Chirurgie und Probenverarbeitung zur korrelativen Bildgebung der murinen Pulmonalklappe

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir einen korrelativen Workflow für die Exzision, Druckbeaufschlagung, Fixierung und Bildgebung der murinen Pulmonalklappe, um die grobe Konformation und lokale extrazelluläre Matrixstrukturen zu bestimmen.

Zusammenfassung

Die zugrunde liegenden Ursachen der Herzklappenerkrankung (HVD) sind schwer fassbar. Murine Tiermodelle bieten ein hervorragendes Werkzeug für die Untersuchung von HVD, aber das chirurgische und instrumentelle Fachwissen, das erforderlich ist, um die Struktur und Organisation über mehrere Längenskalen hinweg genau zu quantifizieren, hat seinen Fortschritt behindert. Diese Arbeit bietet eine detaillierte Beschreibung der murinen Dissektion, der En-bloc-Färbung, der Probenverarbeitung und der korrelativen Bildgebungsverfahren zur Darstellung der Herzklappe auf verschiedenen Längenskalen. Hydrostatischer Transvalvulardruck wurde verwendet, um die zeitliche Heterogenität durch chemische Fixierung der Herzklappenkonformation zu kontrollieren. Die Mikro-Computertomographie (μCT) wurde verwendet, um die Geometrie der Herzklappe zu bestätigen und eine Referenz für die nachgelagerte Probenverarbeitung zu liefern, die für die serielle Blockflächen-Rasterelektronenmikroskopie (SBF-REM) erforderlich ist. Hochauflösende serielle REM-Bilder der extrazellulären Matrix (ECM) wurden aufgenommen und rekonstruiert, um eine lokale 3D-Darstellung ihrer Organisation zu erhalten. μCT- und SBF-SEM-Bildgebungsverfahren wurden dann korreliert, um die räumliche Variation über die Pulmonalklappe zu überwinden. Obwohl sich die vorgestellte Arbeit ausschließlich auf die Pulmonalklappe betrifft, könnte diese Methodik zur Beschreibung der hierarchischen Organisation in biologischen Systemen übernommen werden und ist entscheidend für die strukturelle Charakterisierung über mehrere Längenskalen hinweg.

Einleitung

Die Pulmonalklappe (PV) dient dazu, eine unidirektionale Durchblutung zwischen dem rechten Ventrikel und der Lungenarterie sicherzustellen. Lungenklappenfehlbildungen sind mit verschiedenen Formen angeborener Herzerkrankungen verbunden. Die aktuelle Behandlung für angeborene Herzklappenerkrankungen (HVD) ist die Klappenreparatur oder der Klappenersatz, was mehrere invasive Operationen während des gesamten Lebens eines Patienten erfordern kann¹. Es ist allgemein anerkannt, dass die Funktion der Herzklappe von ihrer Struktur abgeleitet wird, die oft als Struktur-Funktions-Korrelat bezeichnet wird. Genauer gesagt bestimmen die geometrischen und biomechanischen Eigenschaften des Herzens seine Funktion. Die mechanischen Eigenschaften wiederum werden durch die Zusammensetzung und Organisation des ECM bestimmt. Durch die Entwicklung einer Methode zur Bestimmung der biomechanischen Eigenschaften von murinen Herzklappen können transgene Tiermodelle verwendet werden, um die Rolle des ECM auf die Herzklappenfunktion und Dysfunktion^{abzufragen 2,3,4,5}.

