ניתוח ועיבוד מדגם להדמיה קורלטיבית של שסתום הריאות מורין

Summary

כאן, אנו מתארים זרימת עבודה מתאם עבור כריתה, לחץ, קיבעון, והדמיה של שסתום הריאות מורין כדי לקבוע את הקונפורמציה ברוטו ומבני מטריצה חוץ תאיים מקומיים.

Abstract

הגורמים הבסיסיים למחלות הקשורות לשסתום הלב (HVD) הם חמקמקים. מודלים של בעלי חיים מורינים מספקים כלי מצוין לחקר HVD, עם זאת, המומחיות הכירורגית והאינסמנטלית הנדרשת לכימות מדויק של המבנה והארגון על פני קשקשים באורך רב עיכבו את התקדמותו. עבודה זו מספקת תיאור מפורט של ניתוח מורין, כתמי גוש, עיבוד מדגם, והליכי הדמיה מתאם לתיאור שסתום הלב בקשקשים באורך שונה. לחץ טרנס-וואולי הידרוסטטי שימש לשליטה בהטרוגניות הטמפורלית על ידי תיקון כימי של קונפורמציה שסתום הלב. טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (μCT) שימשה לאישור הגיאומטריה של שסתום הלב ולספק התייחסות לעיבוד מדגם במורד הזרם הדרוש למיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת פנים של בלוק טורי (SBF-SEM). תמונות SEM טוריות ברזולוציה גבוהה של המטריצה החוץ-תאית (ECM) צולמו ושוחזרו כדי לספק ייצוג תלת-ממדי מקומי של הארגון שלה. שיטות הדמיה μCT ו- SBF-SEM היו אז בקורלציה כדי להתגבר על השונות המרחבית על פני שסתום הריאות. למרות העבודה המוצגת היא אך ורק על שסתום הריאות, מתודולוגיה זו יכולה להיות מאומצת לתיאור הארגון ההיררכי במערכות ביולוגיות והיא מרכזית עבור האפיון המבני על פני קשקשים באורך מרובה.

Introduction

שסתום הריאות (PV) משמש כדי להבטיח זרימת דם חד כיוונית בין החדר הימני לעורק הריאות. מומים שסתום ריאות קשורים עם מספר צורות של מחלת לב מולדת. הטיפול הנוכחי למחלת שסתום לב מולדת (HVD) הוא תיקון valvular או החלפת שסתום, אשר יכול לדרוש ניתוחים פולשניים מרובים לאורך חייו של המטופל¹. זה כבר מקובל כי הפונקציה של שסתום הלב נגזר מהמבנה שלה, המכונה לעתים קרובות את המבנה-פונקציה בקורלציה. ליתר דיוק, המאפיינים הגיאומטריים והביומכניים של הלב מכתיבים את תפקידו. המאפיינים המכניים, בתורם, נקבעים על ידי הרכב וארגון של ECM. על ידי פיתוח שיטה לקביעת המאפיינים הביומכניים של שסתומי לב מורינה, מודלים בעלי חיים מהונדסים יכולים לשמש כדי לחקור את התפקיד של ECM על תפקוד שסתום הלב תפקוד לקוי^2,3,4,5.

מודל בעלי החיים המוריני נחשב זה מכבר לסטנדרט למחקרים מולקולריים מכיוון שמודלים מהונדסים זמינים יותר בעכברים בהשוואה למינים אחרים. מודלים מהונדסים מורין לספק פלטפורמה רב-תכליתית לחקר מחלות הקשורות שסתום לב⁶. עם זאת, המומחיות הכירורגית ודרישות המכשור לאפיון הן הגיאומטריה והן ארגון ECM היוו משוכה משמעותית בהתקדמות מחקר HVD. נתונים Hstological בספרות מספק תמונה לתוך תוכן מטריצה חוץ תאית שסתום לב מורין, אבל רק בצורה של תמונות 2D, ואינם מסוגלים לתאר את הארכיטקטורה 3D שלה^7,8. בנוסף, שסתום הלב הוא הן מרחבי והן זמני הטרוגניים, מה שמקשה להסיק מסקנות על פני ניסויים לגבי ארגון ECM אם הדגימה וההתאמה אינם קבועים. שיטות אפיון תלת-ממדיות קונבנציונליות, כגון MRI או אקו-קרדיוגרפיה תלת-ממדית, אינן מספקות את הפתרון הדרוש לפתרון רכיבי ECM^9,10.

