Хирургия и обработка образцов для коррелятивной визуализации мышиного легочного клапана

Резюме

Здесь мы описываем коррелятивный рабочий процесс для иссечения, герметизации, фиксации и визуализации мышиного легочного клапана для определения валовой конформации и локальных структур внеклеточного матрикса.

Аннотация

Основные причины заболеваний, связанных с сердечным клапаном (HVD), неуловимы. Мышиные животные модели обеспечивают отличный инструмент для изучения HVD, однако хирургический и инструментальный опыт, необходимый для точной количественной оценки структуры и организации в нескольких масштабах длины, затмил его продвижение. Эта работа содержит подробное описание рассечения мыша, окрашивания блока, обработки образцов и корреляционных процедур визуализации для изображения сердечного клапана в различных масштабах длины. Гидростатическое трансклапанное давление использовалось для контроля временной гетерогенности путем химической фиксации конформации сердечного клапана. Микрокоммуническая томография (мкКТ) использовалась для подтверждения геометрии сердечного клапана и обеспечения ориентира для последующей обработки образцов, необходимой для последовательной блочной сканирующей электронной микроскопии лица (SBF-SEM). Были взяты и реконструированы последовательные SEM-изображения внеклеточного матрикса (ECM) с высоким разрешением, чтобы обеспечить локальное 3D-представление его организации. Затем методы визуализации μCT и SBF-SEM были коррелированы для преодоления пространственных вариаций в легочном клапане. Хотя представленная работа посвящена исключительно легочному клапану, эта методология может быть принята для описания иерархической организации в биологических системах и имеет решающее значение для структурной характеристики в нескольких масштабах длины.

Введение

Легочный клапан (PV) служит для обеспечения однонаправленного кровотока между правым желудочком и легочной артерией. Пороки развития легочного клапана связаны с несколькими формами врожденных пороков сердца. В настоящее время лечение врожденного заболевания клапанов сердца (HVD) - это восстановление клапанов или замена клапанов, что может потребовать нескольких инвазивных операций в течение всей жизни пациента^1. Широко признано, что функция сердечного клапана происходит от его структуры, часто называемой структурно-функциональным коррелятом. Более конкретно, геометрические и биомеханические свойства сердца диктуют его функцию. Механические свойства, в свою очередь, определяются составом и организацией ECM. Разрабатывая метод определения биомеханических свойств клапанов сердца мысей, трансгенные животные модели могут быть использованы для опроса о роли ECM на функции сердечного клапана и дисфункции^2,3,4,5.

Модель мышиных животных уже давно считается стандартом для молекулярных исследований, потому что трансгенные модели более доступны у мышей по сравнению с другими видами. Мышиные трансгенные модели обеспечивают универсальную платформу для исследования заболеваний, связанных с сердечными клапанами⁶. Тем не менее, хирургический опыт и требования к инструментам для характеристики как геометрии, так и организации ECM были основным препятствием в продвижении исследований HVD. Хстологические данные в литературе дают картину содержания внеклеточного матрикса мышиного клапана сердца, но только в виде 2D-изображений, и не в состоянии описать его 3D-архитектуру^7,8. Кроме того, сердечный клапан является как пространственно, так и временно неоднородным, что затрудняет выводы в экспериментах относительно организации ECM, если выборка и конформация не фиксированы. Обычные методы 3D-характеристики, такие как МРТ или 3D-эхокардиография, не обеспечивают разрешения, необходимого для разрешения компонентов ECM^9,10.

Эта работа подробно описывает полностью коррелятивный рабочий процесс, где временная гетерогенность, обусловленная сердечным циклом, была устранена путем фиксации конформации мышиного PV с гидростатическим трансклапанным давлением. Пространственная гетерогенность контролировалась именно путем выборки интересующих областей и регистрации наборов данных из различных методов визуализации, в частности μCT и последовательной блочной сканирующей электронной микроскопии, в разных масштабах длины. Этот метод разведки с помощью μCT для направления отбора проб вниз по течению был предложен ранее, но поскольку легочный клапан демонстрирует временные вариации, на хирургическом уровне¹¹потребовался дополнительный уровень контроля.