Das mausige Tiermodell gilt seit langem als Standard für molekulare Studien, da transgene Modelle bei Mäusen im Vergleich zu anderen Arten leichter verfügbar sind. Murine transgene Modelle bieten eine vielseitige Plattform für die Erforschung herzklappenbedingter Erkrankungen⁶. Das chirurgische Know-how und die Instrumentierungsanforderungen, um sowohl die Geometrie als auch die ECM-Organisation zu charakterisieren, waren jedoch eine große Hürde für den Fortschritt der HVD-Forschung. Hstologische Daten in der Literatur liefern ein Bild in den gehalt an extrazellulären Matrixen der mausinen Herzklappe, jedoch nur in Form von 2D-Bildern, und können ihre 3D-Architektur nicht beschreiben^7,8. Darüber hinaus ist die Herzklappe sowohl räumlich als auch zeitlich heterogen, was es schwierig macht, über Experimente hinweg Rückschlüsse auf die ECM-Organisation zu ziehen, wenn die Probenahme und Konformation nicht festgelegt sind. Herkömmliche 3D-Charakterisierungsmethoden wie MRT oder 3D-Echokardiographie bieten nicht die Auflösung, die erforderlich ist, um ECM-Komponenten^9,10aufzulösen.

Diese Arbeit beschreibt einen vollständig korrelativen Arbeitsablauf, bei dem die zeitliche Heterogenität aufgrund des Herzzyklus durch Fixierung der Konformation der murinen PV mit hydrostatischem Transvalvulardruck angesprochen wurde. Die räumliche Heterogenität wurde präzise kontrolliert, indem Bereiche von Interesse abgesonden und Datensätze aus verschiedenen Bildgebungsmodalitäten, insbesondere μCT und serielle Blockflächen-Rasterelektronenmikroskopie, über verschiedene Längenskalen registriert wurden. Diese Methode des Scoutings mit μCT zur Führung der nachgelagerten Probenahme wurde bereits vorgeschlagen, aber da die Pulmonalklappe zeitliche Variationen aufweist, war eine zusätzliche Kontrollebene auf der chirurgischen Ebene¹¹erforderlich.

In-vivo-Studien, die die Biomechanik der murinen Herzklappe beschreiben, sind spärlich und stützen sich stattdessen bei der Beschreibung des Deformationsverhaltens auf Computermodelle. Es ist von entscheidender Bedeutung, dass lokale extrazelluläre Daten auf der Nanometerlängenskala mit der Geometrie und Lage der Herzklappe in Verbindung stehen. Dies wiederum liefert quantifizierbare, räumlich abgebildete Verteilungen von mechanisch beitragenden ECM-Proteinen, mit denen bestehende biomechanische Herzklappenmodelle verstärkt werden können^12,13,14.

Protokoll

Die Verwendung von Tieren in dieser Studie erfolgte in Übereinstimmung mit dem institutionellen Tierpflege- und Verwendungsausschuss des Nationwide Children's Hospital unter dem Protokoll AR13-00030.

1. Lungenklappenexzision

1. Autoklavieren Sie die notwendigen Werkzeuge, die für die Mausdissektion benötigt werden. Dazu gehören feine Scheren, Mikrozangen, Mikrogefäßklemmen, Klemmzangen, Mikronieren, Mikronährenhalter, Federscheren und Retraktoren.
2. Akklimatisieren Sie alle Mäuse für mindestens 2 Wochen vor der Operation. Entfernen Sie C57BL / 6-Mäuse, etwa 1 Jahr alt, aus ihren Käfigen und wiegen Sie, dann euthanasieren Sie mit einem Ketamin / Xylazin-Cocktail (3: 1 Ketamin: Xylazin, 0,01 ml pro g) Überdosierung.
3. Legen Sie die Maus in eine dorsale Liegeposition auf ein Tablett und sichern Sie ihre Gliedmaßen mit Klebeband. Nach der Sicherung führen Sie die Thorakotomie durch.
   1. Setzen Sie das Herz frei, indem Sie überschüssiges Fettgewebe und Faszien entfernen.
   2. Entfernen Sie den rechten Vorhof und perfundieren Sie durch den linken Ventrikel mit Kochsalzlösung bei Raumtemperatur (0,9% NaCl). Die Perfusion sollte etwa 20 ml über 30 s dauern. Dies führt zur Exsanguination der Maus.
4. Entfernen Sie das gesamte Herz, indem Sie die obere Hohlvene, die untere Hohlvene, die Lungenarterie und die Aorta durchtrennen. Besondere Vorsicht ist bei der Lungenarterie geboten. Schneiden Sie etwa 2 mm über der ventrikulo-arteriellen Verbindung, da diese als Leitung für die Druckbeaufschlagung dient.
5. Entfernen Sie die linken und rechten Ventrikel, um die Kammern dem atmosphärischen Druck auszusetzen. Stellen Sie sicher, dass die Struktur des Lungenstamms durch die Entfernung der Ventrikel nicht beeinträchtigt wird.

