뮤린 폐 판막의 상관 화상 진찰을 위한 수술 및 견본 처리

요약

여기서, 우리는 뮤린 폐 판막의 절제, 가압, 고정 및 이미징에 대한 상관 관계 워크플로우를 설명하여 총 형태 및 국소 세포외 매트릭스 구조를 결정합니다.

초록

심장 판막 관련 질병 (HVD)의 근본 원인은 애매합니다. Murine 동물 모델은 HVD를 연구하기위한 훌륭한 도구를 제공하지만, 여러 길이의 저울에 걸쳐 구조와 조직을 정확하게 정량화하는 데 필요한 수술 및 기악 전문 지식은 발전을 저해했습니다. 이 작품은 다른 길이 비늘에서 심장 판막을 묘사하기위한 뮤린 해부, en 블록 염색, 샘플 처리 및 상관 관계 이미징 절차에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 수압기압은 심장판막 형성을 화학적으로 고정하여 측두체 이질성을 제어하는 데 사용되었습니다. 마이크로 컴퓨팅 단층 촬영(μCT)은 심장 판막의 형상을 확인하고 직렬 블록 페이스 스캐닝 전자 현미경 검사(SBF-SEM)에 필요한 다운스트림 샘플 처리에 대한 참조를 제공하는 데 사용되었습니다. 세포외 매트릭스(ECM)의 고해상도 직렬 SEM 이미지를 촬영하고 재구성하여 조직의 로컬 3D 표현을 제공합니다. μCT 및 SBF-SEM 이미징 방법은 폐 밸브를 가로지르는 공간 적 변화를 극복하기 위해 상관관계가 있었다. 제시된 작품은 폐 판막에만 있지만, 이 방법론은 생물학적 시스템의 계층 적 조직을 설명하기 위해 채택될 수 있으며 여러 길이 의 구조 특성에 중추적인 역할을 합니다.

서문

폐 판막(PV)은 오른쪽 심실과 폐 동맥 사이의 단방향 혈류를 보장하는 역할을 합니다. 폐 막막 기형은 선천성 심장 질환의 여러 형태와 연관된다. 선천성 심장 판막 질환 (HVD)에 대한 현재 치료는 환자의 일생 동안 다중 침습적 수술을 필요로 할 수있는 valvular 수리 또는 밸브 교체입니다^1. 심장 판막의 기능은 구조에서 유래되는 것으로 널리 받아들여졌으며, 종종 구조 기능 상관 관계라고도 합니다. 보다 구체적으로, 심장의 기하학적 및 생체 역학적 특성은 그 기능을 지시합니다. 기계적 특성은 차례로 ECM의 조성 및 구성에 의해 결정됩니다. 뮤린 심장 판막의 생체역학적 특성을 결정하는 방법을 개발함으로써, 형질전환 동물 모델은 심장 판막 기능 및 기능 장애^2,3,4,5에ECM의 역할을 심문하는 데 사용될 수 있다.

murine 동물 모형은 다른 종에 비교된 마우스에서 더 쉽게 유효하기 때문에 인간적인 모형이 분자 연구 결과를 위한 표준으로 오랫동안 여겨져 왔습니다. ....

프로토콜

이 연구에서 동물의 사용은 프로토콜 AR13-00030에 따라 전국 어린이 병원 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 따라했다.

1. 폐 밸브 절제

1. 마우스 해부에 필요한 도구를 자동으로 복제합니다. 여기에는 미세 가위, 마이크로 집게, 마이크로 혈관 클램프, 클램프 적용 집게, 마이크로니들 홀더, 스프링 가위 및 리트랙터가 포함됩니다.
2. 수술 전에 최소 2 주 동안 모든 마우스를 수용하십시오. C57BL/6 마우스를 제거, 약 1 년, 그들의 케이지에서 무게, 다음 케타민 / 자일라진 칵테일 (3:1 케타민 : 자일라진, 0.01 g 당 mL) 과다 복용으로 안락사.
3. 트레이에 등소 재림 위치에 마우스를 놓고 테이프로 팔다리를 고정합니다. 일단 고정되면, thoracotomy을 수행합니다.
   1. 어떤 과잉 지방 조직 및 근막을 제거 하 여 심장을 노출.
   2. 오른쪽 아트리움을 제거하고 실온 식염수 용액 (0.9 % NaCl)으로 왼쪽 심실을 통해 perfuse. 관류는 30 s를 통해 약 20 mL를 취해야한다. 이것은 마우스의 멸종을 초래한다.
4. 우수한 베나 카바, 열등한 베나 카바, 폐 동맥 및 대동맥을 분리하여 심장 전체를 제거하....