Исследования in vivo, описывающие биомеханику клапанов сердца мыщ, редки и вместо этого полагаются на вычислительные модели при описании деформационного поведения. Крайне важно, чтобы локальные внеклеточные данные по шкале нанометровой длины были связаны с геометрией и расположением сердечного клапана. Это, в свою очередь, обеспечивает количественное, пространственно отображенное распределение механически способствующих белков ECM, которые могут быть использованы для усиления существующих биомеханических моделей клапанов сердца^12,13,14.

протокол

Использование животных в этом исследовании соответствовало Национальному детскому госпиталью по уходу за животными и их использованию в соответствии с протоколом AR13-00030.

1. Иссечение легочного клапана

1. Автоклав необходимых инструментов, необходимых для рассечения мыши. Это включает в себя тонкие ножницы, микрощипцы, микрососудистые зажимы, щипцы для применения зажимов, держатели микроигл, пружинные ножницы и втягивающие.
2. Акклиматизуем всех мышей минимум за 2 недели до операции. Удалите мышей C57BL/6, примерно 1 года, из их клеток и взвесьте, а затем усыпить с помощью коктейля кетамина / ксилазина (3: 1 кетамин: ксилазин, 0,01 мл на г) передозировки.
3. Поместите мышь в дорсальное положение лежа на лотке и закрепите ее конечности скотчем. После закрепления выполните торакотомию.
   1. Обнажите сердце, удалив излишки жировой ткани и фасций.
   2. Удалить правое предсердие и перфузировать через левый желудочек физиологическим раствором комнатной температуры (0,9% NaCl). Перфузия должна занимать примерно 20 мл в течение 30 с. Это приводит к экссангинации мыши.
4. Удалите все сердце, разогнав верхнюю полую вену, нижнюю полую вену, легочную артерию и аорту. Особую осторожность следует проявлять к легочной артерии. Разрезают примерно на 2 мм выше вентрикуло-артериального соединения, так как это будет служить каналом для герметизации.
5. Удалите левый и правый желудочки, чтобы подвергнуть камеры атмосферным давлениям. Убедитесь, что структура легочного ствола не должна быть затронута удалением желудочков.

2. Фиксация давления легочного клапана

1. Анастомозная трубка напора с легочной артерией, оставляющая расстояние примерно в 1 мм между синотубчатым соединением и концом трубки для размещения больших движений листочков и легочного ствола.
2. Поднимите резервуар до аналогичного физиологического давления и заполните его солевым раствором. Проверьте проточную систему, чтобы убедиться в отсутствии засоров или пузырьков воздуха.
3. Прикрепите запорный кран к анастомозированному легочному клапану и обеспечьте достаточный поток через трубку (т. Е. Отсутствие пузырьков воздуха) путем переключения тракта оттока. Как только поток будет адекватным, переключите отток на анастомозированный легочный клапан и обеспечьте герметизацию легочной ствола. Это определяется растяжением легочной туловища.
4. Как только давление легочной ствола подтверждено, постепенно включайте первичный фиксаторный раствор (1,25% глутаровый альдегид, 1,0% параформальдегид в 0,15 М какодилата) до тех пор, пока солевой раствор не продувят. Это делается путем удаления части, примерно 25% емкости резервуара, соляного раствора и замены его первичным фиксатором.
   ВНИМАНИЕ: Используемые фиксаторы (параформальдегид и глутаральдегид) являются высокотоксичными, и для обеспечения безопасности следует носить соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ).
5. Поместите пропитанную фиксаторами марлю на образец ткани, чтобы предотвратить высыхание.
6. Перфьмировку фиксатора в течение 3 ч, заправляя резервуар по мере необходимости для поддержания постоянного давления. На протяжении всей фиксации легочный клапан нередко сжимается из-за химической фиксации. Если это так, постоянно пополняйте резервуар первичным фиксатором для поддержания физиологического давления.
7. Храните сердечный клапан в фиксаторном растворе при 4 °C до использования. Образцы хранились до 1 недели без какой-либо заметной разницы.

3. В блок окрашивание и встраивание образцов^15,16

ВНИМАНИЕ: Окрашивающие реагенты, используемые в этом разделе (ферроцианид калия, тетроксид осмия, тиокарбогидразид, аспартат свинца и уранилацетат), являются высокотоксичными и с ними следует обращаться с особой осторожностью. Рекомендуется использовать вытяжную вытяжку и надлежащие СИЗ.