עבודה זו מפרטת זרימת עבודה מתאם לחלוטין שבו הטרוגניות הטמפורלית עקב מחזור הלב טופלה על ידי תיקון הקונפורמציה של PV מורין עם לחץ טרנסוולבולרי הידרוסטטי. ההטרוגניות המרחבית נשלטה דווקא על ידי דגימת אזורי עניין ורישום ערכות נתונים מאופני הדמיה שונים, במיוחד μCT ומיקרוסקופיית פנים בלוק סדרתית סורקת מיקרוסקופיית אלקטרונים, על פני סולמות אורך שונים. שיטה זו של סקאוטינג עם μCT להנחיית דגימה במורד הזרם הוצעה בעבר, אך מכיוון ששסתום הריאות מציג וריאציה זמנית, היה צורך ברמת שליטה נוספת ברמה הניתוחית¹¹.

במחקרים המתארים ביומכניקה של שסתום לב מוריני הם דלילים, ובמקום זאת, מסתמכים על מודלים חישוביים כאשר הם מתארים את התנהגות העיוות. זה בעל חשיבות קריטית כי נתונים חוץ תאיים מקומיים על סולם אורך ננומטר להיות קשורים הגיאומטריה ואת המיקום של שסתום הלב. זה, בתורו, מספק לכימות, מופה מרחבי הפצות של חלבוני ECM תורמים מכנית, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לחזק את המודלים הקיימים שסתום הלב הביומכני^12,13,14.

Protocol

השימוש בבעלי חיים במחקר זה היה בהתאם לוועדת הטיפול בבעלי חיים של בית החולים לילדים בפריסה ארצית תחת פרוטוקול AR13-00030.

1. כריתת שסתום ריאות

1. תבודד אוטומטית את הכלים הדרושים עבור ניתוח העכבר. זה כולל מספריים עדינים, מלקחיים זעירים, מלחציים מיקרו וסקולריים, מלקחיים החלת מלחציים, מחזיקי מיקרונידל, מספריים קפיציים ומפסקים.
2. התאקלם כל העכברים במשך מינימום של 2 שבועות לפני הניתוח. הסר C57BL/6 עכברים, בערך 1 שנה של גיל, מן הכלובים שלהם לשקול, ולאחר מכן להרדים עם קוקטייל קטמין / קסילאצין (3:1 קטמין:xylazine, 0.01 מ"ל לג גרם) מנת יתר.
3. הנח את העכבר בתנוחת קליטת גדוש על מגש ואבטח את גפיו בקלטת. לאחר המאובטח, לבצע את בית החזה.
   1. לחשוף את הלב על ידי הסרת כל רקמת שומן עודף fascia.
   2. הסר את האטריום הימני ולפרף דרך החדר השמאלי עם תמיסת מלח בטמפרטורת החדר (0.9% NaCl). זלוף צריך לקחת כ 20 מ"ל מעל 30 s. התוצאה היא חימת העכבר.
4. הסר את הלב כולו על ידי ניתוק הוועד הנבי מעולה, וונה קווה נחותה, עורק ריאות, ואבי העורקים. יש לנקוט בזהירות מיוחדת לעורק הריאות. חותכים כ 2 מ"מ מעל צומת פיתום עורקים, כמו זה ישמש צינור ללחץ.
5. הסר את החדרים השמאליים והימנים כדי לחשוף תאים ללחץ אטמוספרי. ודא כי המבנה של גזע הריאות צריך להיות מושפע על ידי הסרת החדרים.