2. Druckfixierung der Pulmonalklappe

1. Anastomose-Druckbeaufschlagungsschlauch mit Lungenarterie, der etwa 1 mm Abstand zwischen der sino-tubulären Verbindung und dem Ende des Schlauches lässt, um große Bewegungen der Blättchen und des Lungenstamms aufzunehmen.
2. Heben Sie das Reservoir auf einen analogen physiologischen Druck und füllen Sie es mit der Kochsalzlösung. Testen Sie das Durchflusssystem, um sicherzustellen, dass keine Verstopfungen oder Luftblasen vorhanden sind.
3. Befestigen Sie einen Absperrhahn an der anastomosierten Pulmonalklappe und sorgen Sie durch Umschalten des Ausströmtraktes für einen ausreichenden Durchfluss durch den Schlauch (d. h. keine Luftblasen). Sobald der Fluss ausreichend ist, schalten Sie den Abfluss auf die anastomosierte Pulmonalklappe um und stellen Sie die Druckbeaufschlagung des Lungenstamms sicher. Dies wird durch pulmonale Rumpfdehnung identifiziert.
4. Sobald die Druckbeauffüllung des Lungenstamms bestätigt ist, werden schrittweise primäre Fixierlösung (1,25% Glutaraldehyd, 1,0% Paraformaldehyd in 0,15 M Cacodylat) eingebaut, bis die Kochsalzlösung gereinigt ist. Dies geschieht, indem ein Teil, etwa 25% der Reservoirkapazität, der Kochsalzlösung entfernt und durch das primäre Fixiermittel ersetzt wird.
   ACHTUNG: Die verwendeten Fixiermittel (Paraformaldehyd und Glutaraldehyd) sind hochgiftig und es sollten geeignete persönliche Schutzausrüstungen (PSA) getragen werden, um die Sicherheit zu gewährleisten.
5. Legen Sie eine fixiermittelgetränkte Gaze über die Gewebeprobe, um ein Austrocknen zu verhindern.
6. Halten Sie das Fixiermittel für 3 h durch und füllen Sie das Reservoir nach Bedarf auf, um einen konstanten Druck aufrechtzuerhalten. Während der Fixierung ist es nicht ungewöhnlich, dass die Pulmonalklappe aufgrund der chemischen Fixierung schrumpft. Wenn dies der Fall ist, füllen Sie das Reservoir ständig mit primären Fixiermitteln auf, um den physiologischen Druck aufrechtzuerhalten.
7. Lagern Sie die Herzklappe bis zum Gebrauch bei 4 °C in der Fixierlösung. Die Proben wurden bis zu 1 Woche ohne erkennbaren Unterschied gelagert.

3. En-bloc Probenfärbung und Einbettung^15,16

ACHTUNG: Die in diesem Abschnitt verwendeten Färbereagenzien (Kaliumferrocyanid, Osmiumtetroxid, Thiocarbohydrazid, Bleiaspartat und Uranylacetat) sind hochgiftig und sollten mit äußerster Vorsicht behandelt werden. Die Verwendung eines Abzugs und einer geeigneten PSA wird empfohlen.

