Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا، نقوم بوصف سير عمل مترابط لتكسير الصمام الرئوي المورين والضغط عليه وتركيبه وتصويره لتحديد التركيب الإجمالي وهياكل المصفوفة خارج الخلية المحلية.

Abstract

الأسباب الكامنة وراء أمراض صمام القلب ذات الصلة (HVD) بعيد المنال. نماذج مورين توفر أداة ممتازة لدراسة HVD، ومع ذلك، فإن الخبرة الجراحية والآلات اللازمة لتحديد بدقة هيكل وتنظيم عبر جداول طول متعددة قد توقف تقدمها. يقدم هذا العمل وصفا مفصلا لتشريح المورين ، وتلطيخ الكتلة ، ومعالجة العينات ، وإجراءات التصوير المترابط لتصوير صمام القلب على نطاقات طول مختلفة. تم استخدام الضغط عبر الصمام الهيدروستاتيكي للسيطرة على التغايرية الزمنية عن طريق إصلاح كيميائيا تشكيل صمام القلب. تم استخدام التصوير المقطعي المحوسب الدقيق (μCT) لتأكيد هندسة صمام القلب وتوفير مرجع لمعالجة العينة المصب اللازمة للفحص المجهري الإلكتروني لمسح الوجه التسلسلي (SBF-SEM). تم التقاط صور عالية الدقة للمصفوفة خارج الخلية (ECM) وإعادة بنائها لتوفير تمثيل محلي ثلاثي الأبعاد لمؤسستها. ثم تم ربط طرق التصوير μCT و SBF-SEM للتغلب على الاختلاف المكاني عبر الصمام الرئوي. وعلى الرغم من أن العمل المقدم يقتصر على الصمام الرئوي، فإن هذه المنهجية يمكن اعتمادها لوصف التنظيم الهرمي في النظم البيولوجية، وهي محورية بالنسبة لتوصيف الهيكلي عبر مقاييس متعددة الطول.

Introduction

يعمل الصمام الرئوي (PV) على ضمان تدفق الدم أحادي الاتجاه بين البطين الأيمن والشريان الرئوي. ترتبط تشوهات الصمام الرئوي بعدة أشكال من أمراض القلب الخلقية. العلاج الحالي لأمراض صمام القلب الخلقية (HVD) هو إصلاح الصمام أو استبدال الصمام ، والذي يمكن أن يستلزم عمليات جراحية متعددة الغازية طوال عمر المريض1. وقد تم قبول على نطاق واسع أن وظيفة صمام القلب مشتقة من هيكلها، وغالبا ما يشار إليها باسم وظيفة هيكل مترابطة. وبشكل أكثر تحديدا، فإن الخصائص الهندسية والميكاميكية الحيوية للقلب تملي وظيفته. الخواص الميكانيكية، بدورها، يتم تحديدها من خلال تكوين وتنظيم ECM. من خلال تطوير طريقة لتحديد الخصائص الميكانيكية الحيوية لصمامات القلب مورين، يمكن استخدام نماذج الحيوانات المعدلة وراثيا لاستجواب دور ECM على وظيفة صمام القلب والخللالوظيفي 2،3،4،5.

لطالما اعتبر نموذج المورين معيارا للدراسات الجزيئية لأن النماذج المعدلة وراثيا متاحة بسهولة أكبر في الفئران مقارنة بالأنواع الأخرى. نماذج مورين المعدلة وراثيا توفر منصة متعددة للبحث في الأمراض المرتبطة بصمام القلب6. ومع ذلك، كانت الخبرة الجراحية ومتطلبات الأجهزة لتوصيف كل من الهندسة وتنظيم ECM عقبة رئيسية في تقدم أبحاث HVD. توفر البيانات الهستولوجية في الأدب صورة في محتوى مصفوفة صمام القلب المورين خارج الخلية ، ولكن فقط في شكل صور 2D ، وغير قادرين على وصف هندسته المعمارية ثلاثية الأبعاد7و8. بالإضافة إلى ذلك، يكون صمام القلب غير متجانس مكانيا وزمانيا، مما يجعل من الصعب استخلاص استنتاجات عبر التجارب المتعلقة بتنظيم ECM إذا لم يتم إصلاح أخذ العينات والتطابق. لا توفر طرق التوصيف ثلاثي الأبعاد التقليدية، مثل التصوير بالرنين المغناطيسي أو تخطيط صدى القلب ثلاثي الأبعاد، الدقة اللازمة لحل مكونات ECM9و10.

