生型の雌 Ae.aegyptiと交配するために互いに競い合った。交配競争力アッセイは三重で行われました。

結果は、女性授精のデータがRhB-sucrose-fed male male sucrose-fed male sorに偏っていないため、男性の適性に影響を及ぼさなかったことを示した(表1および図6)RhBは男性の交配適性に影響を及ぼさないため、内血種または交差線(図2)のいずれかによって交配された授精女性の割合に基づいてデータを分析する。実験トリクセート全体の結果は一貫していました。3つの複製すべてで近親交配男性よりもアウトクロス男性と交配する女性の割合が有意に高かった(P≤0.05、マンホイットニーU-test)。 これらの結果は、実験室での近親交配の数世代後に男性の交配フィットネスの潜在的な損失を示唆しています。

図1:男性(左)と女性(右) アエデス・アエジプティ・ プパエの横型図 同じ飼育条件下では 、Ae.aegyptiは サイズに応じてプパル段階でセックスすることができます。男性は女性よりかなり小さい。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図2:男性(左)と女性(右 )Aedes aegypti成人の 分化 成虫の雄の蚊(左)は、成人女性よりもふさふさし、毛深い触角を持っています。赤い矢印はアンテナを示します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図3: 雄の蚊のローダミンBマーキング(A)光顕微鏡;(B)蛍光顕微鏡。左側の蚊は無印(スクロースに10%を与えた)、右側の蚊はマークされています(0.2%RhB-sucroseを与えられます)。マークされた蚊は、白い光の下で目に見えるピンクの腹部を持っています(Aの右側の蚊), 蛍光顕微鏡下で明るいオレンジ色を蛍光します (B).スケールバー= 5 mm. 略称: RhB = ローダミン B.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図4:化合物の光学顕微鏡下で女性の精子を授精し、非授精(100倍倍) 雌の蚊の授精状態は、複合光顕微鏡下で精子を観察することによって決定することができる。授精した雌の蚊には少なくとも1つの満たされた精子が含まれ、非授精雌の蚊の3つの精子はすべて空になる。糸状の運動性精子は、複合光顕微鏡下で満たされた精子に見える。スケールバー= 100 μm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図5:蛍光ステレオ顕微鏡下で精液を用いて精液を授精した雌の蚊の精子を、(A)RhB印と(B)蛍光顕微鏡下で蛍光を示す、RhB印の精液を授精した無印の精子を蛍光する。スケールバー= 100 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図6: 異性子または外交男性が相互マーキングを有する実験三次体で男性によって授精した野生型女性の数( A)近交系の雄は、アウトクロスオスがマークされていない間にRhBでマークされた。(B)アウトクロスの男性はRhBでマークされ、近親交配男性はマークされていない。より多くの女性は、マーキングの状態に関係なく、アウトクロス男性と交尾したと観察された。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図7:3つの実験複製における近交系または外交男性と交配した授精された女性の割合。各実験複製について、アウトクロス男性と交配する女性の割合が有意に高い(P ≤ 0.05、マン・ホイットニー U-test)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

ビデオ1:軽いステレオ顕微鏡下で精子のための女性のAedes aegyptiの解剖。こちらをクリックして、このビデオをダウンロードしてください。 

	♀ x インブレッド (RhB) ♂	♀ x アウトクロス (無印) ♂ b	♀ x インブレッド (無印) ♂ c	♀ x アウトクロス (RhB) ♂ d	全体の授精率 (a +b+c+d/120)
レプリケート 1	11	35	7	40	77.5% (93/120)
レプリケート 2	6	29	8	31	61.7% (74/120)
レプリケート 3	6	36	6	33	67.5% (81/120)

表1:RhBマークと無印のwAlbB-Sg Aedes aegypti近交系およびアウトクロスオスと交配した女性の数。各複製で合計120匹の女性が使用された。

	女性の分授率
	近親交配男性	アウトクロス男性
レプリケート 1	19% (18/93)	81% (75/93)
レプリケート 2	19% (14/74)	81% (60/74)
レプリケート 3	15% (12/81)	85% (69/81)

表2:授精された女性の割合は、wAlbB-Sg Aedes aegypti近親交配およびアウトクロスオスと交配した。

補足図S1:RhBベースと従来の交配競争力アッセイのワークフローの比較 従来の交配競争力アッセイと比較して、RhBベースの交配競争力アッセイの簡略化された短縮されたワークフローは、実験期間を大幅に短縮します。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図S2:男性成人Aedes aegyptiのカプランマイヤー生存曲線は、0.2%および0.4%ローダミンB - ショ糖供給で摂食中および後に。(A)雄の野生型および(B)の生存率は、スクロースのみを供給した対照と比較して、0.2%および0.4%RhB-sucroseに餌を与えた3日間の間および後のaegyptiである。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足表S1:1-、2-および3-hの時点で、W 60cm x D 60cm x H 60 cmケージにおける女性の授精率(10人の女性と20人の男性の比率)。 このテーブルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

マーキングは昆虫集団の動態、分散、行動、交配生物学²⁶を研究するために昆虫学研究で一般的に使用される。SITおよびIITプログラムでは、フィールド集団からの離型歪みを区別し、その分散を研究し、放出比率を最適化するためにマーキングを行います。使用されるマーキング方法としては、遺伝マーキング27、28、幼虫食品^29、30、蛍光ダスト^31、及び色素³²に同位体を組み込む。男性の交配フィットネスが重要な要素であるSITまたはIITを使用した蚊集団の抑制のために、蛍光色素は蚊の交配生物学^18、19を研究するためのマーカーとして使用されてきた。

従来、男性の交配性の評価は、女性の生殖能力アッセイを用いて評価されてきた。しかし、このアッセイは、下流の実験プロセスが交配後に行われるため、時間と労力を要する(補足図S1)。これらのプロセスには、雌の採血、卵の採取、卵の孵化、卵の生存率を決定するための孵化卵の割合の列挙が含まれる。平均して、このアッセイは、男性の交配競争力の最終的な決定に(競争力アッセイケージの設定から始まる)実験作業の30工数と2週間を必要とします。

彼の論文は、女性とRhBマークの雄との交配相互作用を直接測定するために、蛍光色素RhB(蚊に0.2%RhB-sucroseとして供給される 補足図S2)の使用を提示する。このプロトコルは蛍光ステレオ顕微鏡を必要とするが、それは、上記の時間のかかる実験手順を実行する必要性を排除する。平均して、このRhBベースのアッセイは、女性の不妊治療アッセイと同等のデータを得るために約10時間と約1日を必要とします。この>90%の時間節約により、研究者は複数の実験的複製を実行することができ、男性の交配フィットネスのより堅牢な検証を提供します。さらに、このアッセイは、2つの無菌またはウォルバキアに感染した蚊のライン間の交配競争力を比較するために使用することができる。

このタイプの比較は、女性がそのような両方のラインと交配すると生存不可能な卵子を生み出すので、従来の女性の生殖能力アッセイでは不可能である。 それにもかかわらず、実験中の混合交配は、RhBマークと無印の両方の男性からの精液を含む女性の精子中の無印の精子を同定することが困難であるため、マークされた集団に偏ることになります。同様の結論は、RhB¹⁸を使用してアノフェレスガンビアの交配競争力を評価する研究で行われ、それによって交配アッセイにおける女性のより大きな割合がマークされた男性によって交配することが判明した。ポリアンドリーは、以前に交尾中断^に従事していた女性で発生する可能性が高いため、これらの実験では、より大きなケージ体積(0.216 m³⁾でより少ない蚊(20人のオスから10匹の雌)を使用して、この研究でこれが起こる確率が減少した。

結果はRhBマークされた集団に対する偏りを示さなかった、混合交配が限られていることを示した。要約すると、交配競争力アッセイで男性をマークするRhBの組み込みは、男性の交配適性を評価する経済的かつ迅速な方法です。この方法はまた、照射の異なる用量にさらされた男性、異なる飼育体制で飼育された男性、または ウォルバキアの異なる株に感染したものとの間の交配競争力を直接比較することを可能にし、男性の放出ベースの蚊集団抑制プログラムのための男性交配フィットネスの評価のための貴重なツールとなる。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Compound light microscope	Olympus	CX23	To score for spermathecae insemination
Dissection forceps	Bioquip	Rubis forceps (4524)
Fluorescence stereo-light microscope with RFP1 filter	Olympus	SZX16	To check for Rhodamine B fluorescence signal
Mosquito cages	Bugdorm	4F3030	W 32.5 cm x D 32.5 cm x H 32.5 cm; mesh size of 150 x 150; 160 µm aperture For holding of male and female adult mosquitoes prior to mating assay
6M610	W 60 cm x D 60 cm x H 60 cm; mesh size of 44 x 32; 650 µm aperture For mating competitiveness assay
Mosquito netting			150 x 150, 160 µm aperture
Rhodamine B	Sigma Aldrich	R6626	≥95% (HPLC)
Stereo-light microscope	Olympus	SZ61	For spermathecae dissection
Sucrose	MP Biomedicals	SKU 029047138	Food grade
TetraMin tropical flakes	Tetra	77101	Fish food for feeding larvae