Chirurgie et traitement des échantillons pour l’imagerie corrélative de la valve pulmonaire murine

Résumé

Ici, nous décrivons un flux de travail corrélatif pour l’excision, la pressurisation, la fixation et l’imagerie de la valve pulmonaire murine afin de déterminer la conformation grossière et les structures de la matrice extracellulaire locale.

Résumé

Les causes sous-jacentes de la maladie liée aux valves cardiaques (HVD) sont insaisissables. Les modèles animaux murins fournissent un excellent outil pour étudier le HVD, mais l’expertise chirurgicale et instrumentale requise pour quantifier avec précision la structure et l’organisation sur plusieurs échelles de longueur a retardé son avancement. Ce travail fournit une description détaillée de la dissection murine, de la coloration en bloc, du traitement des échantillons et des procédures d’imagerie corrélative pour représenter la valve cardiaque à différentes échelles de longueur. La pression transvalvulaire hydrostatique a été utilisée pour contrôler l’hétérogénéité temporelle en fixant chimiquement la conformation de la valve cardiaque. La micro-tomodensitométrie (μCT) a été utilisée pour confirmer la géométrie de la valve cardiaque et fournir une référence pour le traitement des échantillons en aval nécessaire à la microscopie électronique à balayage de face de bloc série (SBF-SEM). Des images SEM en série haute résolution de la matrice extracellulaire (ECM) ont été prises et reconstruites pour fournir une représentation 3D locale de son organisation. Les méthodes d’imagerie μCT et SBF-SEM ont ensuite été corrélées pour surmonter la variation spatiale à travers la valve pulmonaire. Bien que les travaux présentés soient exclusivement sur la valve pulmonaire, cette méthodologie pourrait être adoptée pour décrire l’organisation hiérarchique dans les systèmes biologiques et est essentielle pour la caractérisation structurelle sur plusieurs échelles de longueur.

Introduction

La valve pulmonaire (PV) sert à assurer le flux sanguin unidirectionnel entre le ventricule droit et l’artère pulmonaire. Les malformations valvulaires pulmonaires sont associées à plusieurs formes de cardiopathie congénitale. Le traitement actuel de la cardiopathie congénitale (HVD) est la réparation valvulaire ou le remplacement valvulaire, qui peut nécessiter de multiples chirurgies invasives tout au long de la vie d’un patient¹. Il a été largement admis que la fonction de la valve cardiaque est dérivée de sa structure, souvent appelée corrélat structure-fonction. Plus précisément, les propriétés géométriques et biomécaniques du cœur dictent sa fonction. Les propriétés mécaniques, à leur tour, sont déterminées par la composition et l’organisation de l’ECM. En développant une méthode pour déterminer les propriétés biomécaniques des valves cardiaques murines, des modèles animaux transgéniques peuvent être utilisés pour interroger le rôle de l’ECM sur la fonction et le dysfonctionnement des valves^{cardiaques 2,3,4,5}.

Le modèle animal murin a longtemps été considéré comme la norme pour les études moléculaires parce que les modèles transgéniques sont plus facilement disponibles chez la souris que chez d’autres espèces. Les modèles transgéniques murins fournissent une plate-forme polyvalente pour la recherche sur les maladies liées aux valves cardiaques⁶. Cependant, l’expertise chirurgicale et les exigences en matière d’instrumentation pour caractériser à la fois la géométrie et l’organisation ecm ont été un obstacle majeur à l’avancement de la recherche HVD. Les données hstologiques dans la littérature fournissent une image du contenu de la matrice extracellulaire de la valve cardiaque murine, mais uniquement sous la forme d’images 2D, et sont incapables de décrire son architecture 3D^7,8. De plus, la valve cardiaque est à la fois spatialement et temporellement hétérogène, ce qui rend difficile de tirer des conclusions entre les expériences concernant l’organisation de l’ECM si l’échantillonnage et la conformation ne sont pas fixés. Les méthodes conventionnelles de caractérisation 3D, telles que l’IRM ou l’échocardiographie 3D, ne fournissent pas la résolution nécessaire pour résoudre les composants ECM^9,10.