هذا العمل تفاصيل سير العمل المترابطة تماما حيث تم تناول التغايرية الزمنية بسبب دورة القلب عن طريق تحديد تشكيل الكهروضوئية مورين مع الضغط عبر الصمام الهيدروستاتيكي. تم التحكم في التغايرية المكانية بدقة عن طريق أخذ عينات المناطق ذات الاهتمام وتسجيل مجموعات البيانات من طرائق التصوير المختلفة ، وتحديدا μCT وكتلة المسلسل مسح المجهر الإلكتروني ، عبر مقاييس طول مختلفة. وقد اقترح هذا الأسلوب من الكشفية مع μCT لتوجيه أخذ العينات المصب سابقا، ولكن لأن الصمام الرئوي يحمل الاختلاف الزمني، كان هناك حاجة إلى مستوى إضافي من السيطرة على المستوى الجراحي11.

في دراسات الجسم الحي التي تصف الميكانيكا الحيوية صمام القلب مورين متناثرة، وبدلا من ذلك، تعتمد على النماذج الحاسوبية عند وصف سلوك تشوه. ومن الأهمية بمكان أن تكون البيانات المحلية خارج الخلية على مقياس طول نانومتر ذات صلة بهندسة وموقع صمام القلب. وهذا بدوره يوفر توزيعات قابلة للقياس الكمي ورسم خرائط مكانية لبروتينات ECM المساهمة ميكانيكيا ، والتي يمكن استخدامها لتعزيز نماذج صمام القلب الميكانيكية الحيوية الموجودة12و13و14.

Protocol

كان استخدام الحيوانات في هذه الدراسة وفقا للجنة الرعاية والاستخدام المؤسسية لرعاية الحيوانات في مستشفى الأطفال على مستوى البلاد بموجب البروتوكول AR13-00030.

1. استئصال الصمام الرئوي

  1. أوتوكلاف الأدوات اللازمة لتشريح الماوس. وهذا يشمل مقص غرامة، ملقط صغير، المشابك الأوعية الدموية الصغيرة، المشبك تطبيق ملقط، أصحاب microneedle، مقص الربيع، والمسحبات.
  2. تأقلم جميع الفئران لمدة أسبوعين على الأقل قبل العملية. إزالة C57BL/6 الفئران، ما يقرب من 1 سنة من العمر، من أقفاصها ووزنها، ثم القتل الرحيم مع كوكتيل الكيتامين / xylazine (3:1 الكيتامين: xylazine، 0.01 مل لكل غرام) جرعة زائدة.
  3. ضع الماوس في وضع إعادة حثالة الظهر على صينية وأمن أطرافه بشريط لاصق. بمجرد تأمينها، قم بإجراء استئصال الصدر.
    1. كشف القلب عن طريق إزالة أي الأنسجة الدهنية الزائدة واللفافة.
    2. إزالة الأذين الأيمن و perfuse من خلال البطين الأيسر مع محلول ملحي درجة حرارة الغرفة (0.9٪ NaCl). يجب أن يستغرق التشوه حوالي 20 مل فوق 30 s. وهذا يؤدي إلى exsanguination الماوس.
  4. إزالة القلب بأكمله عن طريق قطع الوريد الأجوف متفوقة، الوريد الأجوف أدنى، الشريان الرئوي، والشريان الأورطي. يجب توخي الحذر بشكل خاص للشريان الرئوي. قطع ما يقرب من 2 مم فوق تقاطع البطين الشرياني، وهذا سيكون بمثابة قناة للضغط.
  5. إزالة البطينين الأيسر والأييم لتعريض الغرف للضغط الجوي. تأكد من أن هيكل الجذع الرئوي يجب أن لا يتأثر بإزالة البطينين.

