형광염염을 사용하여 로다민 B, 남성 Aedes aegypti 모기에서 짝짓기 경쟁력을 연구하기 위해

요약

여기서는 형광염을 마커로 사용하여 남성 Aedes aegypti의 짝짓기 경쟁력을 연구하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 여성 모기는 교화를 위해 표시되고 표시되지 않은 수컷 모두에 노출됩니다. 후 짝짓기, 그들의 정자는 그들의 짝짓기 파트너를 결정하기 위하여 형광 현미경의 밑에 검토됩니다.

초록

멸균 또는 호환되지 않는 곤충 기술 기반 인구 억제 프로그램의 성공은 야생 형 여성을 위해 경쟁하고 대상 인구에서 멸균을 유도하는 출시 된 남성의 능력에 달려 있습니다. 따라서, 남성 짝짓기 경쟁력의 실험실 평가는 필드 릴리스 전에 방출 균주의 체력을 평가하는 데 필수적이다. 종래, 이러한 분석은 동시에 2세트의 남성(야생형 및 방출 균주)에 노출된 후 여성에 의해 생성된 실행 가능한 계란의 비율을 결정함으로써 수행된다. 그러나, 이 과정은 계란 생산을 위해 암컷을 먼저 혈액 공급하고 부화한 계란을 부화하고 예신하여 계란 생존 가능성을 결정할 필요성으로 인해 시간이 많이 걸리고 힘들다.

더욱이, 이 방법은 야생형 암컷 모기가 둘 다와 짝짓기 시 실행 불가능한 계란을 생성하기 때문에 두 개의 멸균 또는 Wolbachia-감염된모기장 사이의 경쟁력의 정도를 분별할 수 없습니다. 이러한 한계를 우회하기 위해, 이 논문은 형광염, 로다민 B(RhB)를 사용하여 실험실 환경에서 남성 모기 결합 경쟁력을 측정하는 보다 직접적인 방법을 설명하며, 이는 RhB를 함유한 자당 용액으로 수컷을 공급하는 데 사용될 수 있다. 짝짓기 분석 후, 여성의 정자에 형광 정자의 존재는 그녀의 짝짓기 파트너를 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법은 비용 효율적이며 실험 시간을 90 % 줄이며 두 개의 멸균 또는 Wolbachia-infected 라인 사이의 짝짓기 적합성을 비교할 수 있습니다.

서문

Aedes 모기 집단의 억제를 위한 멸균 또는 호환되지 않는 남성의 사육 및 방출은 현재 뎅기열 및 기타 Aedes-borne질병^1의발병을 방지하기 위한 새로운 도구로 현장에서 평가되고 있다. 현재 현장 시험 중인 남성 방출 억제 전략은 유전적 방법^2,조사(멸균 곤충 기술, SIT)^3,내시생물학적 박테리아 울바키아(곤충 호환 기술, IIT)^4,또는 후자의 두 기술의 조합을 포함한다^5,6. 이러한 접근의 성공은 주로 야생 형 남성을 능가하고 교화를 확보하기 위해 여성을 추구하는 출시 된 남성의 능력에 달려 있습니다. 그렇지 않으면, 멸균은 대상 집단에서 유도될 수 없다.

고전SIT 프로그램에서, 예를 들어, 남성 짝짓기 적합성은 조사량^7,8,9,대량 사육 프로토콜 및 식민지내 근친교의^{정도(10,11,12,13,14)와}같은 요인에 의해 영향을 받을 수 있다. 또한 짝짓기 경쟁력에 대한 연구는 벡터 제어 전략을 알리는 데 사용할 수있는 모기 짝짓기 행동에 대한 중요한 지식을 제공 할 수 있습니다.

SIT 및 IIT에서, 남성 모기의 짝짓기 경쟁력은 일반적으로 케이지^{8,11,15,16에서}야생 형 여성을 위해 경쟁하는 야생 형 및 방출 균주를 허용함으로써 평가된다. 여성은 그 때 혈액을 공급하고 그들의 계란은 생존가능성을 결정하기 위하여 부화됩니다. 낮은 해치 비율로 실행 가능한 계란 또는 계란을 낳는 암컷은 방출 긴장 수컷과 짝짓기 한 것으로 가정됩니다, 실행 가능한 계란을 생성하는 암컷은 야생 형 수컷과 짝짓기 한 것으로 가정되는 동안. 짝짓기 경쟁력은 튀김 지수^17로계산됩니다. 불행히도, 이 방법은 자원 집약적이고 시간이 많이 소요되며, 전체 튀김 지수는 계란 취급 불량 및 과다 건조와 같은 계란 생존가능성에 영향을 미치는 외부 혼동 요인에 의해 영향을 받을 수 있으며, 그 후 인위적으로 낮은 튀김 지수로 이어질 수 있는 호환성 크로스의 낮은 해치 속도를 초래할 수 있다.