2. קיבוע לחץ של שסתום ריאות

1. צינורות לחץ Anastomose עם עורק ריאות, משאירים מרחק של כ 1 מ"מ בין הצומת הסיני-צינורי לבין סוף הצינורות כדי להכיל תנועות גדולות של העלונים וגזע הריאות.
2. העלו את המאגר ללחץ פיזיולוגי אנלוגי ומלאו אותו בתמיסת המלח. בדוק את מערכת הזרימה כדי לוודא שאין חסימות או בועות אוויר.
3. חבר פקק שסתום ריאות anastomosed ולהבטיח זרימה נאותה דרך הצינורות (כלומר, אין בועות אוויר) על ידי החלפת דרכי היציאה. ברגע הזרימה מספקת, להעביר את התזרים שסתום ריאת anastomosed ולהבטיח לחץ של תא המטען ריאתי. זה מזוהה על ידי התנפצות תא המטען ריאתי.
4. לאחר לחץ של גזע הריאות מאושר, לשלב בהדרגה פתרון קבוע ראשוני (1.25% גלוטרלדהיד, 1.0% paraformaldehyde ב 0.15 M cacodylate) עד תמיסת מלח מטוהר. זה נעשה על ידי הסרת חלק, כ -25% מקיבולת המאגר, של תמיסת מלח והחלפתו עם הקיבעון העיקרי.
   זהירות: יש לענוד את הקיבורים המשמשים (paraformaldehyde ו- glutaraldehyde) רעילים מאוד וציוד מגן אישי מתאים (PPE) כדי להבטיח את הבטיחות.
5. מניחים גזה ספוגה הקיבעון על דגימת הרקמה כדי למנוע ייבוש.
6. לנטרל את הקיבעון עבור 3 שעות, מילוי המאגר לפי הצורך כדי לשמור על לחץ מתמיד. לאורך כל הקיבעון, זה לא נדיר עבור שסתום הריאות להתכווץ בגלל הקיבעון הכימי. אם זה המקרה, כל הזמן לחדש את המאגר עם קיבעון ראשוני כדי לשמור על לחץ פיזיולוגי.
7. לאחסן את שסתום הלב בפתרון הקיבויע ב 4 °C (5 °F) עד השימוש. דגימות אוחסנו עד שבוע ללא כל הבדל ניכר.

3. כתמים והטבעה מדגם En גוש^15,16

זהירות: ריאגנטים מכתימים המשמשים בסעיף זה (אשלגן ferrocyanide, אוסמיום tetroxide, thiocarbohydrazide, אספרטט עופרת, אורניל אצטט) הם רעילים מאוד ויש לטפל בהם בזהירות רבה. מומלץ להשתמש במכסה אדים ו- PPE מתאים.

1. כתמים
   1. לשטוף את דגימת שסתום הלב הקבוע במשך 5 דקות עם חיץ קקודילט 0.15 M קר. חזור על הכביסה פעמיים נוספות.
   2. לגמרי להטביע את שסתום הלב בתמיסה של 1.5% אשלגן ferrocyanide, 0.15 M קקודילאט, 2 mM סידן כלוריד, ו 2% osmium tetroxide, על קרח במשך 1 שעה.
   3. בזמן המדגם הוא דגירה, להכין פתרון thiocarbohydrazide (TCH) על ידי המסת 0.1 גרם של TCH ב 10 מ"ל של ddH₂O. מניחים את הפתרון בתנור 60 °C ל 1 שעה. התעצבנו בעדינות מעת לעת כדי להבטיח ש-TCH יתמוסס לחלוטין. סנן את הפתרון באמצעות מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר מיד לפני השימוש.
   4. לשטוף את הדגימות עם טמפרטורת החדר ddH₂O על ידי הצבת אותם בצינור של ddH₂O במשך 5 דקות מעט להתסיס אותו על ידי ניעור המיכל. חזור על תהליך זה שלוש פעמים.
   5. מניחים אותו בתמיסת TCH מסוננת למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. בצע את שלב הכביסה שלוש פעמים (5 דקות כל אחד) עם טמפרטורת החדר ddH₂O כמתואר בשלב 3.1.4.
   6. לאחר סיום, מניחים את המדגם ב 2% osmium tetroxide במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. ואז לשטוף אותו שוב בסך הכל שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחד עם טמפרטורת החדר ddH₂O.
   7. לדגור את המדגם ב 1% אורניל אצטט לילה ב 4 °C (50 °F).
   8. במהלך תקופה זו, להפוך פתרון של 0.066 גרם של עופרת חנקתי ב 10 מ"ל של תמיסה ציר חומצה אספרטית. כוונן את ה- pH ל- 5.5 עם 1 N KOH. מניחים את התמיסה בתנור 60 מעלות צלזיוס כדי להמיס עופרת חנקתית.
   9. לאחר הדגירה הלילית, בצע את שלב הכביסה כמתואר בשלב 3.1.4. חזור שלוש פעמים. לאחר מכן, לדגור את רקמת שסתום הלב בתמיסת אספרטט עופרת בשלב 3.1.8 בתנור 60 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
2. התייבשות
   1. לשטוף את הרקמות במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר עם ddH₂O. חזור שלוש פעמים.
   2. הכינו פתרונות חדשים של 20%, 50%, 70%, 90% ו-100% אתנול ב-ddH₂O.
   3. כדי לייבש את רקמת שסתום הלב. בצע טיפולים הבאים של 20%, 50%, 70%, ו 90% אתנול על קרח במשך 5 דקות כל אחד. לאחר מכן בצע שני טיפולים הבאים של 100% אתנול על קרח במשך 5 דקות.
   4. מעבירים את הרקמה לאצטון קר כקרח למשך 10 דקות. לאחר מכן מניחים אצטון טרי בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.
3. הטבעה
   1. הפוך את תערובת שרף (ראה טבלה של חומרים) על פי מפרטי היצרן: 11.4 גרם של רכיב A, 10 גרם של רכיב B, 0.3 גרם של רכיב C, ו 0.05-0.1 גרם של רכיב D. בתחילה לערבב רכיבים A ו- B על ידי חימום כל אחד מהרכיבים ל 60 °C (70 °F) לפני הוספת רכיבים C ו- D. התערובת תהפוך לצבע ענבר עם הוספת רכיבים C ו- D. זה יהיה אחיד כאשר מעורבב כראוי.
   2. הפוך תערובות עם יחסי נפח של 25:75, 50:50, ו 75:25 שרף:אצטון. מערבבים היטב.
   3. מניחים רקמות בטיפולים הבאים של 25:75, 50:50, ו 75:25 שרף:תערובת אצטון במשך 2 שעות כל אחד בטמפרטורת החדר.
   4. מניחים רקמות ב-100% שרף למשך הלילה בטמפרטורת החדר.
   5. למחרת, מניחים רקמות ב-100% שרף טרי למשך 2 שעות בטמפרטורת החדר.
   6. מעבירים את רקמות שסתום הלב לקפסולה משובצת, מחליפה שרף טרי של 100%, ומניחים בתנור של 60 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות לריפוי.
4. בצע הדמיה מתאמת כפי שמוצג להלן.

4. הדמיית טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת

1. הר את בלוק דגימת השרף על מחזיק מדגם μCT עם דבק (דבק או סרט דו צדדי עובד טוב).
2. מניחים את המחזיק בתא μCT ולתקן אותו על הבמה על ידי בורג הקולט כך שאין תנועה של המחזיק. תנועה לדוגמה במהלך הסריקה תקטין את איכות התמונה.
3. פתח את ממשק המשתמש של μCT על-ידי לחיצה כפולה על הסמל. הוסף פרוייקט על-ידי בחירת הסימן + לצד פרוייקטים ומלא את השדות הדרושים.
4. לאחר יצירתו, מצא את הפרוייקט שנוצר ובחר אותו על-ידי לחיצה עליו. פעולה זו תפתח עמודה שניה רכישות. בחר את + לצד רכישות ומלא את השדות הדרושים.
5. סגור את דלתות התא ולחמש את המערכת על ידי לחיצה על כפתור החימוש בלוח הקדמי או μCT. חימום צילומי רנטגן מממשק המשתמש על ידי בחירת הכפתור המציין חימום.
   הערה: המערכת תכבה באופן אוטומטי את צילומי הרנטגן לאחר הליך חימום מוצלח. הפעל צילומי רנטגן על-ידי בחירת הלחצן.
6. התאם את סיבוב הבמה כך שמרכז הסיבוב של המדגם לא סוטה ממרכז הצג (כלומר, המדגם נמצא בשדה הראייה עבור הסריקה כולה). עבור המערכת המשמשת לניסוי זה, הדבר כרוך בהתאמת שלב העניין (ROI) תחת הכרטיסיה הנפתחת כמפורט להלן.
   1. הגדר את התאמת שלב ההפרש על-ידי הגדרת זווית הסיבוב ל- 0° וסימון קצה המדגם. לאחר מכן המדגם מסובב ל- 180° וקצה המדגם מסומן שוב.
   2. התאם את מיקום ציר x שלב ROI כך שקצה המדגם יהיה בין שני הקצוות האלה. חזור על תהליך זה עבור זוויות סיבוב של 90° ו- 270° עבור מיקום ה- y.
   3. במקרה שבו סיבוב המדגם גורם לקצוות לצאת משדה הראייה, הקטן את ההגדלה של צרכי ה- μCT עד שקצוות המדגם גלויים בזוויות שנקבעו לעיל וניתן לבצע התאמת שלב ROI גסה.
   4. לאחר ההגדלה התחתונה, הזז את המדגם או את הגלאי כדי להגדיל את ההגדלה וניתן לכוונן את מיקומי ה- ROI.
      הערה: ייתכן שיהיה צורך לחזור על תהליך זה כדי להבטיח יישור. יישור נכון גורם לדוגמה המציגה תנועה אופקית מועטה עד ללא תנועה דרך כל זוויות הסיבוב לדוגמה.
7. התאם את ה- μCT לפרמטרים הרצויים לסריקה באמצעות תוכנת היצרן. פרמטרים אלה כוללים פוטנציאל צינור, זרם צינור, מרחק גלאי, מרחק מדגם, זמן חשיפה, מסלול, ואת מספר התחזיות (ראה טבלה S1 עבור הפרמטרים רכישת μCT המשמש במחקר זה).
   הערה: פרמטרי כיול, כגון שדות שקופים וסריקות שדה כהה, צריכים להישמר במפרט היצרן אלא אם צוין אחרת. לדוגמה, אם דגימה גדולה מדי והמערכת אינה יכולה להזיז את הדגימה מתצוגת השדה, יש להסיר את המדגם כדי לבצע סריקות ברורות של כיול שדה.
8. לאחר הגדרת הפרמטרים, ניתן לראות קירוב של משך הסריקה על-ידי לחיצה על לחצן הערכת זמן. בחר בלחצן התחל כדי להתחיל בסריקה.
9. לאחר השלמת הסריקה, ודא כי צילומי הרנטגן כבויים, לפתוח את הקולט, ולהסיר בזהירות את הדגימה מתא μCT.

5. עיבוד לדוגמה ומתאם תמונה

1. בנייה מחדש של תחזיות μCT באמצעות אלגוריתם הקרנה אחורי מסונן עם התוכנה המסופקת על ידי היצרן (ראה טבלת חומרים).
   1. בחר בכרטיסיה סיור בחלק העליון של המסך. בחר את הכרטיסיה פרוייקט ורכישה.
   2. בחר את השייך לתבנית סיור עם הקרנה אחורית מסוננת. לחץ על לחצן התחל סיור.
2. זהה ופולח את שסתום הריאות באמצעות תוכנת עיבוד תמונה. זה דורש ידע מוקדם של האנטומיה של שסתום הריאות¹⁷. בלחצים עורקיים גבוהים, העלונים coapt וחוסמים את לומן של שסתום הריאות.
3. זהה את כיוון הניקוד ביחס לכיוון הסריקה ולדגימה. כוון מחדש את המדגם כך שכיוון הניתוק מיושר עם הציר הרצוי.
4. זהה אזורים מעניינים עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה. בניסוי זה נבחרו הבטן (האמצעית) של העלון והצומת העורקי-ואלבולרי.
5. הסר את השרף העודף ודגם על ידי סכין גילוח או ליטש עבור חתיכות גדולות של חומר, או על ידי microtome עבור חתיכות עדינות יותר.
6. פעם אחת במיקום של עניין, להשוות את הדגימה הפיזית עם פרוסות μCT וירטואלי כדי לאשר את המיקום. זה נעשה על ידי השוואת תכונות אנטומיות בחתך.

6. בלוק סדרתי פנים סריקת מיקרוסקופיה אלקטרונים¹⁸

1. הפחת את חתך הרוחב של הדגימה כדי להכיל SBF-SEM, כ 2.0 x 1.5 x 1.8 מ"מ.
2. הרכיבו את הדגימה הקצוצה על ספח האלומיניום SBF-SEM באמצעות אפוקסי.
3. מצפים את בלוק הדגימה בזהב של 35 ננומטר. סובבו את הדגימה על הרציף כדי להחיל שכבה אחידה של ציפוי.
4. פתחו את תא SBF-SEM והתאמו את גובה להב הסכין לגובה אוצנטרי מיקרוסקופי.
5. הכנס את הדוגמה והחלק את ספח הדגימה.
6. תמונה בתנאי ואקום נמוכים למניעת טעינה ועם גלאי backscatter (ראה טבלה S2 עבור פרמטרי רכישת SBF-SEM).
7. תמונה ותפירת אזורים מרובים של עניין בהגדלות שונות באמצעות תוכנה אוטומטית(ראה טבלת חומרים ).