2. تثبيت ضغط الصمام الرئوي

  1. أنابيب الضغط Anastomose مع الشريان الرئوي، وترك ما يقرب من 1 مم المسافة بين تقاطع الصينية أنبوبي ونهاية الأنابيب لاستيعاب لحركات كبيرة من المنشورات والجذع الرئوي.
  2. رفع الخزان إلى ضغط فسيولوجي مماثل وملئه بالمحلول الملحي. اختبر نظام التدفق للتأكد من عدم وجود انسداد أو فقاعات هوائية.
  3. إرفاق stopcock إلى الصمام الرئوي anastomosed وضمان تدفق كاف من خلال الأنابيب (أي، لا فقاعات الهواء) عن طريق تبديل المسالك تدفق. بمجرد أن يكون التدفق كافيا ، قم بتبديل التدفق إلى الصمام الرئوي المصاب بالانستماء وتأكد من الضغط على الجذع الرئوي. يتم التعرف على هذا عن طريق تفكك الجذع الرئوي.
  4. بمجرد تأكيد ضغط الجذع الرئوي ، قم بدمج محلول التثبيت الأساسي تدريجيا (1.25٪ غلوتارالدهيد ، 1.0٪ بارافورمالديهايد في 0.15 M cacodylate) حتى يتم تطهير المحلول المالح. ويتم ذلك عن طريق إزالة جزء، ما يقرب من 25٪ من قدرة الخزان، من المحلول الملحي واستبداله بالمثبت الأساسي.
    تنبيه: المثبتات المستخدمة (بارافورمالديهايد وجلوتارالدهيد) هي معدات حماية شخصية شديدة السمية ومناسبة (PPE) يجب ارتداؤها لضمان السلامة.
  5. ضع شاش مثبتا على عينة الأنسجة لمنع التجفيف.
  6. Perfuse المثبت لمدة 3 ساعة، وإعادة ملء الخزان حسب الحاجة للحفاظ على ضغط مستمر. في جميع أنحاء التثبيت، فإنه ليس من غير المألوف للصمام الرئوي لتقليص بسبب التثبيت الكيميائي. إذا كان هذا هو الحال، وتجديد باستمرار الخزان مع المثبتة الأولية للحفاظ على الضغط الفسيولوجي.
  7. قم بتخزين صمام القلب في المحلول المثبت عند درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام. تم تخزين العينات لمدة تصل إلى أسبوع واحد دون أي فرق ملحوظ.

3. En كتلة عينة تلطيخ وتضمين15،16

تنبيه: الكواشف تلطيخ المستخدمة في هذا القسم (البوتاسيوم ferrocyanide، التيتروكسيد أوسميوم، ثيوكاربوهيدرازيد، اسبارتات الرصاص، وخلات أورانيل) هي سامة للغاية، وينبغي التعامل معها بعناية فائقة. ينصح باستخدام غطاء الدخان وPPE المناسبة.