Ce travail détaille un flux de travail entièrement corrélatif où l’hétérogénéité temporelle due au cycle cardiaque a été abordée en fixant la conformation du PV murin avec la pression transvalvulaire hydrostatique. L’hétérogénéité spatiale a été contrôlée avec précision en échantillonnant les régions d’intérêt et en enregistrant des ensembles de données provenant de différentes modalités d’imagerie, en particulier la microscopie électronique à balayage μCT et à balayage de bloc série, sur différentes échelles de longueur. Cette méthode de repérage avec μCT pour guider l’échantillonnage en aval a été proposée précédemment, mais comme la valve pulmonaire présente une variation temporelle, un niveau de contrôle supplémentaire était nécessaire au niveau chirurgical^11.

Les études in vivo décrivant la biomécanique des valves cardiaques murines sont rares et, au lieu de cela, s’appuient sur des modèles informatiques pour décrire le comportement de déformation. Il est d’une importance cruciale que les données extracellulaires locales sur l’échelle nanométrique soient liées à la géométrie et à l’emplacement de la valve cardiaque. Ceci, à son tour, fournit des distributions quantifiables et cartographiées spatialement des protéines ECM contribuant mécaniquement, qui peuvent être utilisées pour renforcer les modèles de valves cardiaques biomécaniques existants^12,13,14.

Protocole

L’utilisation d’animaux dans cette étude était conforme au comité de soins et d’utilisation des animaux en établissement du Nationwide Children’s Hospital en vertu du protocole AR13-00030.

1. Excision valvulaire pulmonaire

1. Autoclavez les outils nécessaires à la dissection de la souris. Cela comprend les ciseaux fins, les micro-pinces, les pinces micro vasculaires, les pinces d’application de pince, les porte-micro-aiguilles, les ciseaux à ressort et les rétracteurs.
2. Acclimater toutes les souris pendant au moins 2 semaines avant l’opération. Retirer les souris C57BL/6, âgées d’environ 1 an, de leur cage et peser, puis euthanasier avec un cocktail kétamine/xylazine (3:1 kétamine:xylazine, 0,01 mL par g) surdosage.
3. Placez la souris en position couchée dorsale sur un plateau et fixez ses membres avec du ruban adhésif. Une fois fixé, effectuez la thoracotomie.
   1. Exposez le cœur en enlevant tout excès de tissu adipeux et de fascia.
   2. Retirer l’oreillette droite et perfuser à travers le ventricule gauche avec une solution saline à température ambiante (0,9% de NaCl). La perfusion devrait prendre environ 20 mL sur 30 s. Il en résulte une exsanguination de la souris.
4. Enlevez tout le cœur en coupant la veine cave supérieure, la veine cave inférieure, l’artère pulmonaire et l’aorte. Des précautions particulières doivent être prises pour l’artère pulmonaire. Coupez environ 2 mm au-dessus de la jonction ventriculo-artérielle, car celle-ci servira de conduit pour la pressurisation.
5. Retirez les ventricules gauche et droit pour exposer les chambres à la pression atmosphérique. Assurez-vous que la structure du tronc pulmonaire ne doit pas être affectée par l’ablation des ventricules.