1. Färbung
   1. Waschen Sie die feste Herzklappenprobe für 5 min mit kaltem 0,15 M Cacodylatpuffer. Wiederholen Sie die Wäsche noch zwei weitere Male.
   2. Die Herzklappe vollständig in eine Lösung aus 1,5% Kaliumferrocyanid, 0,15 M Cacodylat, 2 mM Calciumchlorid und 2% Osmiumtetroxid auf Eis für 1 h tauchen.
   3. Während der Inkubation der Probe Thiocarbohydrazid (TCH) -Lösung vorbereiten, indem Sie 0,1 g TCH in 10 ml ddH₂O auflösen. Regelmäßig vorsichtig rühren, um sicherzustellen, dass TCH vollständig aufgelöst ist. Filtern Sie die Lösung unmittelbar vor Gebrauch durch einen 0,22 μm Spritzenfilter.
   4. Waschen Sie die Proben mit Raumtemperatur ddH₂O, indem Sie sie für 5 min in ein Röhrchen ddH₂O geben und durch Schütteln des Behälters leicht rühren. Wiederholen Sie diesen Vorgang dreimal.
   5. Legen Sie es für 20 Minuten bei Raumtemperatur in gefilterte TCH-Lösung. Führen Sie den Waschschritt dreimal (je 5 min) bei Raumtemperatur ddH₂O durch, wie in Schritt 3.1.4 beschrieben.
   6. Sobald Sie fertig sind, legen Sie die Probe in 2% Osmiumtetroxid für 30 min bei Raumtemperatur. Anschließend insgesamt dreimal für je 5 min mit Raumtemperatur ddH₂O erneut waschen.
   7. Inkubieren Sie die Probe in 1% Uranylacetat über Nacht bei 4 °C.
   8. Während dieser Zeit wird eine Lösung von 0,066 g Bleinitrat in 10 ml Asparaginsäure-Stammlösung hergestellt. Stellen Sie den pH-Wert auf 5,5 mit 1 N KOH ein. Die Lösung in einen 60 °C-Ofen geben, um Bleinitrat aufzulösen.
   9. Führen Sie nach der Inkubation über Nacht den Waschschritt wie in Schritt 3.1.4 beschrieben durch. Wiederholen Sie den Vorgang dreimal. Anschließend wird das Herzklappengewebe in Bleiaspartatlösung ab Schritt 3.1.8 in einem 60 °C-Ofen für 30 min inkubiert.
2. Austrocknung
   1. Waschen Sie die Taschentücher 5 min bei Raumtemperatur mit ddH₂O. Dreimal wiederholen.
   2. Machen Sie frische Lösungen von 20%, 50%, 70%, 90% und 100% Ethanol in ddH₂O. Bis zum Gebrauch auf Eis aufbewahren.
   3. Um das Herzklappengewebe zu dehydrieren. Führen Sie nachfolgende Behandlungen von 20%, 50%, 70% und 90% Ethanol auf Eis für jeweils 5 Minuten durch. Führen Sie dann zwei nachfolgende Behandlungen von 100% Ethanol auf Eis für 5 Minuten durch.
   4. Bewegen Sie das Gewebe für 10 Minuten zu eiskaltem Aceton. Dann für 10 min in frisches Aceton bei Raumtemperatur geben.
3. Einbettung
   1. Stellen Sie die Harzmischung (siehe Materialtabelle)gemäß den Herstellerangaben fest: 11,4 g Komponente A, 10 g Komponente B, 0,3 g Komponente C und 0,05-0,1 g Komponente D. Mischen Sie zunächst die Komponenten A und B, indem Sie jede der Komponenten auf 60 °C erhitzen, bevor Sie die Komponenten C und D hinzufügen. Die Mischung wird durch Zugabe der Komponenten C und D in eine bernsteinfarbene Farbe umgewandelt. Es wird einheitlich sein, wenn es richtig gemischt wird.
   2. Stellen Sie Mischungen mit Volumenverhältnissen von 25:75, 50:50 und 75:25 Harz:Aceton hergestellt. Gründlich mischen.
   3. Legen Sie Gewebe in nachfolgende Behandlungen der 25:75-, 50:50- und 75:25-Harz-Aceton-Mischung für jeweils 2 h bei Raumtemperatur.
   4. Legen Sie das Gewebe über Nacht bei Raumtemperatur in 100% Harz.
   5. Am nächsten Tag legen Sie das Gewebe für 2 h bei Raumtemperatur in frisches 100% Harz.
   6. Das Herzklappengewebe in eine Einbettkapsel geben, mit frischem 100% Harz ersetzen und für 48 h in einen 60 °C-Ofen geben, um auszuhärten.
4. Führen Sie eine korrelative Bildgebung wie unten gezeigt durch.

