Uso del colorante fluorescente, rodamina B, para estudiar la competitividad del apareamiento en mosquitos machos Aedes aegypti

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para estudiar la competitividad de apareamiento del Aedes aegypti macho utilizando tinte fluorescente como marcador. Los mosquitos hembra están expuestos a machos marcados y no marcados para la cópula. Después del apareamiento, sus espermatozoides se examinan bajo un microscopio de fluorescencia para determinar su compañero de apareamiento.

Resumen

El éxito de los programas de supresión de poblaciones basados en técnicas de insectos estériles o incompatibles depende de la capacidad de los machos liberados para competir por las hembras de tipo salvaje e inducir la esterilidad en la población objetivo. Por lo tanto, la evaluación de laboratorio de la competitividad del apareamiento masculino es esencial para evaluar la aptitud de la cepa de liberación antes de la liberación en el campo. Convencionalmente, dicho ensayo se realiza determinando la proporción de huevos viables producidos por las hembras después de ser expuestas simultáneamente a dos conjuntos de machos (cepas de tipo salvaje y de liberación) para la cópula. Sin embargo, este proceso requiere mucho tiempo y es laborioso debido a la necesidad de alimentar primero a las hembras para la producción de huevos y luego eclosionar y enumerar los huevos eclosionados para determinar la viabilidad de los huevos.

Además, este método no puede discernir el grado de competitividad entre dos líneas de mosquitos estériles o infectados con Wolbachia,ya que los mosquitos hembra de tipo silvestre solo producirán huevos no viables al aparearse con ambos. Para eludir estas limitaciones, este documento describe un método más directo para medir la competitividad del apareamiento de mosquitos machos en entornos de laboratorio utilizando el tinte fluorescente, rodamina B (RhB), que se puede usar para marcar a los machos alimentándolos en solución de sacarosa que contiene RhB. Después del ensayo de apareamiento, la presencia de espermatozoides fluorescentes en el espermateca de una hembra se puede utilizar para determinar su pareja de apareamiento. Este método es rentable, reduce el tiempo experimental en un 90% y permite la comparación de la aptitud de apareamiento entre dos líneas estériles o infectadas con Wolbachia.

Introducción

La cría y liberación de machos estériles o incompatibles para la supresión de las poblaciones de mosquitos Aedes se está evaluando actualmente en el campo como una herramienta novedosa para prevenir brotes de dengue y otras enfermedades transmitidas por Aedes¹. Las estrategias de supresión de liberación masculina que se encuentran actualmente en ensayos de campo incluyen el uso del método genético^2,irradiación (Sterile Insect Technique, SIT)^3,bacteria endosimbiótica Wolbachia (Insect Incompatible Technique, IIT)^4,o una combinación de estas dos últimas técnicas^5,6. El éxito de estos enfoques depende en gran medida de la capacidad de los machos liberados para superar a los machos de tipo salvaje y buscar hembras para asegurar la cópula. De lo contrario, la esterilidad no puede ser inducida en la población objetivo.

En un programa clásico de SIT, por ejemplo, la aptitud de apareamiento masculino puede verse afectada por factores como la dosis de irradiación^7,8,9,el protocolo de cría en masa y el grado de endogamia en la colonia^{10,11,12,13,14.} Además, los estudios sobre la competitividad del apareamiento pueden proporcionar un conocimiento importante sobre el comportamiento de apareamiento de los mosquitos que podrían utilizarse para informar las estrategias de control de vectores.

En SIT e IIT, la competitividad de apareamiento de los mosquitos machos se evalúa típicamente permitiendo que tanto la cepa de tipo salvaje como la de liberación compitan por las hembras de tipo salvaje en una jaula^8,11,15,16. Las hembras son alimentadas con sangre y sus huevos eclosionados para determinar la viabilidad. Se supone que las hembras que ponen huevos no viables o huevos con baja tasa de eclosión se han apareado con machos de cepa de liberación, mientras que se supone que las hembras que producen huevos viables se han apareado con machos de tipo salvaje. La competitividad del apareamiento se calcula entonces con el Índice Fried^17. Desafortunadamente, este método consume muchos recursos y requiere mucho tiempo, y el índice frito general puede verse influenciado por factores de confusión externos que afectan la viabilidad del huevo, como el manejo deficiente del huevo y la desecación excesiva, puede resultar en una baja tasa de eclosión en el cruce de compatibilidad que luego puede conducir a un índice frito artificialmente bajo.