1. Окрашивание
   1. Промывайте образец неподвижного сердечного клапана в течение 5 мин холодным какодилатным буфером 0,15 М. Повторите стирку еще два раза.
   2. Полностью погрузить сердечный клапан в раствор 1,5% ферроцианида калия, 0,15 М какодилата, 2 мМ хлорида кальция и 2% тетроксида осмия, на льду в течение 1 ч.
   3. Пока образец инкубируется, готовят раствор тиокарбогидразида (ТКП), растворяя 0,1 г ТКП в 10 мл ddH_2O.Поместите раствор в духовку с 60 °C в течение 1 ч. Осторожно периодически перемешивать, чтобы убедиться, что ТХ полностью растворяется. Процедить раствор через шприцевой фильтр 0,22 мкм непосредственно перед использованием.
   4. Промыть образцы комнатной температурой ddH₂O, поместив их в трубку с ddH₂O на 5 мин и слегка перемешать, встряхнув емкость. Повторите этот процесс три раза.
   5. Поместите его в фильтрованный раствор ТХ на 20 мин при комнатной температуре. Выполните этап стирки три раза (по 5 мин каждая) при комнатной температуре ddH₂O, как описано в шаге 3.1.4.
   6. После этого поместите образец в 2% тетроксида осмия в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем снова промыть его в общей сложности три раза по 5 мин каждый с комнатной температурой ddH₂O.
   7. Инкубировать образец в 1% уранилацетата в течение ночи при 4 °C.
   8. За это время вносят раствор из 0,066 г нитрата свинца в 10 мл раствора аспарагиновой кислоты. Отрегулируйте рН до 5,5 с 1 Н КОН. Поместите раствор в духовку с 60 °C для растворения нитрата свинца.
   9. После ночной инкубации выполните этап промывки, как описано на этапе 3.1.4. Повторите три раза. Затем инкубируют ткань сердечного клапана в растворе аспартата свинца со ступени 3.1.8 в духовке при 60 °C в течение 30 мин.
2. Обезвоживание
   1. Промыть салфетки в течение 5 мин при комнатной температуре с ddH₂O. Повторить три раза.
   2. В составлять свежие растворы 20%, 50%, 70%, 90% и 100% этанола в ddH₂O. Хранить на льду до использования.
   3. Для обезвоживания ткани сердечного клапана. Выполняйте последующие обработки 20%, 50%, 70% и 90% этанола на льду в течение 5 мин каждая. Затем выполняют две последующие обработки 100% этанолом на льду в течение 5 мин.
   4. Переместите ткань до ледяного ацетона в течение 10 мин. Затем поместить в свежий ацетон комнатной температуры на 10 мин.
3. Внедрение
   1. Производят смоляную смесь (см. Таблицу материалов)в соответствии со спецификациями производителя: 11,4 г компонента А, 10 г компонента В, 0,3 г компонента С и 0,05-0,1 г компонента D. Первоначально смешайте компоненты A и B, нагревая каждый из компонентов до 60 °C перед добавлением компонентов C и D. Смесь превратится в янтарный цвет при добавлении компонентов C и D. Он будет однородным при правильном смешивании.
   2. Делайте смеси с объемными соотношениями 25:75, 50:50 и 75:25 смола:ацетон. Тщательно перемешать.
   3. Поместите ткани в последующие обработки смесью смолы: ацетона 25:75, 50:50 и 75:25 в течение 2 ч каждая при комнатной температуре.
   4. Поместите ткани в 100% смолу на ночь при комнатной температуре.
   5. На следующий день поместите ткани в свежую 100% смолу на 2 ч при комнатной температуре.
   6. Перенесите ткани сердечного клапана во встраиваемую капсулу, замените свежей 100% смолой и поместите в духовку с 60 °C на 48 ч для лечения.
4. Выполните коррелятивную визуализацию, как показано ниже.

