뮤린 폐 판막의 상관 화상 진찰을 위한 수술 및 견본 처리

요약

여기서, 우리는 뮤린 폐 판막의 절제, 가압, 고정 및 이미징에 대한 상관 관계 워크플로우를 설명하여 총 형태 및 국소 세포외 매트릭스 구조를 결정합니다.

초록

심장 판막 관련 질병 (HVD)의 근본 원인은 애매합니다. Murine 동물 모델은 HVD를 연구하기위한 훌륭한 도구를 제공하지만, 여러 길이의 저울에 걸쳐 구조와 조직을 정확하게 정량화하는 데 필요한 수술 및 기악 전문 지식은 발전을 저해했습니다. 이 작품은 다른 길이 비늘에서 심장 판막을 묘사하기위한 뮤린 해부, en 블록 염색, 샘플 처리 및 상관 관계 이미징 절차에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 수압기압은 심장판막 형성을 화학적으로 고정하여 측두체 이질성을 제어하는 데 사용되었습니다. 마이크로 컴퓨팅 단층 촬영(μCT)은 심장 판막의 형상을 확인하고 직렬 블록 페이스 스캐닝 전자 현미경 검사(SBF-SEM)에 필요한 다운스트림 샘플 처리에 대한 참조를 제공하는 데 사용되었습니다. 세포외 매트릭스(ECM)의 고해상도 직렬 SEM 이미지를 촬영하고 재구성하여 조직의 로컬 3D 표현을 제공합니다. μCT 및 SBF-SEM 이미징 방법은 폐 밸브를 가로지르는 공간 적 변화를 극복하기 위해 상관관계가 있었다. 제시된 작품은 폐 판막에만 있지만, 이 방법론은 생물학적 시스템의 계층 적 조직을 설명하기 위해 채택될 수 있으며 여러 길이 의 구조 특성에 중추적인 역할을 합니다.

서문

폐 판막(PV)은 오른쪽 심실과 폐 동맥 사이의 단방향 혈류를 보장하는 역할을 합니다. 폐 막막 기형은 선천성 심장 질환의 여러 형태와 연관된다. 선천성 심장 판막 질환 (HVD)에 대한 현재 치료는 환자의 일생 동안 다중 침습적 수술을 필요로 할 수있는 valvular 수리 또는 밸브 교체입니다^1. 심장 판막의 기능은 구조에서 유래되는 것으로 널리 받아들여졌으며, 종종 구조 기능 상관 관계라고도 합니다. 보다 구체적으로, 심장의 기하학적 및 생체 역학적 특성은 그 기능을 지시합니다. 기계적 특성은 차례로 ECM의 조성 및 구성에 의해 결정됩니다. 뮤린 심장 판막의 생체역학적 특성을 결정하는 방법을 개발함으로써, 형질전환 동물 모델은 심장 판막 기능 및 기능 장애^2,3,4,5에ECM의 역할을 심문하는 데 사용될 수 있다.

murine 동물 모형은 다른 종에 비교된 마우스에서 더 쉽게 유효하기 때문에 인간적인 모형이 분자 연구 결과를 위한 표준으로 오랫동안 여겨져 왔습니다. 뮤린 트랜스제닉 모델은 심장 판막 관련 질병을 연구하기위한 다양한 플랫폼을 제공합니다^6. 그러나, 기하학과 ECM 조직을 모두 특성화하기 위한 외과 전문 지식과 계측 요구 사항은 HVD 연구를 진행하는 데 큰 장애물이 되었습니다. 문학의 Hstological 데이터는 뮤린 심장 판막 세포 외 매트릭스 함량에 그림을 제공하지만, 단지 2D 이미지의 형태로, 3D^{아키텍처7을}설명 할 수 없습니다^7,8. 또한 심장 판막은 공간적으로나 현세적으로 이질적이기 때문에 샘플링 및 형태가 고정되지 않으면 ECM 조직에 관한 실험 전반에 걸쳐 결론을 도출하기가 어렵습니다. MRI 또는 3D 에코카르디그래피와 같은 기존의 3D 특성화 방법은 ECM 구성 요소^9,10을해결하는 데 필요한^해상도를제공하지 않는다.