4. Mikro-Computertomographie Bildgebung

1. Montieren Sie den Harzprobenblock mit einem Klebstoff auf einem μCT-Probenhalter (Klebstoff oder doppelseitiges Klebeband funktioniert gut).
2. Setzen Sie den Halter in die μCT-Kammer und befestigen Sie ihn auf der Bühne, indem Sie die Spannzange so verschrauben, dass sich der Halter nicht bewegt. Die Probenbewegung während des Scans verringert die Bildqualität.
3. Öffnen Sie die μCT-Benutzeroberfläche, indem Sie auf das Symbol doppelklicken. Fügen Sie ein Projekt hinzu, indem Sie das +-Zeichen neben Projekte auswählen und die erforderlichen Felder ausfüllen.
4. Sobald dies erstellt wurde, suchen Sie das erstellte Projekt und wählen Sie es aus, indem Sie darauf klicken. Dadurch öffnet sich eine zweite Spalte Akquisitionen. Wählen Sie das + neben Akquisitionen und füllen Sie die erforderlichen Felder aus.
5. Schließen Sie die Kammertüren und bewaffnen Sie das System, indem Sie die Scharfschalttaste auf der Vorderseite oder den μCT drücken.
   HINWEIS: Das System schaltet die Röntgenbilder nach einem erfolgreichen Aufwärmvorgang automatisch aus. Aktivieren Sie Röntgenbilder, indem Sie die Taste auswählen.
6. Stellen Sie die Bühnendrehung so ein, dass der Mittelpunkt der Drehung der Probe nicht von der Mitte des Monitors abweicht (d. h. die Probe befindet sich innerhalb des Sichtfelds für den gesamten Scan). Für das system, das für dieses Experiment verwendet wird, müssen Sie die ROI-Phase (Region of Interest) unter der Dropdown-Registerkarte wie unten beschrieben anpassen.
   1. Stellen Sie die ROI-Stufeneinstellung ein, indem Sie den Drehwinkel auf 0° einstellen und den Rand der Probe markieren. Anschließend wird die Probe auf 180° gedreht und der Rand der Probe erneut markiert.
   2. Passen Sie die x-Achsenposition der ROI-Stufe so an, dass sich die Kante der Probe zwischen diesen beiden Extremen befindet. Wiederholen Sie diesen Vorgang für Drehwinkel von 90° und 270° für die Y-Position.
   3. Für den Fall, dass die Rotation der Probe dazu führt, dass sich die Kanten aus dem Sichtfeld bewegen, verringern Sie die Vergrößerung des μCT-Bedarfs, bis die Kanten der Probe in den oben eingestellten Winkeln sichtbar sind und eine grobe ROI-Stufenanpassung vorgenommen werden kann.
   4. Einmal bei der unteren Vergrößerung eingestellt, bewegen Sie die Probe oder den Detektor, um die Vergrößerung zu erhöhen, und die ROI-Positionen können fein eingestellt werden.
      HINWEIS: Dieser Vorgang muss möglicherweise wiederholt werden, um die Ausrichtung sicherzustellen. Die richtige Ausrichtung führt zu einer Probe, die wenig bis keine horizontale Bewegung durch alle Rotationswinkel der Probe zeigt.
7. Passen Sie die μCT mit der Software des Herstellers an die gewünschten Scanparameter an. Zu diesen Parametern gehören Röhrenpotential, Röhrenstrom, Detektorabstand, Probenabstand, Belichtungszeit, Flugbahn und die Anzahl der Projektionen (siehe Tabelle S1 für die in dieser Studie verwendeten μCT-Erfassungsparameter).
   HINWEIS: Kalibrierparameter, wie Klarfeld- und Dunkelfeldscans, sollten gemäß den Herstellerspezifikationen eingehalten werden, sofern nicht anders angegeben. Wenn beispielsweise eine Probe zu groß ist und das System die Probe nicht aus der Feldansicht verschieben kann, muss die Probe entfernt werden, um Klare-Feld-Kalibrierungsscans durchzuführen.
8. Sobald die Parameter eingestellt sind, kann eine Annäherung an die Dauer des Scans angezeigt werden, indem Sie auf die Schaltfläche Zeitschätzung klicken. Klicken Sie auf die Schaltfläche Start, um den Scan zu starten.
9. Stellen Sie nach Abschluss des Scans sicher, dass die Röntgenstrahlen ausgeschaltet sind, schrauben Sie die Spannzange ab und entfernen Sie die Probe vorsichtig aus der μCT-Kammer.