2. Fixation de la pression de la valve pulmonaire

1. Tube de pressurisation anastomose avec artère pulmonaire, laissant une distance d’environ 1 mm entre la jonction sino-tubulaire et l’extrémité du tube pour s’adapter aux grands mouvements des folioles et du tronc pulmonaire.
2. Élever le réservoir à une pression physiologique analogue et le remplir avec la solution saline. Testez le système d’écoulement pour vous assurer qu’il n’y a pas de blocages ou de bulles d’air.
3. Fixez un robinet d’arrêt à la valve pulmonaire anastomosée et assurez-vous d’un débit adéquat à travers le tube (c.-à-d. pas de bulles d’air) en changeant le tractus d’écoulement. Une fois que le débit est adéquat, basculez l’écoulement vers la valve pulmonaire anastomosée et assurez la pressurisation du tronc pulmonaire. Ceci est identifié par la distention du tronc pulmonaire.
4. Une fois la pressurisation du tronc pulmonaire confirmée, incorporer progressivement une solution fixatrice primaire (1,25% de glutaraldéhyde, 1,0% de paraformaldéhyde dans du cacodylate de 0,15 M) jusqu’à ce que la solution saline soit purgée. Cela se fait en retirant une partie, environ 25% de la capacité du réservoir, de la solution saline et en la remplaçant par le fixateur primaire.
   ATTENTION : Les fixateurs utilisés (paraformaldéhyde et glutaraldéhyde) sont très toxiques et un équipement de protection individuelle (EPI) approprié doit être porté pour assurer la sécurité.
5. Placez une gaze imbibée de fixateur sur l’échantillon de tissu pour éviter le dessèchement.
6. Perfuser le fixateur pendant 3 h, en remplissant le réservoir au besoin pour maintenir une pression constante. Tout au long de la fixation, il n’est pas rare que la valve pulmonaire rétrécisse à cause de la fixation chimique. Si tel est le cas, reconstituez constamment le réservoir avec un fixateur primaire pour maintenir la pression physiologique.
7. Conserver la valve cardiaque dans la solution fixatrice à 4 °C jusqu’à utilisation. Les échantillons ont été conservés jusqu’à 1 semaine sans aucune différence perceptible.

3. Coloration et encastrement de l’échantillon en bloc^15,16

ATTENTION : Les réactifs colorants utilisés dans cette section (ferrocyanure de potassium, tétroxyde d’osmium, thiocarbohydrazide, aspartate de plomb et acétate d’uranyle) sont très toxiques et doivent être manipulés avec un soin extrême. L’utilisation d’une hotte et d’un EPI approprié est conseillée.

1. Coloration
   1. Lavez l’échantillon de valve cardiaque fixe pendant 5 min avec un tampon cacodylate froid de 0,15 M. Répétez le lavage deux fois de plus.
   2. Immerger complètement la valve cardiaque dans une solution de ferrocyanure de potassium à 1,5%, de cacodylate de 0,15 M, de chlorure de calcium de 2 mM et de tétroxyde d’osmium à 2%, sur de la glace pendant 1 h.
   3. Pendant l’incubation de l’échantillon, préparer une solution de thiocarbohydrazide (TCH) en dissolvant 0,1 g de TCH dans 10 mL de ddH₂O. Placer la solution dans un four à 60 °C pendant 1 h. Agitez doucement périodiquement pour vous assurer que le TCH est complètement dissous. Filtrer la solution à travers un filtre à seringue de 0,22 μm immédiatement avant utilisation.
   4. Laver les échantillons à température ambiante ddH₂O en les plaçant dans un tube de ddH_2Opendant 5 min et agiter légèrement en secouant le récipient. Répétez ce processus trois fois.
   5. Placez-le dans une solution TCH filtrée pendant 20 min à température ambiante. Effectuez l’étape de lavage trois fois (5 min chacune) avec la température ambiante ddH₂O comme décrit à l’étape 3.1.4.
   6. Une fois cela fait, placez l’échantillon dans du tétroxyde d’osmium à 2 % pendant 30 min à température ambiante. Ensuite, lavez-le à nouveau pendant un total de trois fois pendant 5 minutes chacun avec une température ambiante ddH₂O.
   7. Incuber l’échantillon dans de l’acétate d’uranyle à 1 % pendant la nuit à 4 °C.
   8. Pendant ce temps, faire une solution de 0,066 g de nitrate de plomb dans 10 mL de solution stock d’acide aspartique. Ajustez le pH à 5,5 avec 1 N KOH. Placer la solution dans un four à 60 °C pour dissoudre le nitrate de plomb.
   9. Après l’incubation pendant la nuit, effectuez l’étape de lavage comme décrit à l’étape 3.1.4. Répétez trois fois. Ensuite, incuber le tissu valvulaire cardiaque dans une solution d’aspartate de plomb à partir de l’étape 3.1.8 dans un four à 60 °C pendant 30 min.
2. Déshydratation
   1. Lavez les mouchoirs pendant 5 min à température ambiante avec ddH₂O. Répétez trois fois.
   2. Faire des solutions fraîches de 20%, 50%, 70%, 90% et 100% d’éthanol dans ddH₂O. Conserver sur la glace jusqu’à utilisation.
   3. Pour déshydrater le tissu valvulaire cardiaque. Effectuer des traitements ultérieurs de 20%, 50%, 70% et 90% d’éthanol sur de la glace pendant 5 min chacun. Ensuite, effectuez deux traitements ultérieurs d’éthanol à 100% sur de la glace pendant 5 min.
   4. Déplacez le tissu vers de l’acétone glacée pendant 10 min. Ensuite, placer dans de l’acétone fraîche à température ambiante pendant 10 min.
3. Encastrement
   1. Fabriquer le mélange de résine (voir tableau des matériaux)selon les spécifications du fabricant: 11,4 g du composant A, 10 g du composant B, 0,3 g du composant C et 0,05-0,1 g du composant D. Mélanger d’abord les composants A et B en chauffant chacun des composants à 60 °C avant d’ajouter les composants C et D. Le mélange se transformera en une couleur ambrée lors de l’ajout des composants C et D. Il sera uniforme lorsqu’il sera correctement mélangé.
   2. Faites des mélanges avec des rapports de volume de 25:75, 50:50 et 75:25 résine:acétone. Mélanger.
   3. Placer les tissus dans les traitements ultérieurs du mélange résine:acétone 25:75, 50:50 et 75:25 pendant 2 h chacun à température ambiante.
   4. Placez les tissus dans de la résine à 100% pendant la nuit à température ambiante.
   5. Le lendemain, placez les tissus dans de la résine fraîche à 100% pendant 2 h à température ambiante.
   6. Transférer les tissus valvulaires cardiaques dans une capsule d’incorporation, remplacer par de la résine fraîche à 100% et les placer dans un four à 60 °C pendant 48 h pour durcir.
4. Effectuez une imagerie corrélative comme indiqué ci-dessous.