결과

가압 튜브에 폐 동맥의 해부학은 도 1A에도시된다. 정수압의 적용에 따라 폐트렁크는 폐밸브 전단지가 폐쇄된 구성에 있음을 나타내는복사(도 1B)를분해한다. 폐 밸브 형태는 μCT에 의해 확인되었다. 이 경우, 전단지는 동술(closed)이고 무효화는 원형(도2A)이었다. 도 2B,C는 고정(도 2B) 또는 동맥 붕.......

토론

심실제거는 두 가지 목적을 제공합니다. 첫째, 심실측을 대기압에 노출시켜 폐밸브의 동맥측으로부터 경진압력을 가해 폐트렁크의 비틀림을 방지하기 위한 안정적인 베이스를 제공한다. 가압 하는 동안, 폐 트렁크는 복사 하 고 열등 하 게 분산, 뒤틀린 경향이 만들기, 폐 트렁크의 붕괴를 일으키는. 식염수 용액으로 폐 밸브를 미리 로드하면 가압이 적절하고 시스템에 누출이 있는지 확인하기 위.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
25% glutaraldehyde (aq)	EMS	16210	Primary fixative component
0.9% sodium chloride injection	Hospira Inc.	NDC 0409-4888-10
1 mL syringe	BD	309659
10 mL syringe	BD	309604
200 proof ethanol	EMS	15055
22G needle	BD	305156
3 mL syringe	BD	309657
3-way stopcock	Smiths Medical ASD, Inc.	MX5311L
4% osmium tetroxide	EMS	19150	Staining component
4% paraformaldehyde (aq)	EMS	157-4-100	Primary fixative component
Absorbable hemostat	Ethicon	1961
Acetone	EMS	10012
Black polyamide monofilament suture, 10-0	AROSurgical instruments Corporation	TI38402
Black polyamide monofilament suture, 6-0	AROSurgical instruments Corporation	SN-1956
C57BL/6 mice	Jackson Laboratories	664	Approximately 1 yo
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	10043-52-4
Clamp applying forcep	FST	00072-14
Cotton tip applicators	Fisher Scientific	23-400-118
DPBS	Gibco	14190-144
Dumont #5 forcep	FST	11251-20
Dumont #5/45 forceps	FST	11251-35
Dumont #7 fine forcep	FST	11274-20
Durcupan ACM resin	EMS	14040	For embedding
Fine scissor	FST	14028-10
Heliscan microCT	Thermo Fisher Scientific		Micro-CT
Ketamine hydrochloride injection	Hospira Inc.	NDC 0409-2053
L-aspartic acid	Sigma-Aldrich	56-84-8	Staining component
Lead nitrate	EMS	17900	Staining component
low-vacuum backscatter detector	Thermo Fisher Scientific	VSDBS	SEM backscatter detector
Micro-adson forcep	FST	11018-12
Millex-GP filter, 0.22 um, PES 33mm, non-sterile	EMD Millipore	SLGP033NS
Non-woven songes	McKesson Corp.	94442000
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate	Sigma-Aldrich	14459-95-1	Staining component
Potassium hydroxide	Sigma-Aldrich	1310-58-3
Pressure monitor line	Smiths Medical ASD, Inc.	MX562
Saline solution (sterile 0.9% sodium chloride)	Hospira Inc.	NDC 0409-0138-22
Size 3 BEEM capsule	EMS	69910-01	Embedding container
Sodium cacodylate trihydrate	Sigma-Aldrich	6131-99-3	Buffer
Solibri retractors	FST	17000-04
Sputter, carbon and e-beam coater	Leica	EM ACE600	Gold coater
Surgical microscope	Leica	M80
Thiocarbohydrazide (TCH)	EMS	21900	Staining component
Tish needle holder/forcep	Micrins	MI1540
Trimmer	Wahl	9854-500
Uranyl acetate	EMS	22400	Staining component
Volumescope scanning electron microscope	Thermo Fisher Scientific	VOLUMESCOPESEM	Serial Block Face Scanning Electron Microscope
Xylazine sterile solution	Akorn Inc.	NADA# 139-236