이 작품은 심장 사이클로 인한 측두체 이질성이 수력성 기압으로 뮤린 PV의 변형을 고정하여 해결된 완전히 상관관계적인 워크플로우를 자세히 설명합니다. 공간 이질성은 다양한 길이 의 척도에 걸쳐 다양한 이미징 양식, 특히 μCT 및 직렬 블록 얼굴 스캐닝 전자 현미경 검사에서 관심 영역을 샘플링하고 데이터 세트를 등록하여 정확하게 제어되었습니다. 다운스트림 샘플링을 안내하기 위한 μCT로 정찰하는 이 방법은 이전에 제안되었지만, 폐 판막이 시간적 변화를 나타내기 때문에 수술^{수준(11)에}추가적인 수준의 제어가 필요하였다.

뮤린 심장 판막 생체 역학을 설명하는 생체 공학 연구에서는 희소하며 변형 동작을 설명 할 때 계산 모델에 의존합니다. 나노미터 길이 스케일의 로컬 세포 외 데이터가 심장 판막의 형상 및 위치와 관련이 있는 것이 매우 중요합니다. 이는, 차례로, 기존의 생체 역학 심장 판막^{모델(12,13,14)을}강화하는 데 사용될 수 있는 기계적으로 기여하는 ECM 단백질의 정량화^가능하고공간적으로 매핑된 분포를 제공한다.

프로토콜

이 연구에서 동물의 사용은 프로토콜 AR13-00030에 따라 전국 어린이 병원 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 따라했다.

1. 폐 밸브 절제

1. 마우스 해부에 필요한 도구를 자동으로 복제합니다. 여기에는 미세 가위, 마이크로 집게, 마이크로 혈관 클램프, 클램프 적용 집게, 마이크로니들 홀더, 스프링 가위 및 리트랙터가 포함됩니다.
2. 수술 전에 최소 2 주 동안 모든 마우스를 수용하십시오. C57BL/6 마우스를 제거, 약 1 년, 그들의 케이지에서 무게, 다음 케타민 / 자일라진 칵테일 (3:1 케타민 : 자일라진, 0.01 g 당 mL) 과다 복용으로 안락사.
3. 트레이에 등소 재림 위치에 마우스를 놓고 테이프로 팔다리를 고정합니다. 일단 고정되면, thoracotomy을 수행합니다.
   1. 어떤 과잉 지방 조직 및 근막을 제거 하 여 심장을 노출.
   2. 오른쪽 아트리움을 제거하고 실온 식염수 용액 (0.9 % NaCl)으로 왼쪽 심실을 통해 perfuse. 관류는 30 s를 통해 약 20 mL를 취해야한다. 이것은 마우스의 멸종을 초래한다.
4. 우수한 베나 카바, 열등한 베나 카바, 폐 동맥 및 대동맥을 분리하여 심장 전체를 제거하십시오. 폐 동맥에 대한 특별한주의를 기울여야합니다. 이 가압을위한 도관 역할을하므로, 벤트리큘로 동맥 접합 위의 약 2mm를 잘라.
5. 대기압에 챔버를 노출하기 위해 왼쪽 및 오른쪽 심실을 제거합니다. 폐 트렁크의 구조가 심실 제거의 영향을 받지 않아야 하는지 확인합니다.