4. Imagerie par micro-tomodensitométrie

1. Montez le bloc d’échantillon de résine sur un porte-échantillon μCT avec un adhésif (colle ou ruban adhésif double face fonctionne bien).
2. Placez le support dans la chambre μCT et fixez-le sur la scène en vissant la pince de manière à ce qu’il n’y ait pas de mouvement du support. Le mouvement de l’échantillon pendant la numérisation diminuera la qualité de l’image.
3. Ouvrez l’interface utilisateur μCT en double-cliquant sur l’icône. Ajoutez un projet en sélectionnant le signe + en regard de Projets et remplissez les champs nécessaires.
4. Une fois celui-ci créé, recherchez le projet créé et sélectionnez-le en cliquant dessus. Cela ouvrira une deuxième colonne Acquisitions. Sélectionnez le + en regard de Acquisitions et remplissez les champs nécessaires.
5. Fermez les portes de la chambre et armez le système en appuyant sur le bouton d’armement sur le panneau avant ou sur le μCT. Réchauffez les rayons X de l’interface utilisateur en sélectionnant le bouton indiquant Warmup.
   REMARQUE: Le système éteindra automatiquement les rayons X après une procédure d’échauffement réussie. Activez les rayons X en sélectionnant le bouton.
6. Ajustez la rotation de l’étage de manière à ce que le centre de rotation de l’échantillon ne s’écarte pas du centre du moniteur (c.-à-d. que l’échantillon se trouve dans le champ de vision pendant toute la durée du balayage). Pour le système utilisé pour cette expérience, cela implique d’ajuster l’étape de la région d’intérêt (ROI) sous l’onglet déroulant comme détaillé ci-dessous.
   1. Réglez le réglage de l’étape ROI en réglant l’angle de rotation sur 0° et en marquant le bord de l’échantillon. L’échantillon est ensuite tourné à 180° et le bord de l’échantillon est marqué à nouveau.
   2. Ajustez la position de l’axe X de l’étape ROI de manière à ce que le bord de l’échantillon se situe entre ces deux extrêmes. Répétez ce processus pour des angles de rotation de 90° et de 270° pour la position y.
   3. Dans le cas où la rotation de l’échantillon provoque le déplacement des bords hors du champ de vision, diminuez le grossissement des besoins en μCT jusqu’à ce que les bords de l’échantillon soient visibles aux angles définis ci-dessus et qu’un réglage grossier de l’étage ROI puisse être effectué.
   4. Une fois réglé au grossissement inférieur, déplacez l’échantillon ou le détecteur pour augmenter le grossissement et les positions de retour sur investissement peuvent être ajustées finement.
      REMARQUE: Ce processus peut devoir être répété pour assurer l’alignement. Un alignement correct se traduit par un échantillon qui montre peu ou pas de mouvement horizontal à travers tous les angles de rotation de l’échantillon.
7. Ajustez le μCT aux paramètres de numérisation souhaités à l’aide du logiciel du fabricant. Ces paramètres comprennent le potentiel du tube, le courant du tube, la distance du détecteur, la distance de l’échantillon, le temps d’exposition, la trajectoire et le nombre de projections (voir le tableau S1 pour les paramètres d’acquisition μCT utilisés dans cette étude).
   REMARQUE: Les paramètres d’étalonnage, tels que les balayages de champ clair et de champ sombre, doivent être conservés selon les spécifications du fabricant, sauf indication contraire. Par exemple, si un échantillon est trop grand et que le système ne peut pas déplacer l’échantillon hors de la vue de champ, l’échantillon doit être retiré pour effectuer des analyses d’étalonnage de champ clair.
8. Une fois les paramètres définis, une approximation de la durée de l’analyse peut être vue en appuyant sur le bouton Estimation du temps. Sélectionnez le bouton Démarrer pour commencer l’analyse.
9. Une fois l’analyse terminée, assurez-vous que les rayons X sont éteints, dévissez le collier et retirez soigneusement l’échantillon de la chambre μCT.