  1. تلطيخ
    1. اغسل عينة صمام القلب الثابت لمدة 5 دقائق مع العازلة الباردة cacodylate 0.15 M. كرر الغسيل مرتين أخريين.
    2. غمر صمام القلب بالكامل في محلول من 1.5٪ فيروكيانيد البوتاسيوم، 0.15 M cacodylate، 2 mM كلوريد الكالسيوم، و 2٪ من التيتروكسيد الأوسميوم، على الجليد لمدة 1 ساعة.
    3. في حين أن العينة هي احتضان، وإعداد محلول ثيوكاربوهيدرازايد (TCH) عن طريق حل 0.1 غرام من TCH في 10 مل من ddH2O. وضع الحل في فرن 60 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. يهيج بلطف دوريا لضمان حل TCH تماما. تصفية الحل من خلال مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر مباشرة قبل الاستخدام.
    4. غسل العينات مع درجة حرارة الغرفة ddH2O عن طريق وضعها في أنبوب من DDH2O لمدة 5 دقائق وتهيج قليلا عن طريق هز الحاوية. كرر هذه العملية ثلاث مرات.
    5. ضعه في محلول TCH المصفى لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. قم بإجراء خطوة الغسيل ثلاث مرات (5 دقائق لكل منهما) مع درجة حرارة الغرفة ddH2O كما هو موضح في الخطوة 3.1.4.
    6. وبمجرد الانتهاء من ذلك، ضع العينة في 2٪ من التيتروكسيد أوسميوم لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم يغسل مرة أخرى لما مجموعه ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منها مع درجة حرارة الغرفة ddH2O.
    7. احتضان العينة في خلات أورانيل 1٪ بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
    8. خلال هذا الوقت، وجعل حل 0.066 غرام من نترات الرصاص في 10 مل من محلول حمض الأسبارتيك الأسهم. ضبط درجة الحموضة إلى 5.5 مع 1 N KOH. ضع المحلول في فرن 60 درجة مئوية لإذابة نترات الرصاص.
    9. بعد الحضانة الليلية، قم بإجراء خطوة الغسيل كما هو موضح في الخطوة 3.1.4. كرر ثلاث مرات. ثم، احتضان أنسجة صمام القلب في حل الأسبارتات الرصاص من الخطوة 3.1.8 في فرن 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  2. تجفاف
    1. غسل الأنسجة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع ddH2O. كرر ثلاث مرات.
    2. تقديم حلول جديدة من 20٪، 50٪، 70٪، 90٪، و 100٪ الإيثانول في ddH2O. الحفاظ على الجليد حتى الاستخدام.
    3. لتجفف نسيج صمام القلب. إجراء العلاجات اللاحقة من 20٪، 50٪، 70٪، و 90٪ الإيثانول على الجليد لمدة 5 دقائق لكل منهما. ثم إجراء علاجين لاحقين من الإيثانول 100٪ على الجليد لمدة 5 دقائق.
    4. نقل الأنسجة إلى الأسيتون الجليد الباردة لمدة 10 دقيقة. ثم ضع في الأسيتون الطازج في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
  3. تضمين
    1. جعل خليط الراتنج (انظر جدول المواد)وفقا لمواصفات الشركة المصنعة: 11.4 غرام من المكون A، 10 غرام من المكون B، 0.3 غرام من المكون C، و 0.05-0.1 غرام من المكون D. في البداية مزيج المكونات A و B عن طريق تسخين كل من المكونات إلى 60 درجة مئوية قبل إضافة المكونات C و D. سوف يتحول الخليط إلى لون العنبر عند إضافة المكونات C و D. وسوف تكون موحدة عندما مختلطة بشكل صحيح.
    2. جعل الخلائط مع نسب حجم 25:75، 50:50، و 75:25 الراتنج: الأسيتون. تخلط جيدا.
    3. وضع الأنسجة في العلاجات اللاحقة من 25:75، 50:50، و 75:25 الراتنج: خليط الأسيتون لمدة 2 ساعة لكل منهما في درجة حرارة الغرفة.
    4. وضع الأنسجة في الراتنج 100٪ بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
    5. في اليوم التالي، ضع الأنسجة في راتنج 100٪ الطازج لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    6. نقل أنسجة صمام القلب إلى كبسولة التضمين، واستبدال مع الراتنج الطازجة 100٪، ووضعها في فرن 60 درجة مئوية لمدة 48 ساعة لعلاج.
  4. إجراء التصوير المترابط كما هو موضح أدناه.