2. 폐 밸브의 압력 고정

1. 폐 동맥을 가진 아나스토모세 가압 튜브는 전단지와 폐 트렁크의 큰 움직임을 수용하기 위해 중구 관 접합과 튜브의 끝 사이의 약 1mm 거리를 남깁니다.
2. 저수지를 유사한 생리적 압력으로 높이고 식염수 용액으로 채웁니다. 흐름 전달 시스템을 테스트하여 막힘이나 기포가 없는지 확인합니다.
3. 스토퍼드 폐 밸브에 스톱콕을 부착하고 유출로를 전환하여 튜브(예: 기포 없음)를 통해 적절한 흐름을 보장합니다. 흐름이 적절하면 유출을 해부학된 폐 밸브로 전환하고 폐 트렁크의 가압을 보장합니다. 이것은 폐 트렁크 분동에 의해 확인됩니다.
4. 폐 트렁크의 가압이 확인되면, 식염수 용액이 제거될 때까지 1차 고정용액(1.25%, 파라포름알데히드 0.15M)을 점진적으로 통합한다. 이는 식염수 용액의 저장소 용량의 약 25%인 부분을 제거하고 기본 고정제로 대체하여 수행됩니다.
   주의: 사용되는 고정제(파라포름알데히드 및 글루타랄데히드)는 매우 독성이 있으며 안전을 보장하기 위해 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 착용해야 합니다.
5. 건조를 방지하기 위해 조직 샘플 위에 고정 담근 거즈를 놓습니다.
6. 일정한 압력을 유지하기 위해 필요에 따라 저장소를 다시 채우는 3 h에 대한 고정을 퍼퓨즈합니다. 고정 을 통해, 폐 밸브때문에 화학 고정의 축소드문 일이 아니다. 이 경우, 지속적으로 생리적 압력을 유지하기 위해 기본 고정저수지를 보충.
7. 사용 전까지 심장 판막을 고정 용액에 4°C로 저장합니다. 샘플은 눈에 띄는 차이없이 최대 1 주 동안 저장되었습니다.

3. En 블록 샘플 염색 및 임베디먼트^15,16

주의: 이 섹션에 사용되는 염색 시약 (칼륨 페로시니드, 오스뮴 테트란사이드, 티오카르보히드라지드, 납 아스파르타트 및 우란 아세테이트)는 매우 독성이 있으며 극도의 주의를 기울여 처리해야합니다. 연기 후드와 적절한 PPE의 사용은 권장됩니다.

1. 얼룩
   1. 콜드 0.15 M 캐코딜레이트 버퍼로 고정 된 심장 밸브 샘플을 5 분 동안 세척하십시오. 세탁을 두 번 더 반복합니다.
   2. 심장 판막을 1.5% 칼륨 페로시니드, 0.15 M 카코디레이트, 2mM 칼슘 염화칼슘, 2% 오스뮴 테트산화사이드를 1시간 동안 얼음위에 담급한다.
   3. 시료가 배양되는 동안, ddH₂O.의 10mL에서 0.1 g의 TCH를 용해시켜 용액을 60°C 오븐에 1h로 배치하여 티오카르보히드라지드(TCH) 용액을 준비한다. TCH가 완전히 용해되도록 주기적으로 부드럽게 교반합니다. 사용하기 직전에 0.22 μm 주사기 필터를 통해 용액을 필터링합니다.
   4. 샘플을 실온 ddH₂O로 세척하여 ddH₂O의 튜브에 5 분 동안 배치하고 용기를 흔들어 약간 동요하십시오. 이 프로세스를 세 번 반복합니다.
   5. 실온에서 20분 동안 여과된 TCH 솔루션에 배치합니다. 3.1.4 단계에서 설명한 바와 같이 실온 ddH₂O로 세정 단계를 3회(각 5분)수행한다.
   6. 완료되면 실온에서 30 분 동안 2 % 오스뮴 테트산화물에 샘플을 놓습니다. 그런 다음 실온 ddH₂O로 각각 5 분 동안 총 3 회 다시 세척하십시오.
   7. 4°C에서 하룻밤 사이에 1% uranyl 아세테이트로 샘플을 배양합니다.
   8. 이 기간 동안, 아스파르트산 재고 용액의 10mL에서 납 질산0.066 g의 용액을 만든다. 1 N KOH로 pH를 5.5로 조정합니다. 60°C 오븐에 용액을 배치하여 납 질산염을 녹입니다.
   9. 야간 잠복후, 3.1.4 단계에서 설명한 대로 세척 단계를 수행한다. 세 번 반복합니다. 이어서, 60°C 오븐에서 3.1.8단계로부터 30분 동안 심장 판막 조직을 증식한다.
2. 탈수
   1. ddH₂O. 반복세실온에서 5분 동안 티슈를 세척합니다.
   2. _ddH2 O.에서 20%, 50%, 70%, 90%, 100% 에탄올의 신선한 솔루션을 사용할 때까지 얼음을 유지합니다.
   3. 심장 판막 조직을 탈수합니다. 20%, 50%, 70%, 얼음에 90%의 에탄올을 각각 5분 동안 수행합니다. 그런 다음 얼음에 100 % 에탄올의 두 가지 후속 치료를 5 분 동안 수행합니다.
   4. 10 분 동안 얼음 차가운 아세톤으로 조직을 이동합니다. 그런 다음 10 분 동안 실온에서 신선한 아세톤에 놓습니다.
3. 포함
   1. 제조업체의 사양에 따라 수지 혼합물(재료 표참조)을 만듭니다: 부품 A 11.4g, 성분 B 10g, 구성 요소 C 0.3g, 구성 요소 D0.05-0.1 g. 처음에는 구성 요소 C 및 D를 추가하기 전에 각 구성 요소를 60 °C로 가열하여 구성 요소 A와 B를 혼합합니다. 성분 C와 D를 추가하면 혼합물이 호박색으로 변합니다. 제대로 혼합하면 균일합니다.
   2. 25:75, 50:50 및 75:25 수지:아세톤의 부피 비율로 혼합물을 만듭니다. 완전히 섞으세요.
   3. 25:75, 50:50 및 75:25 수지:아세톤 혼합물의 후속 치료에 티슈를 실온에서 각각 2시간씩 배치합니다.
   4. 실온에서 하룻밤 동안 100 % 수지에 조직을 놓습니다.
   5. 다음 날, 실온에서 2 시간 동안 신선한 100 % 수지에서 조직을 배치합니다.
   6. 심장 판막 조직을 임베딩 캡슐로 옮기고, 신선한 100% 수지로 대체하고, 60°C 오븐에 넣고 48h의 경화시로 배치합니다.
4. 아래와 같이 상관 관계 이미징을 수행합니다.