더욱이, 이 방법은 Wolbachia의 다른 긴장에 감염되거나 조사의 다른 복용량에 드러나는 Aedes 모기 사이 짝짓기 경쟁력의 직접적인 비교를 허용하지 않습니다. 따라서 이러한 문제를 해결하기 위해 보다 직접적인 방법이 필요합니다. 최근 연구^18,19는 형광염, RhB를 사용하여 남성 모기의 정액을 표시하는 효과를 입증했습니다. 표시된 정액은 성공적인 짝짓기 시 여성 모기의 정자에 옮겨져 저장되므로 표시된 수컷과의 여성 짝짓기 상호 작용을 직접 측정할 수 있습니다. 로다민 B는 곤충을 포함한 동물의 생태 및 행동 연구를 위한 바이오마커로서 일반적으로 사용되는 티올 반응성 플루오론 염료이다20. 모기 연구를 위해, RhB는 용존 RhB 분말^{18,19,21,22,23,24를}포함하는 설탕 또는 꿀 수를 공급하여 도입된다. 섭취시 RhB 염료는 단백질에 결합하여 형광원 아래에서 밝은 주황색을 형광하는 붉은 분홍색 얼룩으로 신체 조직을 염색합니다.

강한 형광 신호 및 마킹의 안정성, 곤충 정액을 얼룩화하는 능력과 결합, 짝짓기 연구를위한 여성 곤충의 정자 저장 기관에 표시 된 정액유체의 전송의 모니터링을 허용^18,19,21,24. 남성 짝짓기 경쟁력 분석에서 RhB의 사용은 표시 및 표시가없는 남성과 여성의 짝짓기 상호 작용을 직접 측정 할 뿐만 아니라 일반적으로 약 10 ~ 14 일이 필요한 계란 생존가능성을 결정하는 과정을 없애기 때문에 24 시간 이내에 결과를 얻을 수 있습니다. 게다가, 이 방법은 여성 모기가 소변을 기전에 혈액 을 공급하거나 정지하지 않을 때 데이터의 잠재적인 손실을 극복합니다. 이것은 특히 중요한 반 필드 예심에서, 여성 모기가 배낭 또는 기계적인 흡인기를 사용하여 결합 후 수집 도중 손상과 죽음을 경향이 있기 때문에. 여성 다산을 사용하는 현재의 한계를 해결하기 위해 RhB 염색을 사용하여 남성 모기 결합 경쟁력을 직접 측정하는 대체 방법을 제시합니다. 이 방법은 워크플로우를 단순화하고 실험 시간을 약 2주에서 1일로 단축하여 더 많은 실험 복제를 수행하고 두 개의 방출 균주 간의 비교를 허용합니다. 이 프로토콜은 남성 방출 기반 모기 인구 억제 프로그램에 착수하는 실험실에 적합하며 일상적인 품질 관리 및 변형 평가에 사용될 수 있습니다.

프로토콜

1. 모기 사육

1. 12 시간 :12 h 빛 : 어두운 사이클의 광기간으로, 27 ± 1 °C 및 75-80 %의 상대 습도의 표준 곤충 조건하에서 모든 모기 사육 및 남성 짝짓기 경쟁력 분석.
2. 이 논문에 설명된 방법론에서 쉽게 참조할 수 있는 A 및 Set B로 경쟁하는 남성의 두 세트를 지정합니다. 표준화 된 조건에서 모기를 후면하여 분석 중에 체력을 공정하게 비교하십시오. 2L의 물에 500 유충의 애벌레 밀도로 모기를 후면 접지 생선 식품 분말 광고 리비툼으로공급하십시오.
   참고 : 대표 결과의 생성을 위해, 세트 A와 세트 B는 Wolbachia-감염된 Ae의 근친교및 아웃 남성이었다. 아이집트,각각.
3. pupal 단계에서 성 수컷과 암컷 모기는 150 x 150 및 160 μm 조리개 크기의 메쉬 크기로 32.5cm x D 32.5cm x H 32.5cm의 케이지 (재료 의 표참조)에 별도로 함유하고 있습니다. 10% 자당 용액으로 모든 성인 모기를 유지합니다.