5. Traitement des échantillons et corrélation des images

1. Reconstruire des projections μCT à l’aide d’un algorithme de rétroprojection filtré avec le logiciel fourni par le fabricant (voir Tableau des matériaux).
   1. Sélectionnez l’onglet Recon en haut de l’écran. Sélectionnez l’onglet Projet et acquisition.
   2. Sélectionnez le modèle de reconnaissance associé à la rétroprojection filtrée. Appuyez sur le bouton Démarrer la reconnaissance.
2. Identifiez et segmentez la valve pulmonaire à l’aide d’un logiciel de traitement d’image. Cela nécessite une connaissance préalable de l’anatomie de la valve pulmonaire¹⁷. À des pressions artérielles élevées, les folioles coaptent et bloquent la lumière de la valve pulmonaire.
3. Identifiez l’orientation du découpage par rapport à la direction de balayage et à l’échantillon. Réorientez l’échantillon de manière à ce que la direction de tranchage soit alignée sur l’axe souhaité.
4. Identifiez les régions d’intérêt pour l’imagerie à haute résolution. Dans cette expérience, le ventre (milieu) de la foliole et la jonction artério-valvulaire ont été choisis.
5. Retirez l’excès de résine et échantillonnez par lame de rasoir ou ponçage pour les gros morceaux de matériau, ou par microtome pour les morceaux plus fins.
6. Une fois à un endroit d’intérêt, comparez le spécimen physique avec des tranches μCT virtuelles pour confirmer l’emplacement. Cela a été fait en comparant les caractéristiques anatomiques à la section transversale.

6. Microscopie électronique à balayage de face de bloc série¹⁸

1. Réduire la section transversale de l’échantillon pour tenir compte du SBF-SEM, environ 2,0 x 1,5 x 1,8 mm.
2. Montez l’échantillon coupé sur le talon en aluminium SBF-SEM à l’aide d’époxy.
3. Enduire le bloc d’échantillons d’or de 35 nm. Faites tourner l’échantillon sur la plate-forme pour appliquer une couche uniforme de revêtement.
4. Ventilez la chambre SBF-SEM et ajustez la hauteur de la lame du couteau à la hauteur eucentrique du microscope.
5. Insérez l’échantillon et nivelez le talon de l’échantillon.
6. Image dans des conditions de vide faible pour éviter la charge et avec détecteur de rétrodiffusion (voir le tableau S2 pour les paramètres d’acquisition SBF-SEM).
7. Imagez et assemblez plusieurs régions d’intérêt à différents grossissements à l’aide d’un logiciel automatisé (voir Tableau des matériaux).