4. 마이크로 컴퓨팅 단층 촬영 이미징

1. 접착제가 있는 μCT 샘플 홀더에 수지 샘플 블록을 장착합니다(접착제 또는 양면 테이프가 잘 작동).
2. 홀더를 μCT 챔버에 넣고 홀더의 움직임이 없을 정도로 콜릿을 나사로 고정하여 스테이지에 고정합니다. 스캔 중에 샘플 이동이 이미지 품질을 저하시다.
3. 아이콘을 두 번 클릭하여 μCT 사용자 인터페이스를 엽니다. 프로젝트 옆에 있는 + 기호를 선택하고 필요한 필드를 채우면 프로젝트를 추가합니다.
4. 이 작업이 만들어지면 생성된 프로젝트를 찾아 클릭하여 선택합니다. 이렇게 하면 두 번째 열 수집이열립니다. 인수 옆 +를 선택하고 필요한 필드를 작성합니다.
5. 챔버 도어를 닫고 전면 패널 또는 μCT의 무장 버튼을 눌러 시스템을 무장. 워밍업을나타내는 버튼을 선택하여 사용자 인터페이스에서 워밍업 엑스레이를 누를 수 있습니다.
   참고: 성공적인 워밍업 절차에 따라 시스템이 자동으로 엑스레이를 끕니다. 버튼을 선택하여 엑스레이를 켭니다.
6. 샘플의 회전 중심이 모니터의 중심에서 벗어나지 않도록 스테이지 회전을 조정합니다(즉, 샘플은 전체 스캔에 대한 시야 내에 있음). 이 실험에 사용되는 시스템의 경우 아래 자세히 설명된 대로 드롭다운 탭 아래에 있는 관심 영역(ROI) 스테이지를 조정하는 작업이 포함됩니다.
   1. 회전 각도를 0°로 설정하고 샘플의 가장자리를 표시하여 ROI 스테이지 조정을 설정합니다. 그런 다음 샘플이 180°로 회전되고 샘플의 가장자리가 다시 표시됩니다.
   2. 샘플의 가장자리가 이 두 극단 사이에 있도록 ROI 단계 x 축 위치를 조정합니다. y-위치에 대해 90° 및 270°의 회전 각도에 대해 이 프로세스를 반복합니다.
   3. 시료의 회전으로 인해 가장자리가 시야에서 벗어나게 하는 경우, 위의 세트 각도에서 시료의 가장자리가 표시될 때까지 μCT 요구의 배율을 감소시키고 거친 ROI 단계 조정이 이루어질 수 있다.
   4. 낮은 배율로 조정되면, 배율을 높이기 위해 시료 또는 검출기를 이동시키고 ROI 위치를 미세 조정할 수 있다.
      참고: 정렬을 보장하기 위해 이 프로세스를 반복해야 할 수 있습니다. 적절한 정렬은 모든 샘플 회전 각도를 통해 거의 또는 전혀 수평 움직임을 표시하지 않는 샘플을 생성합니다.
7. 제조업체의 소프트웨어를 사용하여 필요한 스캐닝 매개변수에 μCT를 조정합니다. 이러한 매개 변수에는 튜브 전위, 튜브 전류, 검출기 거리, 샘플 거리, 노출 시간, 궤적 및 투영 횟수가 포함됩니다(이 연구에서 사용되는 μCT 획득 파라미터의 표 S1 참조).
   참고: 명확한 필드 및 암필드 스캔과 같은 교정 매개 변수는 달리 명시되지 않는 한 제조업체의 사양에 보관해야 합니다. 예를 들어 샘플이 너무 크고 시스템이 샘플을 필드 뷰밖으로 이동할 수 없는 경우 명확한 필드 교정 검사를 수행하려면 샘플을 제거해야 합니다.
8. 매개 변수가 설정되면 시간 추정 버튼을 눌러 스캔 기간의 근사치를 볼 수 있습니다. 시작 버튼을 선택하여 검사를 시작합니다.
9. 스캔 완료 후 X선이 꺼져 있는지 확인하고 콜릿을 풀고 μCT 챔버에서 샘플을 조심스럽게 제거합니다.