4. Микрокоммунографная томография

1. Установите блок образцов смолы на держатель образца μCT с помощью клея (хорошо работает клей или двусторонняя лента).
2. Поместите держатель в камеру μCT и закрепите его на сцене, прикрутив цангу таким образом, чтобы держатель не помещал. Перемещение образца во время сканирования приведет к снижению качества изображения.
3. Откройте пользовательский интерфейс μCT, дважды щелкнув значок. Добавьте проект, выбрав знак + рядом с пунктом Проекты и заполните необходимые поля.
4. Как только он будет создан, найдите созданный проект и выберите его, нажав на него. Это откроет вторую колонку Приобретения. Выберите + рядом с пунктом Приобретения и заполните необходимые поля.
5. Закройте дверцы камеры и вооружите систему, нажав кнопку зажима на передней панели или μCT. Прогрейте рентгеновские снимки из пользовательского интерфейса, выбрав кнопку, указывающую Разогрев.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Система автоматически отключит рентгеновские лучи после успешной процедуры разминки. Включите рентгеновские лучи, нажав кнопку.
6. Отрегулируйте вращение ступени таким образом, чтобы центр вращения образца не отклоняется от центра монитора (т.е. образец находится в поле зрения на протяжении всего сканирования). Для системы, используемой для этого эксперимента, это включает в себя настройку уровня интересующей области (ROI) в раскрывающейся вкладке, как описано ниже.
   1. Установите регулировку этапа ROI, установив угол поворота на 0° и отметив край образца. Затем образец поворачивается на 180° и край образца снова маркируется.
   2. Отрегулируйте положение оси X этапа ROI таким образом, чтобы край образца был между этими двумя крайностями. Повторите этот процесс для углов поворота 90° и 270° для положения Y.
   3. В случае, когда вращение образца приводит к тому, что края выходят за поле зрения, уменьшите увеличение потребностей μCT до тех пор, пока края образца не будут видны под заданными выше углами и не будет произведена грубая регулировка стадии ROI.
   4. После регулировки при меньшем увеличении переместите образец или детектор, чтобы увеличить увеличение, и положение ROI может быть точно отрегулировано.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот процесс, возможно, потребуется повторить для обеспечения согласованности. Правильное выравнивание приводит к тому, что образец практически не показывает горизонтального движения через все углы поворота образца.
7. Отрегулируйте μCT в соответствии с требуемыми параметрами сканирования с помощью программного обеспечения производителя. Эти параметры включают потенциал трубки, ток трубки, расстояние детектора, расстояние до образца, время экспозиции, траекторию и количество проекций (см. Таблицу S1 для параметров сбора μCT, используемых в этом исследовании).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры калибровки, такие как сканирование чистого поля и темного поля, должны соблюдаться в спецификациях производителя, если не указано иное. Например, если образец слишком велик и система не может переместить образец из поля, то образец необходимо удалить для выполнения сканирования калибровки в чистом поле.
8. После того, как параметры установлены, приближение продолжительности сканирования можно увидеть, нажав кнопку Оценка времени. Нажмите кнопку Пуск, чтобы начать сканирование.
9. После завершения сканирования убедитесь, что рентгеновские лучи выключены, открутите цангу и осторожно извлеките образец из камеры μCT.

5. Обработка образцов и корреляция изображений

1. Реконструировать проекции μCT с помощью алгоритма отфильтрооированной обратной проекции с помощью программного обеспечения, предоставленного производителем (см. Таблицу материалов).
   1. Выберите вкладку Recon в верхней части экрана. Выберите вкладку Проект и приобретение.
   2. Выберите шаблон recon, связанный с отфильтроированной обратной проекцией. Нажмите кнопку Запустить разопоминочные работы.
2. Идентификация и сегментация легочного клапана с помощью программного обеспечения для обработки изображений. Для этого требуется предварительное знание анатомии легочного клапана^17. При повышенном артериальном давлении листочки совмещаются и блокируют просвет легочного клапана.
3. Определите ориентацию нарезки относительно направления сканирования и образца. Переориентировать образец таким образом, чтобы направление нарезки было выровнено с нужной осью.
4. Определите области, представляющие интерес для изображений с высоким разрешением. В этом эксперименте был выбран живот (середина) листочка и артерио-клапанное соединение.
5. Удалите избыток смолы и образец либо лезвием бритвы, либо шлифовкой для больших кусков материала, либо микротомом для более мелких кусочков.
6. Оказавшись в интересуемом месте, сравните физический образец с виртуальными срезами μCT, чтобы подтвердить местоположение. Это было сделано путем сравнения анатомических особенностей на поперечном сечении.