4. التصوير المقطعي المحوسبة الدقيقة

  1. جبل كتلة عينة الراتنج على حامل عينة μCT مع لاصقة (الغراء أو الشريط على الوجهين يعمل بشكل جيد).
  2. ضع الحامل في غرفة μCT وأصلحه على المسرح عن طريق الشد على الكلية بحيث لا يكون هناك أي حركة من حاملها. سوف يقلل تحرك العينة أثناء الفحص من جودة الصورة.
  3. افتح واجهة المستخدم μCT بالنقر المزدوج فوق الرمز. إضافة مشروع عن طريق تحديد علامة + بجوار المشاريع وتعبئة الحقول الضرورية.
  4. بمجرد إنشاء هذا، ابحث عن المشروع الذي تم إنشاؤه، وحدده بالنقر فوقه. سيؤدي ذلك إلى فتح عمود ثان لعمليات الاستحواذ. حدد + بجوار عمليات الاستحواذ واملأ الحقول الضرورية.
  5. أغلق أبواب الغرفة وتسلح النظام عن طريق الضغط على زر التسليح على اللوحة الأمامية أو μCT. الاحماء بالأشعة السينية من واجهة المستخدم عن طريق تحديد الزر الذي يشير إلى الاحماء.
    ملاحظة: سيقوم النظام تلقائيا بإيقاف تشغيل الأشعة السينية بعد إجراء عملية إحماء ناجحة. قم بتشغيل الأشعة السينية عن طريق تحديد الزر.
  6. ضبط دوران المرحلة بحيث لا ينحرف مركز دوران العينة عن مركز الشاشة (أي أن العينة تقع ضمن مجال الرؤية للمسح الضوئي بأكمله). بالنسبة للنظام المستخدم في هذه التجربة، يتضمن ذلك تعديل مرحلة منطقة الاهتمام (ROI) تحت علامة التبويب المنسدلة كما هو مفصل أدناه.
    1. قم بتعيين تعديل مرحلة عائد الاستثمار عن طريق تعيين زاوية الدوران إلى 0° ووضع علامة على حافة العينة. ثم يتم تدوير العينة إلى 180 درجة ويتم وضع علامة على حافة العينة مرة أخرى.
    2. ضبط وضع محور x المرحلة العائد على الاستثمار بحيث حافة العينة بين هذه النقيضين. كرر هذه العملية لزوايا دوران 90 درجة و 270 درجة للموضع y.
    3. في حالة تسبب دوران العينة في انتقال الحواف من مجال الرؤية، قم بتقليل تكبير احتياجات μCT حتى تظهر حواف العينة في زوايا المجموعة أعلاه ويمكن إجراء تعديل مرحلة عائد الاستثمار الخشن.
    4. بمجرد تعديلها في التكبير السفلي ، قم بتحريك العينة أو الكاشف لزيادة التكبير ويمكن تعديل أوضاع عائد الاستثمار بشكل جيد.
      ملاحظة: قد تحتاج هذه العملية إلى تكرار لضمان المحاذاة. ينتج عن المحاذاة المناسبة عينة تظهر حركة أفقية قليلة أو معدومة من خلال جميع زوايا دوران العينة.
  7. ضبط μCT إلى معلمات المسح المطلوب باستخدام برنامج الشركة المصنعة. وتشمل هذه المعلمات إمكانات الأنبوب، وتيار الأنبوب، ومسافة الكاشف، ومسافة العينة، ووقت التعرض، والمسار، وعدد الإسقاطات (انظر الجدول S1 لمعرفة معلمات اكتساب μCT المستخدمة في هذه الدراسة).
    ملاحظة: يجب الاحتفاظ بمعلمات المعايرة، مثل مسح الحقل ومسح الحقل المظلم، وفقا لمواصفات الشركة المصنعة ما لم يذكر خلاف ذلك. على سبيل المثال، إذا كان نموذج كبير جدا ولا يمكن للنظام نقل العينة من طريقة عرض الحقل، ثم العينة تحتاج إلى إزالتها لإجراء مسح مسح معايرة الحقل.
  8. بمجرد تعيين المعلمات، يمكن رؤية تقريب مدة الفحص عن طريق الضغط على زر تقدير الوقت. حدد الزر ابدأ لبدء الفحص.
  9. بعد الانتهاء من الفحص، تأكد من إيقاف تشغيل الأشعة السينية، فك الكلية، وإزالة العينة بعناية من غرفة μCT.

5. معالجة العينة وارتباط الصورة

  1. إعادة بناء إسقاطات μCT باستخدام خوارزمية إسقاط الخلفية المصفاة مع البرنامج المقدم من قبل الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
    1. حدد علامة التبويب ريكون في أعلى الشاشة. حدد علامة التبويب المشروع والاستحواذ.
    2. حدد اقتران قالب recon بإسقاط تمت تصفيته مرة أخرى. اضغط على زر بدء إعادة التكون.
  2. تحديد الصمام الرئوي وتقسيمه باستخدام برنامج معالجة الصور. وهذا يتطلب معرفة مسبقة لتشريح الصمام الرئوي17. في الضغوط الشريانية المرتفعة ، تحاصر المنشورات وتحجب تجويف الصمام الرئوي.
  3. تحديد اتجاه التقطيع فيما يتعلق باتجاه المسح الضوئي والعينة. إعادة توجيه العينة بحيث يتم محاذاة اتجاه تشريح مع المحور المطلوب.
  4. تحديد المناطق ذات الاهتمام للتصوير عالي الدقة. في هذه التجربة، تم اختيار بطن (وسط) المنشور وتقاطع الشرياني فالفولار.
  5. إزالة الراتنج الزائد وعينة إما عن طريق شفرة الحلاقة أو الرملي لقطع كبيرة من المواد، أو عن طريق microtome لقطع أدق.
  6. مرة واحدة في موقع الاهتمام، قارن العينة المادية مع شرائح μCT الظاهري لتأكيد الموقع. وقد تم ذلك من خلال مقارنة الميزات التشريحية في المقطع العرضي.