5. 샘플 처리 및 이미지 상관 관계

1. 제조업체에서 제공하는 소프트웨어와 함께 필터링된 백 프로젝션 알고리즘을 사용하여 μCT 프로젝션을 재구성합니다(재료 표참조).
   1. 화면 상단의 정찰 탭을 선택합니다. 프로젝트 및 획득 탭을 선택합니다.
   2. 필터링된 뒤로 투영된 정찰 템플릿 연결을 선택합니다. 시작 정찰 버튼을 누르세요.
2. 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 폐 밸브를 식별하고 분할합니다. 이를 위해서는^{폐판막(17)의}해부학에 대한 사전 지식이 필요합니다. 높은 동맥 압력에서 전단지는 응고하여 폐 밸브의 루멘을 차단합니다.
3. 스캐닝 방향 및 샘플과 관련하여 슬라이스 방향을 식별합니다. 슬라이스 방향이 원하는 축과 정렬될 수 있도록 샘플을 방향을 조정합니다.
4. 고해상도 이미징에 대한 관심 영역을 식별합니다. 이 실험에서는 전단지와 아테리오-발비알 접합의 배(가운데)가 선택되었다.
5. 면도날이나 큰 재료조각에 대한 모래로, 또는 미세한 조각을 위해 여분의 수지와 샘플을 제거합니다.
6. 관심 위치에 도착하면 물리적 표본을 가상 μCT 슬라이스와 비교하여 위치를 확인합니다. 이것은 단면에 해부학 적 특징을 비교하여 수행되었습니다.

6. 직렬 블록 얼굴 스캔 전자 현미경 검사¹⁸

1. SBF-SEM, 약 2.0 x 1.5 x 1.8mm를 수용할 수 있도록 시편의 단면을 줄입니다.
2. 에폭시를 사용하여 SBF-SEM 알루미늄 스텁에 트리밍 된 샘플을 장착하십시오.
3. 35nm 골드로 시편 블록을 코팅합니다. 플랫폼에서 샘플을 회전하여 균일한 코팅 층을 적용합니다.
4. SBF-SEM 챔버를 환기시키고 칼날의 높이를 현미경 유중심 높이로 조정합니다.
5. 샘플을 삽입하고 샘플 스텁을 레벨.
6. 충전및 백스캐터 검출기를 방지하기 위해 낮은 진공 조건에서 이미지(SBF-SEM 획득 매개변수의 표 S2 참조).
7. 자동화된 소프트웨어를 사용하여 다양한 배율에서 여러 관심 영역의이미지 및 스티치(재료 표 참조).