תוצאות

אנסטומוזיס של עורק הריאות לצינורות לחצה מוצג באיור 1A. בעקבות הפעלת לחץ הידרוסטטי, תא המטען הריאתי מתנודה באופן רדיאלי(איור 1B)המציין כי עלוני שסתום הריאות נמצאים בתצורה סגורה. התאמה שסתום ריאות אושרה על ידי μCT. במקרה זה, העלונים היו coapt (סגור) ואת annulus היה מעגל...

Discussion

הסרת החדרים משרתת שתי מטרות. ראשית, חשיפת צד החדר ללחץ האטמוספרי, ובכך רק צריך להפעיל לחץ transvalvular מהצד העורקי של שסתום הריאות כדי לסגור, ושנית, מתן בסיס יציב כדי למנוע פיתול של גזע הריאות. במהלך לחץ, תא המטען הריאתי נפסק באופן רדיאלי ונחות, מה שהופך אותו נוטה פיתול, גרימת קריסה של תא המטען הרי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
25% glutaraldehyde (aq)	EMS	16210	Primary fixative component
0.9% sodium chloride injection	Hospira Inc.	NDC 0409-4888-10
1 mL syringe	BD	309659
10 mL syringe	BD	309604
200 proof ethanol	EMS	15055
22G needle	BD	305156
3 mL syringe	BD	309657
3-way stopcock	Smiths Medical ASD, Inc.	MX5311L
4% osmium tetroxide	EMS	19150	Staining component
4% paraformaldehyde (aq)	EMS	157-4-100	Primary fixative component
Absorbable hemostat	Ethicon	1961
Acetone	EMS	10012
Black polyamide monofilament suture, 10-0	AROSurgical instruments Corporation	TI38402
Black polyamide monofilament suture, 6-0	AROSurgical instruments Corporation	SN-1956
C57BL/6 mice	Jackson Laboratories	664	Approximately 1 yo
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	10043-52-4
Clamp applying forcep	FST	00072-14
Cotton tip applicators	Fisher Scientific	23-400-118
DPBS	Gibco	14190-144
Dumont #5 forcep	FST	11251-20
Dumont #5/45 forceps	FST	11251-35
Dumont #7 fine forcep	FST	11274-20
Durcupan ACM resin	EMS	14040	For embedding
Fine scissor	FST	14028-10
Heliscan microCT	Thermo Fisher Scientific		Micro-CT
Ketamine hydrochloride injection	Hospira Inc.	NDC 0409-2053
L-aspartic acid	Sigma-Aldrich	56-84-8	Staining component
Lead nitrate	EMS	17900	Staining component
low-vacuum backscatter detector	Thermo Fisher Scientific	VSDBS	SEM backscatter detector
Micro-adson forcep	FST	11018-12
Millex-GP filter, 0.22 um, PES 33mm, non-sterile	EMD Millipore	SLGP033NS
Non-woven songes	McKesson Corp.	94442000
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate	Sigma-Aldrich	14459-95-1	Staining component
Potassium hydroxide	Sigma-Aldrich	1310-58-3
Pressure monitor line	Smiths Medical ASD, Inc.	MX562
Saline solution (sterile 0.9% sodium chloride)	Hospira Inc.	NDC 0409-0138-22
Size 3 BEEM capsule	EMS	69910-01	Embedding container
Sodium cacodylate trihydrate	Sigma-Aldrich	6131-99-3	Buffer
Solibri retractors	FST	17000-04
Sputter, carbon and e-beam coater	Leica	EM ACE600	Gold coater
Surgical microscope	Leica	M80
Thiocarbohydrazide (TCH)	EMS	21900	Staining component
Tish needle holder/forcep	Micrins	MI1540
Trimmer	Wahl	9854-500
Uranyl acetate	EMS	22400	Staining component
Volumescope scanning electron microscope	Thermo Fisher Scientific	VOLUMESCOPESEM	Serial Block Face Scanning Electron Microscope
Xylazine sterile solution	Akorn Inc.	NADA# 139-236