2. 수컷 과 암컷 모기의 준비

1. 성별 그들의 크기 차이에 따라 pupal 단계에서 남성과 여성 모기 (수 컷 pupae 여성 pupae 보다 작은 되 고)(그림 1).
2. 각 모기 세트(A 또는 세트 B 세트)에 대해 100마리의 수컷 새끼를 자당 먹이주기 또는 RhB-자당 먹이주기위해 라벨이 부착된 케이지로 옮겨넣습니다.
3. 암컷 새끼를 케이지 당 40-50의 작은 배치에 놓습니다. 이마고의 출현시, 수컷 모기의 존재를 케이지를 확인하십시오.
   참고 : 성인 남성 모기는 여성보다 작고 덥고 털이 많은 안테나(그림 2)가있습니다. 짝짓기 경쟁력 에세이에 처녀 암컷 모기만 사용하십시오. 사전 수정된 여성을 사용하면 모든 결과 데이터가 무효화됩니다. 따라서, 극단적 인주의는 강아지 단계에서 섹스하는 동안 취해야한다. 수컷 모기로 오염된 케이지에서 암컷 모기를 사용하지 마십시오. 여성의 여분의 케이지를 준비해야합니다.

3. 0.2 % RhB의 준비 - 자당 솔루션

참고: RhB는 건조한 형태의 녹색 분말이며 용액이 빨갛게 분홍색입니다. 표준 개인 보호 장비(PPE: 실험실 보호 가운, 니트릴 장갑 및 눈 보호)는 이 화학 물질을 취급할 때 착용해야 합니다. 흡입을 피하기 위해 연기 후드에 RhB 분말의 무게를 측정합니다.

1. 0.2% w/v RhB-자당 용액을 준비하려면 100mL당 100mL당 200 mg의 RhB 파우더를 10% w/v/자당 용액에 용해하십시오. 잘 섞어 모든 파우더가 용해되도록 합니다.
   참고: RhB가 빛에 민감하기 때문에 호박병을 사용하거나 투명 병을 알루미늄 호일로 완전히 감쌉니다.

4. 수컷 모기 먹이주기

참고: RhB-자당 공급 최적화의 데이터는 보충 재료, 섹션 1에제시됩니다.

1. 심지와 함께 설탕 피더 병 20병을 준비합니다. 10피더 병에 10m L의 10mL를 추가하고 다른 10 개의 피더 병에 0.2 % RhB-자당 용액 10 mL을 추가하십시오 (호박 병을 사용하거나 알루미늄 호일로 병을 감습니다).
2. 피더 병을 2.2 단계와 2.3 단계로 준비한 각 수컷 케이지(케이지당 5병)에 놓습니다. 결합 실험 전에 남성 모기가 3 일 동안 먹이를 허용합니다.

5. 남성 모기의 RhB 형광 검사

1. RB-자당 먹이 수컷 모기를 흡면하고, 모든 RhB-자당 먹이 수컷 모기가 성공적으로 RhB로 표시되었는지 확인하기 위하여 형광 스테레오 현미경의 밑에 그(것)들을 관찰합니다.
2. 수은 버너 램프와 스테레오 현미경을 켭니다. 수은 버너 램프의 광원이 10분 동안 안정화되도록 합니다. 적색 형광 단백질 1 (RFP1)(흥분 파장 540 nm, 방출 파장 625 nm)용 형광 필터를 설정합니다.
3. 한 번에 소량의 모기(4~5개)를 구강 흡인기의 유리 튜브에 흡입합니다. 유리 튜브를 통해 형광 스테레오 현미경 하에서 남성 모기의 신체를 관찰하십시오. 실험에서 RhB로 표시되지 않은 수컷 모기를 제외합니다.
   참고: RhB로 표시된 남성 모기의 복부는 백색광(그림3A)아래에 분홍색으로 나타나고 형광등(그림3B)에서밝은 주황색으로 빛납니다.
4. 전송 그물 (메쉬 크기 150 x 150, 160 μm 조리개)로 고정 12 종이 컵에 남성 모기를 설정; 각각 10개의 자당먹이 수컷 모기를 가진 6컵, 다른 6컵은 각각 10개의 RhB-자당 먹이 수컷 모기를 가지고 있습니다. 세트 B 수컷 모기에 대한이 단계를 반복합니다.

6. 짝짓기 경쟁력 분석

1. 결합 분석용 메쉬 사이즈 44 x 32, 650 μm 조리개12W 60cm x D 60cm X H 60cm 케이지를 설치합니다. 6개의 케이지 각각에는 10 세트 A(RhB 표시) 수컷 모기, 10 세트 B(표시가 없는) 수컷 모기 및 10개의 처녀 야생형 암컷 모기가 포함됩니다. 다른 여섯 케이지에는 10 세트 A (표시가 없는) 수컷 모기, 10 세트 B (RhB 표시) 수컷 모기 및 10 처녀 야생 형 여성 모기가 포함됩니다. 이 케이지에 레이블을 지정하여 두 결합 조합을 명확하게 구분합니다.
   참고 : 경험에 따라, 60cm x 60cm x 60cm 케이지는 작은 케이지가 혼합 짝짓기를 장려 할 수 있기 때문에 짝짓기 분석에 사용되었다.
2. 6.1 단계에서 라벨에 따라 짝짓기 케이지에 5.4 단계에서 준비된 각 수컷 컵을 놓습니다. 그물망을 제거하고 컵을 부드럽게 눌러 수컷을 컵에서 내쫓습니다. 조심스럽게 종이 컵과 케이지에서 그물을 제거하여 모기가 케이지에서 탈출하지 않도록합니다. 남성 모기가 짝짓기 케이지에 적어도 한 시간 동안 적응하도록 허용하십시오.
3. 구강 흡구를 사용하여 처녀 야생 형 암컷 모기를 12 개의 종이 컵으로 옮기고 각 컵에는 10 개의 모기가 들어 있습니다.
4. 수컷 모기에 대한 적응 기간 후, 모든 짝짓기 케이지에 여성의 한 컵을 전송하고 그물을 제거합니다. 컵을 부드럽게 휘저어 남은 암컷 모기를 컵 밖으로 내보냅니다. 조심스럽게 종이 컵과 케이지에서 그물을 제거하여 모기가 케이지에서 탈출하지 않도록합니다.
5. 짝짓기를 3 시간 동안 수행 할 수 있습니다.
   참고 : 권장 짝짓기 기간은 야생 형 Ae. aegypti의사전 관찰을 통해 결정되었다. 60cm x 60cm x 60cm x 60cm 케이지에서 개최되는 암컷 10명과 남성 20명과 관련된 실험에서 여성 수정은 3h(보충재료, 섹션 2)로달성되었다. 동요가 중단되고 혼합 짝짓기로 이어질 수 있으므로이 기간 동안 케이지를 방해하지 마십시오. 혼합 짝짓기 (여성이 표시되고 표시되지 않은 수컷과 짝짓기한 곳)는 형광 현미경의 밑에 RHB 표시되지 않은 정액에서 표시되지 않은 정액을 구별하기 어렵기 때문에 RhB 표시수 남성을 향한 편견을 초래합니다.
6. 짝짓기 실험을 종료하려면 기계식 흡구기를 사용하여 각 케이지에서 모든 모기를 제거합니다. 감기는 적어도 5 분 동안 얼음에 모기를 마취. 모기가 완전히 마취되면 여성 모기를 부드럽게 집어 들고 그물망 (메쉬 크기 150 x 150, 160 μm 조리개)으로 고정 된 별도의 종이 컵에 보관하십시오. 매팅 케이지에서 종이 컵에 각 라벨을 전송하여 종이 컵에 레이블을 지정합니다.
   참고: 이 시점에서 실험을 일시 중지하고 10% 자당 용액으로 여성을 유지할 수 있습니다. RhB 표시 정액 액체는 적어도 일주일 동안 여성 정자 안쪽에 안정한 남아 있을 것입니다. 죽은 표본과 건조 된 표본이 해부하기 어렵기 때문에 해부하기 전에 암컷을 살리는 것이 가장 좋습니다.
7. 여성 정자를 채점하기 위해, 감기는 스테레오 현미경(비디오 1)의밑에 해부하기 전에 적어도 5 분 동안 얼음에 여자 모기를 마취합니다. 그들의 수정 상태에 대한 복합 광 현미경 (배율 100x) 하에서 정자를 검사(도 4). 수정된 개별을 위해, 정자가 RFP1 필터 및 카메라 화상 진찰 시스템을 갖춘 형광 스테레오 현미경의 밑에 그(것)들을 검사해서 RhB 표시정액을 포함하는지 여부를 결정합니다.
   참고: 부착된 이미징 시스템과 형광 스테레오 현미경을 사용하는 경우, 검출 감도를 높이기 위해 장시간 노출 시간(5 s)을 활용하는 것이 좋습니다. 여성 모기가 표시된 수컷과 짝짓기한 경우, 그녀의 정자는 밝은 주황색(그림 5A)을형광합니다. 그러나, 여성 모기가 표시가없는 남성과 짝짓기한 경우, 그녀의 수정 된 정자는 형광하지 않습니다(그림 5B).

7. RhB 폐기물 처리

1. 수성 RhB 폐기물을 활성 탄^25로 처리한 후 일반 폐수로 배출합니다. 고체 RhB 폐기물(RhB, 종이 타월, RhB에 담근 심지)을 화학 폐기물로 폐기하십시오. RhB 폐기물을 처리할 때 표준 PPE를 DON.

결과

w AlbB-SG는 울바키아의 wAlbB 균주에 안정적으로 감염된 현지화된 (싱가포르) Ae. aegypti 라인입니다. 이 논문에 설명된 프로토콜을 사용하여, 우리는 근친교인의 남성 짝짓기 경쟁력과 wAlbB-SG의 교차 선을 평가하여 근친 교배가 남성 짝짓기 피트니스의 손실을 초래하는지 여부를 결정했습니다. 근친선은 곤충에서 11 세대 동안 유지되었고, 교차선은 야생 형 남성 Ae와 암컷을 백교차하여 생성되었습니다. 아이집트. 근친교와 교차선에서 온 수컷들은 야생형 야생형 암컷 Ae. aegypti와짝짓기 위해 서로 경쟁했다. 짝짓기 경쟁력 분석은 삼중에서 수행되었다.

결과는 RhB가 여성 수정에 대한 데이터가 RhB-자당 공급 수컷(표 1 및 도 6)과짝짓기쪽으로 편향되지 않았기 때문에 남성의 적합성에 영향을 미치지 않았으며, 우리는 남성의 짝짓기 적합성에 영향을 미치지 않기 때문에, 우리는 2 배선(표)과 2배의 결합된 여성의 비율을 기준으로 데이터를 분석하기 위해 진행했다. 실험적인 삼중을 가로지르는 결과는 일관적이었습니다. 세 가지 복제물(P ≤ 0.05, Mann-Whitney U-test)에서 근친 근친 남성과 짝을 이었던 여성의 비율이 훨씬 더 높았습니다. 이러한 결과 실험실에서 근친 교배의 여러 세대 후 남성 짝짓기 피트 니스에 잠재적인 손실을 제안.

그림 1: 남성 (왼쪽)과 여성 (오른쪽) Aedes aegypti pupae의 측면 보기. 같은 양육 조건에서, Ae. aegypti 는 크기에 따라 pupal 단계에서 섹스 될 수 있습니다. 남성은 여성보다 현저히 작습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 남성 (왼쪽)과 여성 (오른쪽) Aedes aegypti 성인의 차별화. 성인 남성 모기 (왼쪽)는 성인 여성보다 덥고 털이 많은 안테나를 가지고; 빨간색 화살표는 안테나를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 3: 남성 모기의 로다민 B 표시. (A)가벼운 현미경 검사법; (B)형광 현미경 검사. 왼쪽의 모기는 표시되지 않습니다 (10 % w / v 자당으로 공급), 오른쪽에있는 모기는 표시되어 있습니다 (0.2 % RhB-자당으로 공급). 표시된 모기에는 백색광(A의오른쪽에 있는 모기)의 눈에 보이는 분홍색 복부가 있는데, 이는 형광 현미경 검사법(B)에서 밝은 주황색을 형광합니다. 스케일 바 = 5mm. 약어: RhB = 로다민 B. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 4: 화합물 광 현미경 (100x 배율)에서 수정 및 비 수정 된 여성 정자. 여성 모기의 수정 상태는 복합 광 현미경의 밑에 그것의 정자를 관찰하여 결정될 수 있습니다. 수정된 여성 모기는 적어도 하나의 채워진 정자를 포함하고 비 수정되지 않은 여성 모기의 세 정자는 모두 비어있을 것입니다. 스레드 와 같은, motile 정자는 복합 빛 현미경의 밑에 채워진 spermatheca에서 보일 것입니다. 스케일 바 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 형광 스테레오 현미경의 밑에 정액액체로 수정된 여성 모기 정자. (A)RHB 표시 및(B)표시되지 않은 정자는 형광 현미경의 밑에 밝은 주황색을 형광하게 합니다. 스케일 바 = 100 μm. 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.

그림 6: 상호표시가있는 실험 적 삼중 에서 근친 또는 이상 남성에 의해 수정 된 야생 형 여성의 수. (A)근친목 수컷은 외향적 인 수컷이 표시되지 않은 동안 RhB로 표시되었다. (B) 근친 근친 수컷이 표시되지 않은 동안 외진 수컷은 RhB로 표시되었다. 여성의 높은 수는 그들의 표시 상태에 관계없이 아웃 크로스 남성과 짝짓기 것으로 관찰되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7: 3 실험 복제에서 근친교 또는 이상 남성과 결합 된 수정 된 여성의 비율. 각 실험 복제에 대 한, 아웃 크로스 수컷과 결합 된 여성의 상당히 높은 비율이 있다 (P ≤ 0.05, Mann-Whitney U-테스트). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

비디오 1: 가벼운 스테레오 현미경으로 정자에 대한 여성 Aedes aegypti의 해부. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. 

	♀ x 인드레드(RhB)♂	♀ x 아웃크로스(표시가 없는) ♂ b	♀ x 인bred (표시가 없는) ♂ c	♀ x 아웃크로스(RhB) ♂ d	전체 수정 비율 (a+b+c+d/120)
복제 1	11	35	7	40	77.5% (93/120)
복제 2	6	29	8	31	61.7% (74/120)
복제 3	6	36	6	33	67.5% (81/120)

표 1: RhB 마크와 표시가 없는 wAlbB-Sg Aedes aegypti 근친교 및 아웃 수컷과 짝짓기 된 여성의 수. 총 120명의 암컷이 각 복제에 사용되었습니다.

	% 여성 수정
	근친 남성	아웃 크로스 남성
복제 1	19% (18/93)	81% (75/93)
복제 2	19% (14/74)	81% (60/74)
복제 3	15% (12/81)	85% (69/81)

표 2: wAlbB-Sg Aedes aegypti 근친교 및 아웃 수컷과 짝을 이긴 수정된 여성의 비율.

보충 도서 S1: RhB 기반 및 기존 짝짓기 경쟁력 분석에 대한 워크플로우 비교. 기존의 짝짓기 경쟁력 분석과 비교하여 RhB 기반 결합 경쟁력 분석의 단순화 및 단축 워크플로우가 실험 기간을 크게 줄입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 도면 S2: 카플란 마이어 생존 곡선 남성 성인 Aedes aegypti 동안 및 0.2% 및 0.4% 로다민 B-자당 먹이. (A)수컷 야생형 및(B) wAlbB-Sg Ae. aegypti의 생존율은 3일 동안 과 후에 0.2%와 0.4%의 RhB-자당에 대한 수당만 공급된 대조군과 비교하였다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 S1: W 60cm x D 60cm x H 60 cm 케이지에서 여성의 수정 속도 (10 여성에서 20 남성) 1-, 2, 3 h 시간 포인트. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. 

토론

마킹은 곤충 인구 역학, 분산, 행동 및 짝짓기^{생물학(26)을}연구하기 위해 곤충 연구에 일반적으로 사용된다. SIT 및 IIT 프로그램에서는 방출 균주를 현장 인구와 차별화하여 분산을 연구하고 방출 비율을 최적화하기 위해 마킹이 수행됩니다. 사용되는 마킹 방법에는 유전^{마킹(27,28)이}포함되며, 애벌레^{식품(29,30,}형광먼지 31) 및 염료(32)에 동위원소를 통합한다. 남성 짝짓기 피트니스가 중요한 성분인 SIT 또는 IIT를 사용하여 모기 집단을 억제하기 위해 형광염료는 모기 결합 생물학^18,19를연구하기 위한 마커로 사용되었습니다.

종래, 방출 균주의 남성 짝짓기 경쟁력의 평가는 여성 불임 검사를 사용하여 평가되었다. 그러나, 이 분석은 다운스트림 실험 프로세스 후결합(보충 도서 S1)으로인해 시간이 많이 걸리고 노동 집약적입니다. 이 프로세스는 여성의 혈액 공급, 계란 수집, 계란의 부화, 계란 생존 가능성을 결정하기 위해 부화 계란의 비율의 열거를 포함한다. 평균적으로, 이 분석법은 30시간의 인력과 2주간의 실험적 작업(경쟁력 분석 케이지 설정부터 시작)이 남성 짝짓기 경쟁력의 최종 결정에 필요합니다.

그의 논문은 형광염, RhB의 사용을 제시, RhB, (로 공급 0.2% RhB-자당 모기에, 보충 도도 S2)여성과 RhB 표시 남성 사이의 짝짓기 상호 작용을 직접 측정하기 위해. 이 프로토콜은 형광 스테레오 현미경을 필요로하지만, 위에서 언급 한 시간이 많이 걸리는 실험 절차를 수행 할 필요성을 없애. 평균적으로, 이 RhB 기지를 둔 분석은 여성 불임 분석에서 그것과 동등한 데이터를 얻기 위하여 대략 10 명의 남자 시간 및 대략 하루가 요구합니다. 이 >90% 시간 절약 연구원 여러 실험 복제를 수행 할 수 있습니다., 남성 짝짓기 피트 니스의 더 강력한 유효성 검사를 제공. 또한, 이러한 분석은 두 개의 멸균 또는 울바키아 감염 모기 라인 사이의 짝짓기 경쟁력을 비교하는 데 사용될 수 있다.

비교의 이 모형은 전통적인 여성 불임 assays와 함께 가능하지 않습니다, 암컷은 그 같은 둘 다 선과 짝짓기때 실행 불가능한 계란을 산출할 것이기 때문에.  그럼에도 불구하고, 실험에 있는 어떤 혼합 결합든지 RhB 표시및 표시가 없는 남성 둘 다에서 정액을 포함하는 여성 spermathecae에 있는 표시되지 않은 정액을 확인하는 것은 어렵기 때문에 표시된 인구에 대한 편견귀착될 것입니다. 유사한 결론은 RhB^18을사용하여 Anopheles 감비아의 짝짓기 경쟁력을 평가하는 연구에서 이루어졌으며, 이에 따라 짝짓기 분석에서 여성의 비율이 더 큰 것은 표시된 남성에 의해 결합된 것으로 나타났습니다. 폴리안드리가 이전에 중단된^{짝짓기(33)에}종사했던 여성에서 발생할 가능성이 높기 때문에, 이러한 실험에서 더 큰 케이지 부피(0.216^m3)에서더 적은 모기(20~10명의 암컷)를 사용하여 이 연구에서 발생할 확률이 감소하였다.

결과는 혼합 짝짓기가 제한되었다는 것을 나타내는 RhB 표시 인구에 대한 편견을 보여주지 않았습니다. 요약하자면, 짝짓기 경쟁력 분석에서 남성을 표시하는 RhB의 통합은 남성 짝짓기 체력을 평가하는 경제적이고 빠른 방법입니다. 이 방법은 또한 다른 조사 복용량에 노출된 남성, 다른 양육 정권에서 자란 남성, 또는 Wolbachia의다른 균주에 감염된 남성 간의 짝짓기 경쟁력을 직접 비교할 수 있게 하여 남성 방출 기반 모기 인구 억제 프로그램에 대한 남성 짝짓기 적합성 평가를 위한 귀중한 도구입니다.

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Name	Company	Catalog Number	Comments
Compound light microscope	Olympus	CX23	To score for spermathecae insemination
Dissection forceps	Bioquip	Rubis forceps (4524)
Fluorescence stereo-light microscope with RFP1 filter	Olympus	SZX16	To check for Rhodamine B fluorescence signal
Mosquito cages	Bugdorm	4F3030	W 32.5 cm x D 32.5 cm x H 32.5 cm; mesh size of 150 x 150; 160 µm aperture For holding of male and female adult mosquitoes prior to mating assay
6M610	W 60 cm x D 60 cm x H 60 cm; mesh size of 44 x 32; 650 µm aperture For mating competitiveness assay
Mosquito netting			150 x 150, 160 µm aperture
Rhodamine B	Sigma Aldrich	R6626	≥95% (HPLC)
Stereo-light microscope	Olympus	SZ61	For spermathecae dissection
Sucrose	MP Biomedicals	SKU 029047138	Food grade
TetraMin tropical flakes	Tetra	77101	Fish food for feeding larvae