Además, este método no permite la comparación directa de la competitividad del apareamiento entre mosquitos Aedes que están infectados con diferentes cepas de Wolbachia o que están expuestos a diferentes dosis de irradiación. Por lo tanto, se requiere un método más directo para abordar estos desafíos. Estudios recientes^18,19 han demostrado la eficacia del uso del tinte fluorescente, RhB, para marcar el líquido seminal de los mosquitos machos. El líquido seminal marcado se transfiere y almacena en la espermateca de los mosquitos hembra tras el apareamiento exitoso, lo que permite la medición directa de la interacción de apareamiento de las hembras con los machos marcados. La rodamina B es un colorante fluorona tiol-reactivo comúnmente utilizado como biomarcador para estudios de investigación ecológica y conductual en animales, incluidos insectos20. Para los estudios de mosquitos, rhB se introduce alimentándose con azúcar o agua de miel que contiene polvo de RhB disuelto^{18,19,21,22,23,24}. Tras la absorción, el tinte RhB se une a las proteínas, teñiendo el tejido corporal con una mancha de color rosa rojizo que fluorescencia de color naranja brillante bajo una fuente de luz fluorescente.

La fuerte señal de fluorescencia y la estabilidad del marcado, junto con su capacidad para teñir los fluidos seminales de los insectos, permite el monitoreo de la transferencia del líquido seminal marcado del macho marcado a los órganos de almacenamiento de esperma del insecto hembra para estudios de apareamiento^18,19,21,24. El uso de RhB en un ensayo de competitividad de apareamiento masculino no solo permite la medición directa de la interacción de apareamiento de las hembras con machos marcados y no marcados, sino que los resultados también se pueden obtener dentro de las 24 h, ya que evita el proceso de determinación de la viabilidad del huevo, que generalmente requiere alrededor de 10 a 14 días. Además, este método supera la posible pérdida de datos cuando los mosquitos hembra no se alimentan con sangre o mueren antes del oviposicionamiento. Esto es particularmente crucial porque en los ensayos de semi-campo, donde los mosquitos hembra son propensos a daños y muerte durante la recolección posterior al apareamiento con una mochila o aspirador mecánico. Para abordar las limitaciones actuales del uso de la fertilidad femenina, presentamos un método alternativo que utiliza la tinción rhB para medir directamente la competitividad del apareamiento de mosquitos machos. El método simplifica el flujo de trabajo, acortando el tiempo experimental de aproximadamente dos semanas a un día, lo que permite realizar réplicas más experimentales y permite la comparación entre dos cepas de liberación. Este protocolo será adecuado para los laboratorios que se están embarcando en programas de supresión de la población de mosquitos basados en la liberación de machos, y puede usarse para el control de calidad de rutina y la evaluación de cepas.

Protocolo

1. Cría de mosquitos

1. Realizar toda la cría de mosquitos y el ensayo de competitividad de apareamiento macho bajo condiciones insectarias estándar de 27 ± 1 °C y 75-80% de humedad relativa, con un fotoperíodo de 12 h:12 h de luz: ciclos oscuros.
2. Designe los dos conjuntos de machos competidores como Conjunto A y Conjunto B para una fácil referencia en la metodología descrita en este documento. Criar a los mosquitos en condiciones estandarizadas para garantizar una comparación justa de su aptitud durante el ensayo. Criar a los mosquitos a una densidad larvaria de 500 larvas en 2 L de agua y alimentarlos con alimentos molidos para peces en polvo ad libitum.
   NOTA: Para la generación de los resultados representativos, el Conjunto A y el Conjunto B fueron los machos endogámicos y cruzados del Ae infectado con Wolbachia. Aegypti, respectivamente.
3. Sexo mosquitos macho y hembra en la etapa pupal, y contenerlos por separado en jaulas (ver la Tabla de Materiales)de dimensiones W 32.5 cm x D 32.5 cm x H 32.5 cm, con tamaño de malla de 150 x 150 y apertura de 160 μm. Mantenga todos los mosquitos adultos con solución de sacarosa al 10%.

2. Preparación de mosquitos machos y hembras

1. Sexar a los mosquitos macho y hembra en la etapa de pupa de acuerdo con sus diferencias de tamaño (las pupas macho son más pequeñas que las pupas hembra) (Figura 1).
2. Para cada conjunto de mosquitos (Conjunto A o Conjunto B), transfiera 100 pupas macho cada una a una jaula preetiqueta para la alimentación con sacarosa o la alimentación con sacarosa RhB.
3. Coloque las pupas hembra en pequeños lotes de 40-50 por jaula. A la aparición de las imagos, revise las jaulas para detectar la presencia de mosquitos machos.
   NOTA: Los mosquitos machos adultos son más pequeños que las hembras y tienen antenas más tupidas y peludas (Figura 2). Use solo mosquitos hembras vírgenes para los ensayos de competitividad de apareamiento. El uso de hembras preinseminadas hará que todos los datos resultantes no sean válidos. Por lo tanto, se debe tener mucho cuidado durante el sexado en la etapa de pupas. No use los mosquitos hembra de una jaula que haya sido contaminada con mosquitos machos. Se deben preparar jaulas adicionales de hembras.

3. Preparación de 0.2% RhB - solución de sacarosa

NOTA: RhB es un polvo verde en forma seca y rosa rojizo en solución. Se debe usar equipo de protección personal estándar (EPP: bata de protección de laboratorio, guantes de nitrilo y protección ocular) al manipular este producto químico. Para evitar la inhalación, pese el polvo rhB en una campana extractora de humos.

1. Para preparar una solución de sacarosa de RhB al 0,2% p/v, disuelva 200 mg de polvo de RhB por cada 100 ml de solución de sacarosa al 10% p/v/. Mezcle bien para asegurarse de que todo el polvo se disuelva.
   NOTA: Como RhB es sensible a la luz, use botellas de ámbar o envuelva botellas transparentes completamente con papel de aluminio.

4. Alimentación de mosquitos machos

NOTA: Los datos de la optimización de la alimentación con rhB-sacarosa se presentan en Material suplementario, sección 1.

1. Prepare 20 botellas de comedero de azúcar con una mecha. Agregue 10 ml de sacarosa al 10% en 10 botellas de engorde y 10 ml de solución de sacarosa RhB al 0,2% en las otras 10 botellas de alimentación (use botellas de ámbar o envuelva las botellas en papel de aluminio).
2. Coloque los biberones alimentadores en las respectivas jaulas masculinas (5 botellas por jaula) preparadas en los pasos 2.2 y 2.3. Permita que los mosquitos machos se alimenten durante tres días antes del experimento de apareamiento.

5. Comprobación de la fluorescencia RhB en mosquitos machos

1. Aspire mosquitos machos alimentados con sacarosa RhB y obsérvelos bajo un microscopio estereoscópico de fluorescencia para asegurarse de que todos los mosquitos machos alimentados con RhB-sacarosa hayan sido marcados con éxito con RhB.
2. Encienda la lámpara del quemador de mercurio y el microscopio estereoscópico. Permita que la fuente de luz de la lámpara del quemador de mercurio se estabilice durante 10 minutos. Establezca los filtros de fluorescencia para la proteína de fluorescencia roja 1 (RFP1) (longitud de onda de excitación 540 nm, longitud de onda de emisión 625 nm).
3. Aspire un pequeño número de mosquitos (cuatro o cinco) a la vez en el tubo de vidrio del aspirador oral. A través del tubo de vidrio, observe el cuerpo de los mosquitos machos bajo el microscopio estereoscópico de fluorescencia. Excluya los mosquitos machos no marcados con RhB del experimento.
   NOTA: El abdomen de los mosquitos machos marcados con RhB aparecerá rosado bajo luz blanca(Figura 3A)y brillará de color naranja brillante bajo luz fluorescente(Figura 3B).
4. Conjunto de transferencia A mosquitos machos en 12 vasos de papel asegurados con red (tamaño de malla 150 x 150, apertura de 160 μm); 6 tazas cada una con 10 mosquitos machos alimentados con sacarosa y las otras 6 tazas cada una con 10 mosquitos machos alimentados con sacarosa RhB. Repita este paso para los mosquitos machos Set B.