Résultats

L’anastomose de l’artère pulmonaire au tube de pressurisation est illustrée à la figure 1A. Après l’application de la pression hydrostatique, le tronc pulmonaire se distend radialement(Figure 1B)indiquant que les feuillets de la valve pulmonaire sont dans une configuration fermée. La conformation valvulaire pulmonaire a été confirmée par μCT. Dans ce cas, les folioles étaient coapt (fermées) et l’anneau était circulaire (...

Discussion

L’enlèvement des ventricules sert à deux fins. Premièrement, exposer le côté ventricule à la pression atmosphérique, n’ayant donc besoin que d’appliquer une pression transvalvulaire du côté artériel de la valve pulmonaire pour se fermer, et deuxièmement, fournir une base stable pour empêcher la torsion du tronc pulmonaire. Pendant la pressurisation, le tronc pulmonaire se distendait radialement et inférieurement, ce qui le rend sujet à la torsion, provoquant l’effondrement du tronc pulmonaire. Le pr...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
25% glutaraldehyde (aq)	EMS	16210	Primary fixative component
0.9% sodium chloride injection	Hospira Inc.	NDC 0409-4888-10
1 mL syringe	BD	309659
10 mL syringe	BD	309604
200 proof ethanol	EMS	15055
22G needle	BD	305156
3 mL syringe	BD	309657
3-way stopcock	Smiths Medical ASD, Inc.	MX5311L
4% osmium tetroxide	EMS	19150	Staining component
4% paraformaldehyde (aq)	EMS	157-4-100	Primary fixative component
Absorbable hemostat	Ethicon	1961
Acetone	EMS	10012
Black polyamide monofilament suture, 10-0	AROSurgical instruments Corporation	TI38402
Black polyamide monofilament suture, 6-0	AROSurgical instruments Corporation	SN-1956
C57BL/6 mice	Jackson Laboratories	664	Approximately 1 yo
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	10043-52-4
Clamp applying forcep	FST	00072-14
Cotton tip applicators	Fisher Scientific	23-400-118
DPBS	Gibco	14190-144
Dumont #5 forcep	FST	11251-20
Dumont #5/45 forceps	FST	11251-35
Dumont #7 fine forcep	FST	11274-20
Durcupan ACM resin	EMS	14040	For embedding
Fine scissor	FST	14028-10
Heliscan microCT	Thermo Fisher Scientific		Micro-CT
Ketamine hydrochloride injection	Hospira Inc.	NDC 0409-2053
L-aspartic acid	Sigma-Aldrich	56-84-8	Staining component
Lead nitrate	EMS	17900	Staining component
low-vacuum backscatter detector	Thermo Fisher Scientific	VSDBS	SEM backscatter detector
Micro-adson forcep	FST	11018-12
Millex-GP filter, 0.22 um, PES 33mm, non-sterile	EMD Millipore	SLGP033NS
Non-woven songes	McKesson Corp.	94442000
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate	Sigma-Aldrich	14459-95-1	Staining component
Potassium hydroxide	Sigma-Aldrich	1310-58-3
Pressure monitor line	Smiths Medical ASD, Inc.	MX562
Saline solution (sterile 0.9% sodium chloride)	Hospira Inc.	NDC 0409-0138-22
Size 3 BEEM capsule	EMS	69910-01	Embedding container
Sodium cacodylate trihydrate	Sigma-Aldrich	6131-99-3	Buffer
Solibri retractors	FST	17000-04
Sputter, carbon and e-beam coater	Leica	EM ACE600	Gold coater
Surgical microscope	Leica	M80
Thiocarbohydrazide (TCH)	EMS	21900	Staining component
Tish needle holder/forcep	Micrins	MI1540
Trimmer	Wahl	9854-500
Uranyl acetate	EMS	22400	Staining component
Volumescope scanning electron microscope	Thermo Fisher Scientific	VOLUMESCOPESEM	Serial Block Face Scanning Electron Microscope
Xylazine sterile solution	Akorn Inc.	NADA# 139-236