5. Probenverarbeitung und Bildkorrelation

1. Rekonstruieren Sie μCT-Projektionen mit einem gefilterten Rückprojektionsalgorithmus mit der vom Hersteller bereitgestellten Software (siehe Materialtabelle).
   1. Wählen Sie oben auf dem Bildschirm die Registerkarte Recon aus. Wählen Sie die Registerkarte Projekt und Akquisition aus.
   2. Wählen Sie die Recon-Vorlage aus, die der gefilterten Rückprojektion zugeordnet ist. Klicken Sie auf die Schaltfläche Start Recon.
2. Identifizieren und segmentieren Sie die Pulmonalklappe mithilfe von Bildverarbeitungssoftware. Dies erfordert Vorkenntnisse der Anatomie der Pulmonalklappe¹⁷. Bei erhöhten arteriellen Drücken verfärben sich die Blättchen und blockieren das Lumen der Pulmonalklappe.
3. Identifizieren Sie die Slicing-Ausrichtung in Bezug auf die Scanrichtung und das Muster. Orientieren Sie die Probe so um, dass die Schneidrichtung auf die gewünschte Achse ausgerichtet ist.
4. Identifizieren Sie Regionen, die für hochauflösende Bildgebung von Interesse sind. In diesem Experiment wurde der Bauch (Mitte) des Blättchens und die Arterio-Valvular-Verbindung gewählt.
5. Entfernen Sie das überschüssige Harz und probieren Sie entweder mit der Rasierklinge oder dem Schleifen für große Materialstücke oder mit dem Mikrotom für feinere Stücke.
6. Sobald Sie sich an einem interessanten Ort befinden, vergleichen Sie die physische Probe mit virtuellen μCT-Scheiben, um den Standort zu bestätigen. Dies geschah durch den Vergleich anatomischer Merkmale am Querschnitt.

6. Serielle Blockflächen-Rasterelektronenmikroskopie¹⁸

1. Reduzieren Sie den Querschnitt der Probe, um SBF-REM aufzunehmen, ca. 2,0 x 1,5 x 1,8 mm.
2. Montieren Sie die getrimmte Probe mit Epoxidharz auf dem SBF-SEM-Aluminiumstumpf.
3. Beschichten Sie den Probenblock mit 35 nm Gold. Drehen Sie die Probe auf der Plattform, um eine gleichmäßige Beschichtungsschicht aufzutragen.
4. Entlüften Sie die SBF-REM-Kammer und stellen Sie die Höhe der Messerklinge auf die euzentrische Höhe des Mikroskops ein.
5. Fügen Sie das Beispiel ein, und nivellen Sie den Beispielstub.
6. Bild unter Niedrigenvakuumbedingungen zur Verhinderung des Ladens und mit Rückstreudetektor (siehe Tabelle S2 für SBF-SEM-Erfassungsparameter).
7. Bild und Stitch mehrere Bereiche von Interesse bei unterschiedlichen Vergrößerungen mit automatisierter Software (siehe Materialtabelle).