6. تسلسل كتلة الوجه المسح المجهري الإلكتروني18

  1. تقليل المقطع العرضي للعينة لاستيعاب SBF-SEM، حوالي 2.0 × 1.5 × 1.8 مم.
  2. قم بتركيب العينة المشذبة على كعب الألمنيوم SBF-SEM باستخدام الايبوكسي.
  3. معطف كتلة عينة مع الذهب 35 نانومتر. تدور العينة على المنصة لتطبيق طبقة حتى من الطلاء.
  4. تنفيس غرفة SBF-SEM وضبط ارتفاع شفرة السكين إلى ارتفاع المجهر eucentric.
  5. إدراج نموذج ومستوى كعب الروتين عينة.
  6. الصورة في ظل ظروف فراغ منخفضة لمنع الشحن ومع كاشف الروافض الخلفية (انظر الجدول S2 لمعلمات الاستحواذ SBF-SEM).
  7. صورة وغرزة مناطق متعددة من الاهتمام في التكبيرات المختلفة باستخدام البرمجيات الآلية (انظر جدول المواد).

النتائج

يظهر تناضح الشريان الرئوي إلى أنابيب الضغط في الشكل 1A. بعد تطبيق الضغط الهيدروستاتيكي ، ينتفض الجذع الرئوي شعاعيا(الشكل 1B)مما يشير إلى أن منشورات الصمام الرئوي في تكوين مغلق. تم تأكيد تشكيل الصمام الرئوي عن طريق μCT. في هذه الحالة، كانت المنشورات coapt (مغلقة) و...

Discussion

إزالة البطينين يخدم غرضين. أولا، تعريض جانب البطين للضغط الجوي، وبالتالي يحتاج فقط إلى تطبيق ضغط عبر الصمام من الجانب الشرياني للصمام الرئوي لإغلاق، وثانيا، توفير قاعدة مستقرة لمنع التواء الجذع الرئوي. أثناء الضغط ، ينتقص الجذع الرئوي بشكل شعاعي وأقل شأنا ، مما يجعله عرضة للالتواء ، مما ?...

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgements

ويدعم هذا العمل، جزئيا، من قبل R01HL139796 وR01HL128847 المنح إلى CKB و RO1DE028297 وCBET1608058 لDM.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
25% glutaraldehyde (aq)EMS16210Primary fixative component
0.9% sodium chloride injectionHospira Inc.NDC 0409-4888-10
1 mL syringeBD309659
10 mL syringeBD309604
200 proof ethanolEMS15055
22G needleBD305156
3 mL syringeBD309657
3-way stopcockSmiths Medical ASD, Inc.MX5311L
4% osmium tetroxideEMS19150Staining component
4% paraformaldehyde (aq)EMS157-4-100Primary fixative component
Absorbable hemostatEthicon1961
AcetoneEMS10012
Black polyamide monofilament suture, 10-0AROSurgical instruments CorporationTI38402
Black polyamide monofilament suture, 6-0AROSurgical instruments CorporationSN-1956
C57BL/6 miceJackson Laboratories664Approximately 1 yo
Calcium chlorideSigma-Aldrich10043-52-4
Clamp applying forcepFST00072-14
Cotton tip applicatorsFisher Scientific23-400-118
DPBSGibco14190-144
Dumont #5 forcepFST11251-20
Dumont #5/45 forcepsFST11251-35
Dumont #7 fine forcepFST11274-20
Durcupan ACM resinEMS14040For embedding
Fine scissorFST14028-10
Heliscan microCTThermo Fisher ScientificMicro-CT
Ketamine hydrochloride injectionHospira Inc.NDC 0409-2053
L-aspartic acidSigma-Aldrich56-84-8Staining component
Lead nitrateEMS17900Staining component
low-vacuum backscatter detectorThermo Fisher ScientificVSDBSSEM backscatter detector
Micro-adson forcepFST11018-12
Millex-GP filter, 0.22 um, PES 33mm, non-sterileEMD MilliporeSLGP033NS
Non-woven songesMcKesson Corp.94442000
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrateSigma-Aldrich14459-95-1Staining component
Potassium hydroxideSigma-Aldrich1310-58-3
Pressure monitor lineSmiths Medical ASD, Inc.MX562
Saline solution (sterile 0.9% sodium chloride)Hospira Inc.NDC 0409-0138-22
Size 3 BEEM capsuleEMS69910-01Embedding container
Sodium cacodylate trihydrateSigma-Aldrich6131-99-3Buffer
Solibri retractorsFST17000-04
Sputter, carbon and e-beam coaterLeicaEM ACE600Gold coater
Surgical microscopeLeicaM80
Thiocarbohydrazide (TCH)EMS21900Staining component
Tish needle holder/forcepMicrinsMI1540
TrimmerWahl9854-500
Uranyl acetateEMS22400Staining component
Volumescope scanning electron microscopeThermo Fisher ScientificVOLUMESCOPESEMSerial Block Face Scanning Electron Microscope
Xylazine sterile solutionAkorn Inc.NADA# 139-236