6. Ensayo de competitividad de apareamiento

1. Instalar jaulas de 12 W 60 cm x D 60 cm x H 60 cm con tamaño de malla 44 x 32, apertura de 650 μm para el ensayo de apareamiento. En cada una de las seis jaulas, incluya 10 mosquitos machos del Conjunto A (marcados con RhB), 10 mosquitos machos del Conjunto B (sin marcar) y 10 mosquitos hembra vírgenes de tipo silvestre. En las otras seis jaulas, se incluyen 10 mosquitos machos del Conjunto A (sin marcar), 10 mosquitos machos del Conjunto B (marcados con RhB) y 10 mosquitos hembra vírgenes de tipo silvestre. Etiquete estas jaulas para distinguir claramente entre las dos combinaciones de apareamiento.
   NOTA: Según la experiencia, se utilizó una jaula de 60 cm x 60 cm x 60 cm para el ensayo de apareamiento, ya que una jaula más pequeña puede fomentar el apareamiento mixto.
2. Coloque las respectivas copas de machos preparadas en el paso 5.4 en las jaulas de apareamiento de acuerdo con la etiqueta en el paso 6.1. Retire la red y golpee suavemente la taza para empujar a los machos fuera de la taza. Retire con cuidado el vaso de papel y la red de la jaula para asegurarse de que no se escapen mosquitos de la jaula. Permita que los mosquitos machos se aclimaten en la jaula de apareamiento durante al menos una hora.
3. Usando un aspirador oral, transfiera mosquitos hembra vírgenes de tipo silvestre a 12 vasos de papel, y cada taza contiene 10 mosquitos.
4. Después del período de aclimatación para los mosquitos machos, transfiera una taza de hembras a cada jaula de apareamiento y retire la red. Empuje suavemente la taza para alentar a los mosquitos hembra restantes a salir de la taza. Retire con cuidado el vaso de papel y la red de la jaula para asegurarse de que no se escapen mosquitos de la jaula.
5. Permita que el apareamiento tenga lugar durante 3 h.
   NOTA: La duración recomendada del apareamiento se determinó a través de observaciones previas de Ae. aegyptide tipo salvaje. En experimentos en los que participaron 10 hembras y 20 machos en una jaula de 60 cm x 60 cm x 60 cm, se logró una inseminación femenina del 90% en 3 h(Material suplementario, sección 2). No moleste la jaula durante este período, ya que la agitación podría provocar un apareamiento interrumpido y mixto. El apareamiento mixto (donde la hembra se ha apareado con machos marcados y no marcados) resulta en un sesgo hacia los machos marcados con RhB, ya que es difícil distinguir los espermatozoides no marcados de los espermatozoides marcados con RhB bajo un microscopio de fluorescencia.
6. Para terminar el experimento de apareamiento, retire todos los mosquitos de cada jaula usando un aspirador mecánico. Anestesiar en frío a los mosquitos en hielo durante al menos 5 minutos. Cuando los mosquitos estén completamente anestesiados, recoja suavemente a los mosquitos hembra y alójalos en un vaso de papel separado asegurado con una red (tamaño de malla 150 x 150, apertura de 160 μm). Etiquete el vaso de papel transfiriendo la etiqueta respectiva de la jaula de acoplamiento al vaso de papel.
   NOTA: Es posible pausar el experimento en este punto y mantener a las hembras con una solución de sacarosa al 10%. El líquido seminal marcado con RhB permanecerá estable dentro de la espermateca femenina durante al menos una semana. Es mejor mantener vivas a las hembras antes de la disección, ya que los especímenes muertos y desecados son difíciles de diseccionar.
7. Para puntuar la espermateca femenina, anestesiar en frío a los mosquitos hembra en hielo durante al menos 5 minutos antes de la disección bajo un microscopio estereoscópico (Video 1). Examinar las espermatecas bajo un microscopio de luz compuesta (aumento 100x) para determinar su estado de inseminación(Figura 4). Para los individuos inseminados, determine si las espermatecas contienen líquido seminal marcado con RhB examinándolas bajo el microscopio estereoscópico de fluorescencia equipado con un filtro RFP1 y un sistema de imágenes por cámara.
   NOTA: Cuando se utiliza un microscopio estereoscópico de fluorescencia con un sistema de imágenes conectado, se recomienda utilizar un tiempo de exposición prolongado (5 s) para aumentar la sensibilidad de detección. Si el mosquito hembra se ha apareado con un macho marcado, su espermateca fluorescencia de color naranja brillante(Figura 5A). Sin embargo, si el mosquito hembra se ha apareado con un macho no marcado, sus espermatozoides inseminados no fluorescenciarán(Figura 5B).