Ergebnisse

Anastomose der Lungenarterie zum Druckschlauch ist in Abbildung 1Adargestellt. Nach der Anwendung von hydrostatischem Druck dehnung sich der Lungenstamm radial (Abbildung 1B), was darauf hinweist, dass sich die Lungenklappenblättchen in einer geschlossenen Konfiguration befinden. Die Pulmonalklappenkonformation wurde durch μCT bestätigt. In diesem Fall waren die Blättchen koapt (geschlossen) und der Ring war kreisförmig (Abbildung 2A

Diskussion

Die Entfernung der Ventrikel dient zwei Zwecken. Erstens, die Ventrikelseite dem atmosphärischen Druck auszusetzen, wodurch nur ein transvalvulärer Druck von der arteriellen Seite der Pulmonalklappe ausgeübt werden muss, um sich zu schließen, und zweitens, eine stabile Basis bereitzustellen, um eine Verdrehung des Lungenstamms zu verhindern. Während der Druckbeaufschlägeung dehnung sich der Lungenstamm radial und minderwertig, wodurch er anfällig für Verdrehungen wird, was zum Zusammenbruch des Lungenstamms führ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
25% glutaraldehyde (aq)	EMS	16210	Primary fixative component
0.9% sodium chloride injection	Hospira Inc.	NDC 0409-4888-10
1 mL syringe	BD	309659
10 mL syringe	BD	309604
200 proof ethanol	EMS	15055
22G needle	BD	305156
3 mL syringe	BD	309657
3-way stopcock	Smiths Medical ASD, Inc.	MX5311L
4% osmium tetroxide	EMS	19150	Staining component
4% paraformaldehyde (aq)	EMS	157-4-100	Primary fixative component
Absorbable hemostat	Ethicon	1961
Acetone	EMS	10012
Black polyamide monofilament suture, 10-0	AROSurgical instruments Corporation	TI38402
Black polyamide monofilament suture, 6-0	AROSurgical instruments Corporation	SN-1956
C57BL/6 mice	Jackson Laboratories	664	Approximately 1 yo
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	10043-52-4
Clamp applying forcep	FST	00072-14
Cotton tip applicators	Fisher Scientific	23-400-118
DPBS	Gibco	14190-144
Dumont #5 forcep	FST	11251-20
Dumont #5/45 forceps	FST	11251-35
Dumont #7 fine forcep	FST	11274-20
Durcupan ACM resin	EMS	14040	For embedding
Fine scissor	FST	14028-10
Heliscan microCT	Thermo Fisher Scientific		Micro-CT
Ketamine hydrochloride injection	Hospira Inc.	NDC 0409-2053
L-aspartic acid	Sigma-Aldrich	56-84-8	Staining component
Lead nitrate	EMS	17900	Staining component
low-vacuum backscatter detector	Thermo Fisher Scientific	VSDBS	SEM backscatter detector
Micro-adson forcep	FST	11018-12
Millex-GP filter, 0.22 um, PES 33mm, non-sterile	EMD Millipore	SLGP033NS
Non-woven songes	McKesson Corp.	94442000
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate	Sigma-Aldrich	14459-95-1	Staining component
Potassium hydroxide	Sigma-Aldrich	1310-58-3
Pressure monitor line	Smiths Medical ASD, Inc.	MX562
Saline solution (sterile 0.9% sodium chloride)	Hospira Inc.	NDC 0409-0138-22
Size 3 BEEM capsule	EMS	69910-01	Embedding container
Sodium cacodylate trihydrate	Sigma-Aldrich	6131-99-3	Buffer
Solibri retractors	FST	17000-04
Sputter, carbon and e-beam coater	Leica	EM ACE600	Gold coater
Surgical microscope	Leica	M80
Thiocarbohydrazide (TCH)	EMS	21900	Staining component
Tish needle holder/forcep	Micrins	MI1540
Trimmer	Wahl	9854-500
Uranyl acetate	EMS	22400	Staining component
Volumescope scanning electron microscope	Thermo Fisher Scientific	VOLUMESCOPESEM	Serial Block Face Scanning Electron Microscope
Xylazine sterile solution	Akorn Inc.	NADA# 139-236