References

  1. Azari, S., et al. A systematic review of the cost-effectiveness of heart valve replacement with a mechanical versus biological prosthesis in patients with heart valvular disease. Heart Failure Reviews. 25 (3), 495-503 (2020).
  2. Ng, C. M., et al. TGF-β-dependent pathogenesis of mitral valve prolapse in a mouse model of Marfan syndrome. Journal of Clinical Investigation. 114 (11), 1586-1592 (2004).
  3. Cheek, J. D., Wirrig, E. E., Alfieri, C. M., James, J. F., Yutzey, K. E. Differential activation of valvulogenic, chondrogenic, and osteogenic pathways in mouse models of myxomatous and calcific aortic valve disease. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 52 (3), 689-700 (2012).
  4. Jiménez-Altayó, F., et al. Stenosis coexists with compromised α1-adrenergic contractions in the ascending aorta of a mouse model of Williams-Beuren syndrome. Scientific Reports. 10 (1), 889 (2020).
  5. Thacoor, A. Mitral valve prolapse and Marfan syndrome. Congenital Heart Disease. 12 (4), 430-434 (2017).
  6. McAnulty, P., Dayan, A., Ganderup, N. -. C., Hastings, K., Dawson, H. A Comparative Assessment of the Pig, Mouse and Human Genomes. The Minipig in Biomedical Research. , (2011).
  7. Hinton, R. B., Yutzey, K. E. Heart valve structure and function in development and disease. Annual Review of Physiology. 73, 29-46 (2011).
  8. Hinton, R. B., et al. Extracellular matrix remodeling and organization in developing and diseased aortic valves. Circulation Research. 98 (11), 1431-1438 (2006).
  9. Sacks, M. S., Merryman, W. D., Schmidt, D. E., David Merryman, D. W., Schmidt, D. E. On the biomechanics of heart valve function. Journal of Biomechanics. 42 (12), 1804-1824 (2009).
  10. Sacks, M. S., Yoganathan, A. P. Heart valve function: a biomechanical perspective. Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 362 (1484), 1369-1391 (2007).
  11. Morales, A. G., et al. Micro-CT scouting for transmission electron microscopy of human tissue specimens. Journal of Microscopy. 263 (1), 113-117 (2016).
  12. Sacks, M. S., Smith, D. B., Hiester, E. D. The aortic valve microstructure: Effects of transvalvular pressure. Journal of Biomedical Materials Research. 41 (1), 131-141 (1998).
  13. Ayoub, S., et al. Heart valve biomechanics and underlying mechanobiology. Comprehensive Physiology. 6 (4), 1743-1780 (2016).
  14. Stella, J. A., Liao, J., Sacks, M. S. Time-dependent biaxial mechanical behavior of the aortic heart valve leaflet. Journal of Biomechanics. 40 (14), 3169-3177 (2007).
  15. Korn, E. D., Weisman, R. A. I. loss of lipids during preparation of amoebae for electron microscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)/Lipids and Lipid Metabolism. 116 (2), 309-316 (1966).
  16. Tapia, J. C., et al. High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy. Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).
  17. Hinton, R. B., et al. Mouse heart valve structure and function: Echocardiographic and morphometric analyses from the fetus through the aged adult. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 294 (6), 2480-2488 (2008).
  18. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. Plos Biology. 2 (11), 1900-1909 (2004).
  19. Lincoln, J., Florer, J. B., Deutsch, G. H., Wenstrup, R. J., Yutzey, K. E. ColVa1 and ColXIa1 are required for myocardial morphogenesis and heart valve development. Developmental Dynamics. 235 (12), 3295-3305 (2006).
  20. Hamatani, Y., et al. Pathological investigation of congenital bicuspid aortic valve stenosis, compared with atherosclerotic tricuspid aortic valve stenosis and congenital bicuspid aortic valve regurgitation. PLoS One. 11 (8), (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

174

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved