באמצעות צבע פלואורסצנטי, רודמין B, כדי ללמוד תחרותיות הזדווגות יתושים Aedes aegypti זכר

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לחקר התחרותיות הזדווגות של Aedes aegypti זכר באמצעות צבע פלואורסצנטי כסמן. נקבות היתושים חשופות הן לזכרים מסומנים והן לזכרים לא מסומנים להזדווגות. לאחר ההזדווגות, הזרע שלהם נבדקים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לקבוע את בן זוגם להזדווגות.

Abstract

ההצלחה של תוכניות דיכוי אוכלוסין סטריליות או לא תואמות המבוססות על טכניקת חרקים תלויה ביכולתם של זכרים משוחררים להתחרות על נקבות מסוג בר ולעורר סטריליות באוכלוסיית היעד. לפיכך, הערכת מעבדה של תחרותיות הזדווגות גברית חיונית להערכת הכושר של זן השחרור לפני שחרור השדה. באופן קונבנציונלי, מבחנת כזו מבוצעת על ידי קביעת שיעור הביצים הקיימות המיוצרות על ידי הנקבות לאחר שנחשפו בו זמנית לשני סטים של זכרים (זנים מסוג בר ושחרור) להזדווגות. עם זאת, תהליך זה גוזל זמן ומייגע בשל הצורך להאכיל תחילה את הנקבות לייצור ביצים ולאחר מכן לבקוע ולפרוע את הביצים בקעו כדי לקבוע את הכדאיות הביצית.

יתר על כן, שיטה זו אינה יכולה להבחין במידת התחרותיות בין שני קווי יתושים סטריליים או נגועים בוולבאצ'יה,שכן יתושים נקבות מסוג בר ייצרו ביצים לא בנות קיימא רק עם ההזדווגות עם שניהם. כדי לעקוף מגבלות אלה, מאמר זה מתאר שיטה ישירה יותר למדידת התחרותיות של היתושים הזכרים בהגדרות המעבדה באמצעות צבע פלואורסצנטי, רודמין B (RhB), אשר ניתן להשתמש בו כדי לסמן זכרים על ידי האכלתם בתמיסת סוכרוז המכילה RhB. לאחר ההזדווגות, נוכחות של זרע פלואורסצנטי בזרע של נקבה יכולה לשמש כדי לקבוע את בן זוגה להזדווגות. שיטה זו חסכונית, מקטינה את זמן הניסוי ב -90% ומאפשרת השוואה של כושר הזדווגות בין שני קווים סטריליים או נגועים בוולבאצ'יה.

Introduction

גידול ושחרור של זכרים סטריליים או לא תואמים לדיכוי אוכלוסיות יתושים Aedes מוערך כעת בתחום ככלי חדשני למניעת התפרצויות של דנגי ומחלות אחרות המועברות על ידי Aedes¹. אסטרטגיות דיכוי שחרור זכר הנמצאות כיום בניסויי שדה כוללות את השימוש בשיטה הגנטית², הקרנה (טכניקת חרק סטרילי, SIT)³, חיידקים אנדוזימביוטיים Wolbachia (טכניקה לא תואמת חרקים, IIT)⁴, או שילוב של שתי הטכניקות האחרונות^5,6. הצלחתן של גישות אלה תלויה במידה רבה ביכולתם של הזכרים המשוחררים לגרות על זכרים פראיים ולחפש נקבות להזדווגות. אחרת, לא ניתן לגרום לעקרות באוכלוסיית היעד.

בתוכנית SIT קלאסית, למשל, כושר הזדווגות גברי עשוי להיות מושפע מגורמים כגון מינון הקרנה^7,8,9, פרוטוקול גידול המוני ומידת ההזדווגות במושבה^{10,11,12,13,14}. יתר על כן, מחקרים על תחרותיות ההזדווגות עשויים לספק ידע חשוב על התנהגות ההזדווגות יתושים אשר יכול לשמש כדי ליידע אסטרטגיות בקרה וקטורית.

ב- SIT ו- IIT, התחרותיות בהזדווגות של יתושים זכרים מוערכת בדרך כלל על ידי מתן אפשרות הן לזן פראי והן למתח שחרור להתחרות על נקבות מסוג בר בכלוב^8,11,15,16. לאחר מכן, הנקבות ניזונות מדם וביציהן בקעו כדי לקבוע את הכדאיות. נקבות שמטילות ביצים או ביצים שאינן בנות קיימא עם קצב צוהר נמוך מניחות שהן מזדווגות עם זכרי זן השחרור, בעוד נקבות המייצרות ביצים בנות קיימא מניחות שהן מזדווגות עם זכרים מסוג בר. התחרותיות בהזדווגות מחושבת לאחר מכן עם מדד^{פריד 17}. למרבה הצער, שיטה זו היא עתירת משאבים וגוזלת זמן רב, ומדד פריד הכולל יכול להיות מושפע מגורמים מבלבלים חיצוניים המשפיעים על כדאיות הביצים כגון טיפול לקוי בביצים וייבוש יתר עלולים לגרום לשיעור צוהר נמוך בצלב התאימות שעלול להוביל למדד מטוגן נמוך באופן מלאכותי.

יתר על כן, שיטה זו אינה מאפשרת השוואה ישירה של תחרותיות הזדווגות בין יתושי Aedes נגועים זנים שונים של Wolbachia או כי הם חשופים מינונים שונים של הקרנה. לפיכך, נדרשת שיטה ישירה יותר כדי להתמודד עם אתגרים אלה. מחקרים אחרונים^18,19 הוכיחו את האפקטיביות של שימוש בצבע פלואורסצנטי, RhB, כדי לסמן את נוזל הזרע של יתושים זכרים. נוזל הזרע המסומן מועבר ומאוחסן בזרע היתושים הנשיים עם הזדווגות מוצלחת, ומאפשר מדידה ישירה של אינטראקציית ההזדווגות הנשית עם זכרים מסומנים. רודמין B הוא צבע פלואורון תגובתי תיול נפוץ כסמן ביולוגי למחקרים אקולוגיים והתנהגותיים בבעלי חיים כולל חרקים20. עבור מחקרי יתושים, RhB הוא הציג על ידי האכלה עם סוכר או דבש מים המכילים אבקת RhB מומס^{18,19,21,22,23,24}. עם הספיגה, צבע ה-RhB נקשר לחלבונים, מכתים רקמת גוף בכתם אדמדם-ורוד הנוצץ בצבע כתום בהיר תחת מקור אור פלואורסצנטי.

אות הפלואורסצנטיות החזק והיציבות של הסימון, יחד עם יכולתו להכתים נוזלי זרע חרקים, מאפשרים ניטור של העברת נוזל הזרע המסומן מהזכר המסומן לאברי אחסון הזרע של החרק הנשי למחקרי הזדווגות^18,19,21,24. השימוש RhB בתחרותיות הזדווגות גברית לא רק מאפשר מדידה ישירה של אינטראקציית ההזדווגות של נקבות עם זכרים מסומנים ולא מסומנים, אבל התוצאות ניתן להשיג גם בתוך 24 שעות כפי שהוא ob ob ob obly של קביעת הכדאיות הביצה, אשר בדרך כלל דורש כ 10 עד 14 ימים. יתר על כן, שיטה זו מתגברת על אובדן פוטנציאלי של נתונים כאשר היתושים הנשיים אינם מזינים בדם או מתים לפני ההשתתפות. זה קריטי במיוחד משום בניסויים חצי שדה, שבו יתושים נקבות נוטים נזק ומוות במהלך איסוף לאחר ההזדווגות באמצעות תרמיל או שאיפה מכנית. כדי להתמודד עם המגבלות הנוכחיות של שימוש בפוריות נשית כדי להציג שיטה חלופית המשתמשת בהכתמת RhB כדי למדוד ישירות את התחרותיות בהזדווגות יתושים זכרים. השיטה מפשטת את זרימת העבודה, מקצרת את זמן הניסוי משבועיים ליום אחד, ומאפשרת לבצע שכפולים ניסיוניים יותר ומאפשרת השוואה בין שני זני שחרור. פרוטוקול זה יתאים למעבדות הנמצאות בתוכניות לדיכוי אוכלוסיית יתושים המבוססות על שחרור גברים, ועשוי לשמש לבקרת איכות שגרתית ולהערכת מאמץ.

Protocol

1. גידול יתושים

1. לנהל את כל גידול יתושים ואת התחרותיות הזדווגות הגברית תחת תנאי חרקים סטנדרטיים של 27 ± 1 °C (75-80% לחות יחסית, עם photoperiod של 12 h:12 h אור: מחזורים כהים.
2. ייעד את שני סטים של זכרים מתחרים כסט A ו- Set B לעיון קל במתודולוגיה המתוארת במאמר זה. לגדל את היתושים בתנאים סטנדרטיים כדי להבטיח השוואה הוגנת של הכושר שלהם במהלך ההסתה. לגדל את היתושים בצפיפות זחל של 500 זחלים ב 2 ליטר מים ולהאכיל אותם עם אבקת מזון דגים טחונים עד libitum.
   הערה: עבור הדור של התוצאות הייצוגיות, סט A ו Set B היו הזכרים הנבזיים והמנוכרים של Ae נגוע וולבצ'יה. אגיפטי,בהתאמה.
3. יתושים זכר ונקבה מין בשלב הגולם, ומכילים אותם בנפרד בכלובים (ראה טבלת החומרים ) של מידותW 32.5 ס"מ x D 32.5 ס"מ x H 32.5 ס"מ, עם גודל רשת של 150 x 150 ו 160 מיקרומטר צמצם. לשמור על כל היתושים הבוגרים עם 10% תמיסת סוכרוז.

2. הכנת יתושים זכרים ונקבות

1. מין יתושים זכר ונקבה בשלב הגולם על פי הבדלי הגודל שלהם (הגולם הגברי קטן יותר מאשר גולם נקבה) (איור 1).
2. עבור כל קבוצה של יתושים (Set A או Set B), העבר 100 גלמים זכרים כל אחד לכלוב עם יבלות מוקדמות להאכלת סוכרוז או האכלת RhB-סוכרוז.
3. מניחים את הגולם הנשי בקבוצות קטנות של 40-50 לכלוב. עם הופעתם של האימאגו, בדוק את הכלובים לנוכחות של יתושים זכרים.
   הערה: יתושים זכרים בוגרים קטנים יותר מהנקבות ויש להם אנטנות סבושות ושעירות יותר(איור 2). השתמש רק יתושים נקבות בתולה עבור תחרות ההזדווגות. השימוש בנשים שהופרו מראש יהפוך את כל הנתונים המתקבלים ללא חוקיים. לכן, יש לנקוט זהירות קיצונית במהלך הסקס בשלב הגולם. אין להשתמש בנקבות היתושים מכלוב שזוהם יתושים זכרים. כלובים נוספים של נקבות צריכים להיות מוכנים.

3. הכנת 0.2% RhB - פתרון סוכרוז

הערה: RhB היא אבקה ירוקה בצורה יבשה ואדמדם-ורוד בתמיסה. ציוד מגן אישי סטנדרטי (PPE: שמלת מעבדה, כפפות ניטריל והגנה על העיניים) יישחק בעת טיפול בחומר כימי זה. כדי למנוע שאיפה, שקול את אבקת RhB במכסה המנוע אדים.

1. כדי להכין 0.2% w /v RhB-סוכרוז פתרון, להמיס 200 מ"ג של אבקת RhB עבור כל 100 מ"ל של 10% w / v / sucrose פתרון. מערבבים היטב כדי להבטיח שכל האבקה מומסת.
   הערה: מכיוון ש-RhB רגיש לאור, השתמש בבקבוקי ענבר או עטף בקבוקים שקופים לחלוטין בנייר אלומיניום.

4. האכלת יתושים זכרים

הערה: נתונים מאופטימיזציה האכלה RhB-סוכרוז מוצג חומר משלים, סעיף 1.

1. הכן 20 בקבוקי מאכיל סוכר עם פתיל. הוסיפו 10 מ"ל של 10% סוכרוז ב-10 בקבוקי מאכילים ו-10 מ"ל של תמיסה של 0.2% RhB-סוכרוז בעשרת בקבוקי המאכיל האחרים (השתמשו בבקבוקי ענבר, או עטפו את הבקבוקים בנייר אלומיניום).
2. מניחים את בקבוקי המאכיל בכלובים הגבריים המתאימים (5 בקבוקים לכלוב) שהוכנו בשלבים 2.2 ו -2.3. אפשר ליתושים הזכרים לאכול במשך שלושה ימים לפני ניסוי ההזדווגות.

5. בדיקת פלואורסצנטיות RHB יתושים זכרים

1. שאפו יתושים זכרים שניזונים מ-RhB-סוכרוז, והתבוננו בהם תחת מיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי כדי להבטיח שכל היתושים הזכרים הניזונים מ-RhB-סוכרוז סומנו בהצלחה עם RhB.
2. תדליק את מנורת מבער הכספית ואת המיקרוסקופ הסטריאו. אפשר למקור האור של מנורת מבער הכספית להתייצב במשך 10 דקות. הגדר את מסנני הפלואורסצנטיות לחלבון פלואורסצנטי אדום 1 (RFP1) (אורך גל עירור 540 ננומטר, אורך גל פליטה 625 ננומטר).
3. שאפו מספר קטן של יתושים (ארבעה או חמישה) בכל פעם לתוך צינור הזכוכית של השאיפה האוראלית. דרך צינור הזכוכית, התבונן בגופם של היתושים הזכרים תחת מיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי. אל תכלול יתושים זכרים שאינם מסומנים עם RHB מהניסוי.
   הערה: הבטן של יתושים זכרים המסומנים ב- RhB תיראה ורודה תחת אור לבן(איור 3A)ותזהר כתום בהיר תחת אור פלואורסצנטי(איור 3B).
4. העבר הגדר יתושים זכרים לתוך 12 כוסות נייר מאובטח עם רשת (גודל רשת 150 x 150, 160 מיקרומטר צמצם); 6 כוסות כל אחת עם 10 יתושים זכרים שניזונו סוכרוז ו-6 הכוסות האחרות כל אחת עם 10 יתושים זכרים הניזונים מ-RhB-סוכרוז. חזור על שלב זה עבור יתושים זכרים Set B.

6. תפילת תחרות הזדווגות

1. הגדר 12 W 60 ס"מ x D 60 ס"מ x H 60 ס"מ כלובים עם גודל רשת 44 x 32, 650 מיקרומטר צמצם עבור ההזדווגות assay. בכל אחד מששת הכלובים, כלולים 10 יתושים זכרים מסוג Set A (מסומן על ידי RhB), 10 יתושים זכרים מסוג Set B (לא מסומנים) ו-10 יתושים נקבות בתולות מסוג בר. בששת הכלובים האחרים, כלולים 10 יתושים זכרים מסוג Set A (לא מסומנים), 10 יתושים זכרים מסוג Set B (מסומן על ידי RhB) ו-10 יתושים נקבות בתולות מסוג בר. תייג את הכלובים האלה כדי להבחין בבירור בין שני שילובי ההזדווגות.
   הערה: בהתבסס על ניסיון, כלוב 60 ס"מ x 60 ס"מ על 60 ס"מ שימש לבדיקת ההזדווגות ככלוב קטן יותר עשוי לעודד הזדווגות מעורבת.
2. מניחים את כוסות הזכרים המתאימות שהוכנו בשלב 5.4 בכלובי ההזדווגות על פי התווית בשלב 6.1. מוציאים את הרשת ומקישים בעדינות על הכוס כדי לדחוף את הזכרים מהכוס. הסר בזהירות את הנייר והרשת מהכלוב כדי להבטיח שאף יתוש לא יברח מהכלוב. אפשר ליתושים הזכרים להתאקלם בכלוב ההזדווגות לפחות שעה.
3. באמצעות שאיפה אוראלית, העבירו יתושים נשיים בתוליים מסוג בר ל-12 כוסות נייר, כאשר כל מכילה 10 יתושים.
4. לאחר תקופת ההתאקלמות של היתושים הזכרים, מעבירים אחת של נקבות לכל כלוב הזדווגות ומסירים את הרשת. דוחפים בעדינות את הכוס כדי לעודד את כל היתושות שנותרו מהכוס. הסר בזהירות את הנייר והרשת מהכלוב כדי להבטיח שאף יתוש לא יברח מהכלוב.
5. אפשר להזדווגות להתקיים במשך 3 שעות.
   הערה: משך ההזדווגות המומלץ נקבע באמצעות תצפיות קודמות של סוג פראי Ae. aegypti. בניסויים מעורבים 10 נקבות ו 20 זכרים מוחזקים בכלוב 60 ס"מ x 60 ס"מ x 60 ס"מ, 90% הזרעה נשית הושגה ב 3 שעות(חומר משלים, סעיף 2). אל תפריע לכלוב בתקופה זו, שכן תסיסה עלולה להוביל להזדווגות מופרעת ומעורבת. הזדווגות מעורבת (שבה הנקבה הזדווגה עם זכרים מסומנים ולא מסומנים) גורמת להטיה כלפי זכרים המסומנים ב- RhB מכיוון שקשה להבחין בין זרעים לא מסומנים לבין זרעים המסומנים ב- RhB תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
6. כדי לסיים את ניסוי ההזדווגות, להסיר את כל היתושים מכל כלוב באמצעות שאיפה מכנית. קר esesthetize היתושים על קרח לפחות 5 דקות. כאשר היתושים הם מרדים לחלוטין, בעדינות להרים את היתושים הנשי ולשכן אותם בכוס נייר נפרדת מאובטחת עם רשת (גודל רשת 150 x 150, 160 מיקרומטר צמצם). תייג את הנייר על ידי העברת התווית המתאימה מכלוב ההזדווגות על הנייר.
   הערה: ניתן להשהות את הניסוי בשלב זה ולשמור על הנקבות עם פתרון סוכרוז 10%. נוזל הזרע המסומן על-ידי RhB יישאר יציב בתוך הזרע הנשי למשך שבוע לפחות. עדיף לשמור על הנקבות בחיים לפני שניתחו כדגימות מתות ומיובשות קשה לנתח.
7. כדי להבקיע את הזרע הנשי, קר מרדים את היתושים הנשיים על קרח לפחות 5 דקות לפני ניתוח תחת מיקרוסקופ סטריאו(וידאו 1). בדוק את הזרע תחת מיקרוסקופ אור מורכב (הגדלה 100x) עבור מצב ההפריה שלהם (איור 4). עבור אנשים מופרים, לקבוע אם הזרע מכיל נוזל הזרע מסומן RhB על ידי בדיקתם תחת מיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי המצויד במסנן RFP1 ומערכת הדמיית מצלמה.
   הערה: בעת שימוש במיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי עם מערכת הדמיה מחוברת, מומלץ לנצל זמן חשיפה ממושך (5 שניות) כדי להגביר את רגישות הזיהוי. אם היתוש הנקבה הזידו עם זכר מסומן, הזרע שלה יתנפח בכתום בוהק(איור 5A). עם זאת, אם היתוש הנקבה הזידו עם זכר לא מסומן, הזרע המופרה שלה לא יעבור פלואורסצ'ה(איור 5B).

7. סילוק פסולת RhB

1. לטפל בפסולת RhB מימית עם פחמן פעיל²⁵ לפני פריקתה כמו שפכים כלליים. יש להיפטר מפסולת RhB מוצקה (יתושים המסומנים ב-RhB, מגבות נייר ופתילות ספוגות ב-RhB) כפסולת כימית. דון PPE סטנדרטי בעת טיפול בפסולת RhB.

תוצאות

w AlbB-SG הוא קו Ae. aegypti מקומי (סינגפור) נגוע ביציבות עם זן wAlbB של וולבצ'יה. באמצעות הפרוטוקול המתואר במאמר זה, הערכנו את התחרותיות הזדווגות הגברית של קו מלידה ומנוכר של wAlbB-SG כדי לקבוע אם הכלאה גורמת לאובדן כושר הזדווגות גברי. הקו ההולך ונשמר במשך 11 דורות בחרקים, בעוד הקו החיצוני נוצר על ידי חבטה אחורית של הנקבות עם Ae זכרי מסוג בר. אגיפטי. זכרים מן הקווים המלידה והמחונקים התחרו זה בזה על הזדווגות עם נקבה פראית מסוג Ae. aegypti. מטען התחרותיות של ההזדווגות נערך במשולש.

התוצאות הצביעו על כך ש-RhB לא השפיע על כושרם של הזכרים מכיוון שהנתונים על הזרעה נשית לא היו מוטים לכיוון או נגד הזדווגות עם זכרים מוזן-סוכרוז(טבלה 1 ואיור 6)מכיוון ש- RhB אינו משפיע על כושר ההזדווגות של הזכרים, אנו ממשיכים לנתח את הנתונים בהתבסס על אחוז הנקבות המופרות המוזדווגות על ידי הקו ההפריתי או החיצוני(טבלה 2 ואיור 7). התוצאה על פני הטריפליקטים הניסיוניים הייתה עקבית; היה אחוז גבוה משמעותית של נקבות מזווגות עם הזכרים החיצוניים מאשר עם הזכרים מלידה בכל שלושת המשכפלים (P ≤ 0.05, מאן-ויטני U-test). תוצאות אלה מצביעות על אובדן פוטנציאלי בכושר ההזדווגות הגברי לאחר מספר דורות של הכלאה במעבדה.

איור 1: מבט רוחבי על גברים (משמאל) ונקבה (מימין) אדס אגיפטי גלמים. תחת אותם תנאי גידול, Ae. aegypti יכול להיות סקס בשלב הגפיים על פי גודל; הזכרים קטנים משמעותית מהנקבות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: הבחנה בין גברים (משמאל) ונקבה (מימין) מבוגרים Aedes aegypti. יתושים זכרים בוגרים (משמאל) יש אנטנות סבוך ושעיר יותר מאשר הנקבה הבוגרת; החצים האדומים מצביעים על האנטנות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: סימון רודמין B של יתוש זכר. (A)מיקרוסקופיה קלה; (B)מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות. היתוש משמאל אינו מסומן (מוזן ב-10% סוכרוז), ואילו היתוש מימין מסומן (מוזן ב-0.2% RhB-סוכרוז). יתושים מסומנים יש בטן ורודה גלויה תחת אור לבן (היתוש בצד ימין ב A),אשר פלואורסים כתום בהיר תחת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית (B). מוטות קנה מידה = 5 מ"מ. קיצור: RhB = רודמין B. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: זרע נשי מופה ולא מופה תחת מיקרוסקופ אור מורכב (הגדלה של פי 100). מצב ההפריה של יתוש נקבה יכול להיקבע על ידי התבוננות בזרע שלה תחת מיקרוסקופ אור מורכב. יתוש נקבה מופרית יכיל לפחות זרע מלא אחד בעוד כל שלושת הזרע של יתוש נקבה לא מופרית יהיו ריקים. זרע דמוי חוט, רוטיה יהיה גלוי זרע מלא תחת מיקרוסקופ אור מורכב. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: זרע יתוש נקבה המופרית בנוזלי זרע תחת מיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי. (A)זרע מסומן ב- RhB ו -B) זרע לא מסומן המופרה בנוזלי זרע מסומנים על ידי RhB יהיה פלואורסצ'ים כתום בהיר תחת מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות. סרגלי קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: מספר הנקבות הפראיות שהופרו על ידי הזכרים ההולכים או החיצוניים במשולשים הניסיוניים עם סימון הדדי. (א)הזכרים הלידה סומנו ב- RhB בעוד הזכרים החיצוניים לא היו מסומנים. (ב) הזכרים החיצוניים סומנו ב-RHB בזמן שהזכרים הלידה לא היו מסומנים. מספר גבוה יותר של נקבות נצפה להיזדו עם זכרים outcross ללא קשר למעמד הסימון שלהם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 7: שיעור הנקבות המופרות משתדוות עם זכרים מלידה או מנוכרים ב-3 המשכפלים הניסיוניים. עבור כל שכפול ניסיוני, יש אחוז גבוה משמעותית של נקבות מזווגות עם זכרי outcross (P ≤ 0.05, מאן-ויטני U-מבחן). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

וידאו 1: ניתוח של Aedes aegypti הנשי עבור זרע תחת מיקרוסקופ סטריאו קל. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה. 

	♀ x מלידה (RhB) ♂ a	♀ x Outcross (לא מסומן) ♂ b	♀ x מלידה (לא מסומן) ♂ c	♀ x אאוטקרוס (RhB) ♂ d	שיעור הזרעה כולל (a+b+c+d/120)
שכפל 1	11	35	7	40	77.5% (93/120)
שכפל 2	6	29	8	31	61.7% (74/120)
שכפל 3	6	36	6	33	67.5% (81/120)

טבלה 1: מספר הנקבות שזווגות עם זכרים מסומנים ולא מסומנים עםAlbB-Sg Aedes aegypti מלידה ומנוכרת. בכל שכפול נעשה שימוש במספר כולל של 120 נקבות.

	אחוז נקבות מופרים
	זכרים מלידה	זכרים מנודים
שכפל 1	19% (18/93)	81% (75/93)
שכפל 2	19% (14/74)	81% (60/74)
שכפל 3	15% (12/81)	85% (69/81)

טבלה 2: אחוז הנקבות המופרות זווגות עם WAlbB-Sg Aedes aegypti זכרים מלידה ומפוחדים.

איור משלים S1: השוואת זרימת עבודה עבור תחרות הזדווגות מבוססת RhB וקונבנציונלית. בהשוואה לבדיקת התחרותיות הקונבנציונלית של ההזדווגות, זרימת העבודה הפשוטה והמקצרת לתחרותיות ההזדווגות מבוססת RhB מפחיתה באופן משמעותי את משך הניסוי. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים S2: קפלן מאייר עקומות הישרדות של מבוגר זכר Aedes aegypti במהלך ואחרי האכלה עם 0.2% ו 0.4% רודמין B-האכלת סוכרוז. אחוזי הישרדות של(A)זכר סוג בר ו - (B) wAlbB-Sg Ae. aegypti במהלך ואחרי שלושה ימים של הזנה על 0.2% ו 0.4% RhB-סוכרוז, לעומת פקדים שניזונו סוכרוז בלבד. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

טבלה משלימה S1: קצב הזרעה של נקבות ב W 60 ס"מ x D 60 ס"מ x H 60 ס"מ כלוב (יחס של 10 נקבות ל 20 זכרים) ב 1-, 2, ו 3 שעות זמן נקודות זמן. נא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו. 

Discussion

סימון משמש בדרך כלל במחקר אנטומולוגי לחקר דינמיקה של אוכלוסיית חרקים, פיזור, התנהגות וביולוגיה של הזדווגות²⁶. בתוכניות SIT ו- IIT, מתבצע סימון כדי להבדיל בין זן השחרור מאוכלוסיית השדה כדי ללמוד את הפיזור שלהם ולייעל את יחס השחרור. שיטות הסימון המשמשות כוללות סימון גנטי^27,28, שילוב איזוטופים במזון זחל^29,30,אבק פלואורסצנטי^31,וצבע³². לדיכוי אוכלוסיות יתושים באמצעות SIT או IIT, שם כושר ההזדווגות הגברי הוא מרכיב קריטי, צבעים פלואורסצנטיים שימשו כסמנים לחקר ביולוגיה של הזדווגות יתושים^18,19.

באופן קונבנציונלי, הערכה של תחרותיות הזדווגות גברית של זן השחרור כבר מוערך באמצעות בגידות פוריות הנשית. עם זאת, בדיקה זו גוזלת זמן ואינה עתירת עבודה עקב תהליכים ניסיוניים במורד הזרם לאחר ההזדווגות (איור משלים S1). תהליכים אלה כוללים האכלת דם של הנקבות, איסוף ביצים, בקיעה של הביצים, וספירת שיעור הביצים בקעו כדי לקבוע את הכדאיות הביצית. בממוצע, בדיקה זו דורשת 30 שעות אדם ושבועיים של עבודה ניסיונית (החל מהקמת כלובי בדיקה תחרותיים) ועד הקביעה הסופית של תחרותיות ההזדווגות הגברית.