7. Eliminación de residuos de RhB

1. Tratar los residuos acuosos de RhB con carbón activado²⁵ antes de descargarlos como aguas residuales generales. Deseche los desechos sólidos de RhB (mosquitos marcados con RhB, toallas de papel y mechas empapadas con RhB) como desechos químicos. Tímese el EPP estándar cuando manipule residuos de RhB.

Resultados

w AlbB-SG es una línea localizada (Singapur) de Ae. aegypti infectada de manera estable con la cepa wAlbB de Wolbachia. Utilizando el protocolo descrito en este artículo, evaluamos la competitividad de apareamiento masculino de una línea endogámica y una línea cruzada de wAlbB-SG para determinar si la endogamia resulta en una pérdida en la aptitud de apareamiento masculino. La línea endogámica se había mantenido durante 11 generaciones en el insectario, mientras que la línea cruzada se generó al retrocruzar las hembras con Ae macho de tipo salvaje. aegypti. Los machos de las líneas endogámicas y cruzadas compitieron entre sí por aparearse con Ae. aegyptihembra de tipo salvaje. El ensayo de competitividad de apareamiento se realizó por triplicado.

Los resultados indicaron que rhB no afectó la aptitud de los machos ya que los datos para la inseminación femenina no estaban sesgados hacia o en contra del apareamiento con machos alimentados con RhB-sacarosa (Tabla 1 y Figura 6) Como RhB no afecta la aptitud de apareamiento de los machos, procedemos a analizar los datos basados en el porcentaje de hembras inseminadas apareadas por la línea endogámica o cruzada(Tabla 2 y Figura 7). El resultado a través de los triplicados experimentales fue consistente; hubo un porcentaje significativamente mayor de hembras apareadas con los machos cruzados que con los machos endogámicos en las tres réplicas (P ≤ 0,05, mann-Whitney U-test). Estos resultados sugieren una pérdida potencial en la aptitud de apareamiento masculino después de varias generaciones de endogamia en el laboratorio.

Figura 1: Vista lateral de las pupas macho (izquierda) y hembra (derecha) Aedes aegypti. Bajo las mismas condiciones de cría, Ae. aegypti puede ser sexado en la etapa pupal de acuerdo con el tamaño; los machos son significativamente más pequeños que las hembras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Diferenciación de adultos Aedes aegypti masculinos (izquierda) y femeninos (derecha). Los mosquitos machos adultos (izquierda) tienen antenas más tupidas y peludas que la hembra adulta; las flechas rojas indican las antenas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Marcado de rodamina B del mosquito macho. (A) Microscopía de luz; (B) microscopía de fluorescencia. El mosquito de la izquierda no está marcado (alimentado con 10% p/v de sacarosa), mientras que el de la derecha está marcado (alimentado con 0,2% de RhB-sacarosa). Los mosquitos marcados tienen un abdomen rosado visible bajo luz blanca (el mosquito de la derecha en A),que fluorescencia de color naranja brillante bajo microscopía de fluorescencia (B). Barras de escala = 5 mm. Abreviatura: RhB = Rodamina B. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Espermataca femenina inseminada y no inseminada bajo un microscopio de luz compuesto (aumento de 100x). El estado de inseminación de un mosquito hembra se puede determinar observando sus espermatozoides bajo un microscopio de luz compuesta. Un mosquito hembra inseminado contendrá al menos una espermatozoide llena, mientras que los tres espermatozoides de un mosquito hembra no inseminado estarán vacíos. Los espermatozoides móviles en forma de hilo serán visibles en una espermateca llena bajo un microscopio de luz compuesta. Barra de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Espermateca de mosquito hembra inseminada con fluidos seminales bajo un microscopio estereoscópico de fluorescencia. (A) Espermateca marcado con RhB y (B) espermatozoides no marcados inseminados con fluidos seminales marcados con RhB fluorescencia naranja brillante bajo microscopía de fluorescencia. Barras de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Número de hembras de tipo salvaje inseminadas por los machos endogámicos o cruzados en los triplicados experimentales con marcado recíproco. (A) Los machos endogámicos fueron marcados con RhB mientras que los machos cruzados no estaban marcados. (B) Los machos cruzados fueron marcados con RhB, mientras que los machos endogámicos no fueron marcados. Se observó que un mayor número de hembras se apareaban con machos cruzados, independientemente de su estado de marcado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Proporción de hembras inseminadas apareadas con machos endogámicos o cruzados en las 3 réplicas experimentales. Para cada réplica experimental, hay un porcentaje significativamente mayor de hembras apareadas con los machos cruzados (P ≤ 0.05, Mann-Whitney U-test). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Video 1: Disección de Aedes aegypti femenino para espermatozoides bajo un microscopio estereoscópico de luz. Haga clic aquí para descargar este video. 

	♀ x Consanguí (RhB) ♂ a	♀ x Outcross (sin marcar) ♂ b	♀ x Consangutiva (sin marcar) ♂ c	♀ x Outcross (RhB) ♂ d	Tasa general de inseminación (a+b+c+d/120)
Replicar 1	11	35	7	40	77.5% (93/120)
Replicar 2	6	29	8	31	61.7% (74/120)
Replicar 3	6	36	6	33	67.5% (81/120)

Tabla 1: Número de hembras apareadas con machos endogámicos y no marcados con RhB-Sg aedes aegypti endogámicos y cruzados. Se utilizó un número total de 120 hembras en cada réplica.

	Porcentaje de mujeres inseminadas
	Machos endogámicos	Superar a los machos
Replicar 1	19% (18/93)	81% (75/93)
Replicar 2	19% (14/74)	81% (60/74)
Replicar 3	15% (12/81)	85% (69/81)

Tabla 2: Porcentaje de hembras inseminadas apareadas con wAlbB-Sg Aedes aegypti endogámicos y machos cruzados.

Figura suplementaria S1: Comparación del flujo de trabajo para el ensayo de competitividad de apareamiento convencional y basado en RhB. En comparación con el ensayo de competitividad de apareamiento convencional, el flujo de trabajo simplificado y acortado para el ensayo de competitividad de apareamiento basado en RhB reduce significativamente la duración experimental. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria S2: Curvas de supervivencia de Kaplan Meier de Aedes aegypti adulto masculino durante y después de la alimentación con 0,2% y 0,4% de rodamina B-alimentación con sacarosa. Porcentaje de supervivencia de (A) machos de tipo salvaje y (B) wAlbB-Sg Ae. aegypti durante y después de tres días de alimentación con 0,2% y 0,4% de RhB-sacarosa, en comparación con los controles que fueron alimentados con sacarosa solamente. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria S1: Tasa de inseminación de hembras en una jaula de W 60 cm x D 60 cm x H 60 cm (proporción de 10 hembras a 20 machos) en puntos de tiempo de 1, 2 y 3 h. Haga clic aquí para descargar esta tabla. 

Discusión

El marcado se usa comúnmente en la investigación entomológica para estudiar la dinámica de la población de insectos, la dispersión, el comportamiento y la biología del apareamiento²⁶. En los programas SIT e IIT, el marcado se realiza para diferenciar la cepa liberadora de la población de campo para estudiar su dispersión y optimizar la relación de liberación. Los métodos de marcado utilizados incluyen el marcado genético^27,28,la incorporación de isótopos en los alimentos larvales^29,30,polvo fluorescente³¹y colorante^32. Para la supresión de las poblaciones de mosquitos utilizando SIT o IIT, donde la aptitud de apareamiento masculino es un componente crítico, se han utilizado colorantes fluorescentes como marcadores para estudiar la biología del apareamiento de mosquitos^18,19.