6. Последовательная блок сканирующей электронной микроскопии¹⁸

1. Уменьшите поперечное сечение образца, чтобы вместить SBF-SEM, примерно на 2,0 x 1,5 x 1,8 мм.
2. Установите обрезанный образец на алюминиевый заглушку SBF-SEM с помощью эпоксидной смолы.
3. Покрыть блок образца 35-нм золотом. Раскрутите образец на платформе, чтобы нанести ровный слой покрытия.
4. Вентиляционная камера SBF-SEM и регулировка высоты лезвия ножа в соответствии с эйцентрической высотой микроскопа.
5. Вставьте образец и выровнйте заглушку образца.
6. Изображение в условиях низкого вакуума для предотвращения зарядки и с помощью детектора обратного рассеяния (см. Таблицу S2 для параметров сбора SBF-SEM).
7. Изобразите и сшите несколько областей интереса при разных увеличениях с помощью автоматизированного программного обеспечения (см. Таблицу материалов).

Результаты

Анастомоз легочной артерии до напорной трубки показан на фиг.1А. После применения гидростатического давления легочный ствол растяжение радиально(рисунок 1B),что указывает на то, что створки легочного клапана находятся в закрытой конфигурации. Конформац?...

Обсуждение

Удаление желудочков служит двум целям. Во-первых, подвергая сторону желудочка атмосферному давлению, тем самым нужно лишь прикладывать трансклапанное давление с артериальной стороны легочного клапана для закрытия, а во-вторых, обеспечивая стабильное основание для предотвращения скр?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
25% glutaraldehyde (aq)	EMS	16210	Primary fixative component
0.9% sodium chloride injection	Hospira Inc.	NDC 0409-4888-10
1 mL syringe	BD	309659
10 mL syringe	BD	309604
200 proof ethanol	EMS	15055
22G needle	BD	305156
3 mL syringe	BD	309657
3-way stopcock	Smiths Medical ASD, Inc.	MX5311L
4% osmium tetroxide	EMS	19150	Staining component
4% paraformaldehyde (aq)	EMS	157-4-100	Primary fixative component
Absorbable hemostat	Ethicon	1961
Acetone	EMS	10012
Black polyamide monofilament suture, 10-0	AROSurgical instruments Corporation	TI38402
Black polyamide monofilament suture, 6-0	AROSurgical instruments Corporation	SN-1956
C57BL/6 mice	Jackson Laboratories	664	Approximately 1 yo
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	10043-52-4
Clamp applying forcep	FST	00072-14
Cotton tip applicators	Fisher Scientific	23-400-118
DPBS	Gibco	14190-144
Dumont #5 forcep	FST	11251-20
Dumont #5/45 forceps	FST	11251-35
Dumont #7 fine forcep	FST	11274-20
Durcupan ACM resin	EMS	14040	For embedding
Fine scissor	FST	14028-10
Heliscan microCT	Thermo Fisher Scientific		Micro-CT
Ketamine hydrochloride injection	Hospira Inc.	NDC 0409-2053
L-aspartic acid	Sigma-Aldrich	56-84-8	Staining component
Lead nitrate	EMS	17900	Staining component
low-vacuum backscatter detector	Thermo Fisher Scientific	VSDBS	SEM backscatter detector
Micro-adson forcep	FST	11018-12
Millex-GP filter, 0.22 um, PES 33mm, non-sterile	EMD Millipore	SLGP033NS
Non-woven songes	McKesson Corp.	94442000
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate	Sigma-Aldrich	14459-95-1	Staining component
Potassium hydroxide	Sigma-Aldrich	1310-58-3
Pressure monitor line	Smiths Medical ASD, Inc.	MX562
Saline solution (sterile 0.9% sodium chloride)	Hospira Inc.	NDC 0409-0138-22
Size 3 BEEM capsule	EMS	69910-01	Embedding container
Sodium cacodylate trihydrate	Sigma-Aldrich	6131-99-3	Buffer
Solibri retractors	FST	17000-04
Sputter, carbon and e-beam coater	Leica	EM ACE600	Gold coater
Surgical microscope	Leica	M80
Thiocarbohydrazide (TCH)	EMS	21900	Staining component
Tish needle holder/forcep	Micrins	MI1540
Trimmer	Wahl	9854-500
Uranyl acetate	EMS	22400	Staining component
Volumescope scanning electron microscope	Thermo Fisher Scientific	VOLUMESCOPESEM	Serial Block Face Scanning Electron Microscope
Xylazine sterile solution	Akorn Inc.	NADA# 139-236