결과

가압 튜브에 폐 동맥의 해부학은 도 1A에도시된다. 정수압의 적용에 따라 폐트렁크는 폐밸브 전단지가 폐쇄된 구성에 있음을 나타내는복사(도 1B)를분해한다. 폐 밸브 형태는 μCT에 의해 확인되었다. 이 경우, 전단지는 동술(closed)이고 무효화는 원형(도2A)이었다. 도 2B,C는 고정(도 2B) 또는 동맥 붕...

토론

심실제거는 두 가지 목적을 제공합니다. 첫째, 심실측을 대기압에 노출시켜 폐밸브의 동맥측으로부터 경진압력을 가해 폐트렁크의 비틀림을 방지하기 위한 안정적인 베이스를 제공한다. 가압 하는 동안, 폐 트렁크는 복사 하 고 열등 하 게 분산, 뒤틀린 경향이 만들기, 폐 트렁크의 붕괴를 일으키는. 식염수 용액으로 폐 밸브를 미리 로드하면 가압이 적절하고 시스템에 누출이 있는지 확인하기 위...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
25% glutaraldehyde (aq)	EMS	16210	Primary fixative component
0.9% sodium chloride injection	Hospira Inc.	NDC 0409-4888-10
1 mL syringe	BD	309659
10 mL syringe	BD	309604
200 proof ethanol	EMS	15055
22G needle	BD	305156
3 mL syringe	BD	309657
3-way stopcock	Smiths Medical ASD, Inc.	MX5311L
4% osmium tetroxide	EMS	19150	Staining component
4% paraformaldehyde (aq)	EMS	157-4-100	Primary fixative component
Absorbable hemostat	Ethicon	1961
Acetone	EMS	10012
Black polyamide monofilament suture, 10-0	AROSurgical instruments Corporation	TI38402
Black polyamide monofilament suture, 6-0	AROSurgical instruments Corporation	SN-1956
C57BL/6 mice	Jackson Laboratories	664	Approximately 1 yo
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	10043-52-4
Clamp applying forcep	FST	00072-14
Cotton tip applicators	Fisher Scientific	23-400-118
DPBS	Gibco	14190-144
Dumont #5 forcep	FST	11251-20
Dumont #5/45 forceps	FST	11251-35
Dumont #7 fine forcep	FST	11274-20
Durcupan ACM resin	EMS	14040	For embedding
Fine scissor	FST	14028-10
Heliscan microCT	Thermo Fisher Scientific		Micro-CT
Ketamine hydrochloride injection	Hospira Inc.	NDC 0409-2053
L-aspartic acid	Sigma-Aldrich	56-84-8	Staining component
Lead nitrate	EMS	17900	Staining component
low-vacuum backscatter detector	Thermo Fisher Scientific	VSDBS	SEM backscatter detector
Micro-adson forcep	FST	11018-12
Millex-GP filter, 0.22 um, PES 33mm, non-sterile	EMD Millipore	SLGP033NS
Non-woven songes	McKesson Corp.	94442000
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate	Sigma-Aldrich	14459-95-1	Staining component
Potassium hydroxide	Sigma-Aldrich	1310-58-3
Pressure monitor line	Smiths Medical ASD, Inc.	MX562
Saline solution (sterile 0.9% sodium chloride)	Hospira Inc.	NDC 0409-0138-22
Size 3 BEEM capsule	EMS	69910-01	Embedding container
Sodium cacodylate trihydrate	Sigma-Aldrich	6131-99-3	Buffer
Solibri retractors	FST	17000-04
Sputter, carbon and e-beam coater	Leica	EM ACE600	Gold coater
Surgical microscope	Leica	M80
Thiocarbohydrazide (TCH)	EMS	21900	Staining component
Tish needle holder/forcep	Micrins	MI1540
Trimmer	Wahl	9854-500
Uranyl acetate	EMS	22400	Staining component
Volumescope scanning electron microscope	Thermo Fisher Scientific	VOLUMESCOPESEM	Serial Block Face Scanning Electron Microscope
Xylazine sterile solution	Akorn Inc.	NADA# 139-236