Convencionalmente, la evaluación de la competitividad del apareamiento masculino de la cepa de liberación se ha evaluado utilizando ensayos de fertilidad femenina. Sin embargo, este ensayo requiere mucho tiempo y mano de obra debido a los procesos experimentales posteriores al apareamiento(Figura suplementaria S1). Estos procesos incluyen la alimentación con sangre de las hembras, la recolección de huevos, la eclosión de los huevos y la enumeración de la proporción de huevos eclosionados para determinar la viabilidad del huevo. En promedio, este ensayo requiere 30 horas-hombre y dos semanas de trabajo experimental (desde la creación de las jaulas de ensayo de competitividad) hasta la determinación final de la competitividad del apareamiento de los machos.

su artículo presenta el uso de un tinte fluorescente, RhB, (alimentado como 0.2% RhB-sacarosa a los mosquitos, Figura Suplementaria S2)para medir directamente las interacciones de apareamiento entre las hembras y los machos marcados con RhB. Si bien este protocolo requiere un microscopio estereoscópico de fluorescencia, evita la necesidad de realizar los procedimientos experimentales que consumen mucho tiempo mencionados anteriormente. En promedio, este ensayo basado en RhB requiere aproximadamente 10 horas-hombre y aproximadamente un día para obtener datos equivalentes a los de los ensayos de fertilidad femenina. Este >90% de ahorro de tiempo permite a los investigadores investigadores realizar múltiples réplicas experimentales, proporcionando una validación más robusta de la aptitud de apareamiento masculino. Además, este ensayo se puede utilizar para comparar la competitividad del apareamiento entre dos líneas de mosquitos estériles o infectados con Wolbachia.

Este tipo de comparación no es posible con los ensayos convencionales de fertilidad femenina, ya que las hembras producirían óvulos no viables al aparearse con ambas líneas.  No obstante, cualquier apareamiento mixto en el experimento resultará en un sesgo hacia la población marcada, ya que es difícil identificar espermatozoides no marcados en espermatozoides femeninos que contienen líquido seminal de machos marcados con RhB y no marcados. Una conclusión similar se hizo en un estudio que evaluó la competitividad del apareamiento de Anopheles gambiae utilizando RhB^{18, por}el cual se encontró que una mayor proporción de hembras en el ensayo de apareamiento estaban apareadas por machos marcados. Como la poliandria es más probable que ocurra en hembras que previamente habían participado en un apareamiento interrumpido^33,la probabilidad de que esto ocurra se redujo en este estudio al usar menos mosquitos (20 machos a 10 hembras) en un mayor volumen de jaula (0.216 m³⁾en estos experimentos.

Los resultados no mostraron ningún sesgo hacia la población marcada con RhB, lo que indica que el apareamiento mixto fue limitado. En resumen, la incorporación de RhB para marcar a los machos en un ensayo de competitividad de apareamiento es una forma económica y rápida de evaluar la aptitud de apareamiento de los machos. Este método también permite la comparación directa de la competitividad del apareamiento entre machos expuestos a diferentes dosis de irradiación, criados en diferentes regímenes de cría, o aquellos infectados con diferentes cepas de Wolbachia,lo que lo convierte en una herramienta valiosa para la evaluación de la aptitud de apareamiento masculino para cualquier programa de supresión de la población de mosquitos basado en la liberación de machos.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Compound light microscope	Olympus	CX23	To score for spermathecae insemination
Dissection forceps	Bioquip	Rubis forceps (4524)
Fluorescence stereo-light microscope with RFP1 filter	Olympus	SZX16	To check for Rhodamine B fluorescence signal
Mosquito cages	Bugdorm	4F3030	W 32.5 cm x D 32.5 cm x H 32.5 cm; mesh size of 150 x 150; 160 µm aperture For holding of male and female adult mosquitoes prior to mating assay
6M610	W 60 cm x D 60 cm x H 60 cm; mesh size of 44 x 32; 650 µm aperture For mating competitiveness assay
Mosquito netting			150 x 150, 160 µm aperture
Rhodamine B	Sigma Aldrich	R6626	≥95% (HPLC)
Stereo-light microscope	Olympus	SZ61	For spermathecae dissection
Sucrose	MP Biomedicals	SKU 029047138	Food grade
TetraMin tropical flakes	Tetra	77101	Fish food for feeding larvae