מאמרו מציג את השימוש בצבע פלואורסצנטי, RhB, (הוזן כ-0.2% RhB-סוכרוז ליתושים, איור משלים S2) כדי למדוד באופן ישיר אינטראקציות הזדווגות בין נקבות לבין זכרים מסומנים על ידי RhB. בעוד פרוטוקול זה דורש מיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי, הוא מייתר את הצורך לבצע את ההליכים הניסיוניים הגוזלים זמן רב שהוזכרו לעיל. בממוצע, זה מבוסס RhB מבחן דורש כ 10 שעות גבר וכיום כדי לקבל נתונים שוות ערך לזה מבוחות פוריות נשיות. זה >90% חיסכון בזמן מאפשר לחוקרים לבצע שכפולים ניסיוניים מרובים, מתן אימות חזק יותר של כושר הזדווגות גברית. בנוסף, ניתן להשתמש בבחינת אסדה זו כדי להשוות את התחרותיות בהזדווגות בין שני קווים סטריליים או נגועים בוולבאצ'יה.

סוג זה של השוואה אינו אפשרי עם נקבות פוריות קונבנציונליות, כמו נקבות יניבו ביצים שאינן קיימא על הזדווגות עם שני קווים כאלה.  למרות זאת, כל הזדווגות מעורבת בניסוי תגרום להטיה כלפי האוכלוסייה המסומנת מכיוון שקשה לזהות זרעים לא מסומנים בזרע הנשי המכיל נוזל זרע הן מזכרים מסומנים והן מזכרים לא מסומנים. מסקנה דומה נעשתה במחקר שהעריך את התחרותיות בהזדווגות של אנופלס גמביה באמצעות RhB¹⁸, לפיה שיעור גדול יותר של נקבות בהזדווגות נמצאה הזדווגות על ידי זכרים מסומנים. ככל שסביר יותר שפוליאנדריה תתרחש אצל נקבות שעסקו בעבר בהזדווגות מופרעת³³, ההסתברות להתרחשות זו צומצמה במחקר זה באמצעות פחות יתושים (20 זכרים עד 10 נקבות) בנפח כלוב גדול יותר (0.216 מ^'3) בניסויים אלה.

התוצאות לא הראו כל הטיה כלפי האוכלוסייה המסומנת על ידי RhB, מה שמצביע על כך שההזדווגות המעורבת הייתה מוגבלת. לסיכום, שילוב של RhB כדי לסמן גברים בהזדווגות תחרותיות היא דרך חסכונית ומהירה להעריך כושר הזדווגות גברי. שיטה זו מאפשרת גם השוואה ישירה של תחרותיות הזדווגות בין זכרים החשופים למינונים שונים של הקרנה, שגדלו במשטרי גידול שונים, או אלה נגועים בזנים שונים של Wolbachia, מה שהופך אותו כלי בעל ערך להערכת כושר הזדווגות גברי עבור כל תוכנית דיכוי אוכלוסיית יתושים מבוססי שחרור זכר.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Compound light microscope	Olympus	CX23	To score for spermathecae insemination
Dissection forceps	Bioquip	Rubis forceps (4524)
Fluorescence stereo-light microscope with RFP1 filter	Olympus	SZX16	To check for Rhodamine B fluorescence signal
Mosquito cages	Bugdorm	4F3030	W 32.5 cm x D 32.5 cm x H 32.5 cm; mesh size of 150 x 150; 160 µm aperture For holding of male and female adult mosquitoes prior to mating assay
6M610	W 60 cm x D 60 cm x H 60 cm; mesh size of 44 x 32; 650 µm aperture For mating competitiveness assay
Mosquito netting			150 x 150, 160 µm aperture
Rhodamine B	Sigma Aldrich	R6626	≥95% (HPLC)
Stereo-light microscope	Olympus	SZ61	For spermathecae dissection
Sucrose	MP Biomedicals	SKU 029047138	Food grade
TetraMin tropical flakes	Tetra	77101	Fish food for feeding larvae