Cirugía y procesamiento de muestras para imágenes correlativas de la válvula pulmonar murina

Resumen

Aquí, describimos un flujo de trabajo correlativo para la escisión, presurización, fijación e imágenes de la válvula pulmonar murina para determinar la conformación macróstica y las estructuras locales de la matriz extracelular.

Resumen

Las causas subyacentes de la enfermedad relacionada con las válvulas cardíacas (HVD) son esquivas. Los modelos animales murinos proporcionan una excelente herramienta para estudiar la HVD, sin embargo, la experiencia quirúrgica e instrumental requerida para cuantificar con precisión la estructura y la organización en múltiples escalas de longitud han atrofiado su avance. Este trabajo proporciona una descripción detallada de la disección murina, la tinción en bloque, el procesamiento de muestras y los procedimientos de imágenes correlativas para representar la válvula cardíaca en diferentes escalas de longitud. Se utilizó presión transvalvular hidrostática para controlar la heterogeneidad temporal mediante la fijación química de la conformación de la válvula cardíaca. Se utilizó la tomografía micro computarizada (μCT) para confirmar la geometría de la válvula cardíaca y proporcionar una referencia para el procesamiento de muestras aguas abajo necesario para la microscopía electrónica de barrido facial en bloque serie (SBF-SEM). Se tomaron y reconstruyeron imágenes SEM en serie de alta resolución de la matriz extracelular (ECM) para proporcionar una representación 3D local de su organización. Los métodos de imagen μCT y SBF-SEM se correlacionaron para superar la variación espacial a través de la válvula pulmonar. Aunque el trabajo presentado es exclusivamente sobre la válvula pulmonar, esta metodología podría adoptarse para describir la organización jerárquica en sistemas biológicos y es fundamental para la caracterización estructural a través de múltiples escalas de longitud.

Introducción

La válvula pulmonar (PV) sirve para asegurar el flujo sanguíneo unidireccional entre el ventrículo derecho y la arteria pulmonar. Las malformaciones de la válvula pulmonar se asocian con varias formas de cardiopatía congénita. El tratamiento actual para la enfermedad congénita de la válvula cardíaca (HVD) es la reparación valvular o el reemplazo de la válvula, que puede requerir múltiples cirugías invasivas a lo largo de la vida de un paciente¹. Se ha aceptado ampliamente que la función de la válvula cardíaca se deriva de su estructura, a menudo conocida como el correlato estructura-función. Más específicamente, las propiedades geométricas y biomecánicas del corazón dictan su función. Las propiedades mecánicas, a su vez, están determinadas por la composición y organización del ECM. Mediante el desarrollo de un método para determinar las propiedades biomecánicas de las válvulas cardíacas murinas, se pueden utilizar modelos animales transgénicos para interrogar el papel de la ECM en la función y disfunción de las válvulas cardíacas^2,3,4,5.

El modelo animal murino ha sido considerado durante mucho tiempo como el estándar para los estudios moleculares porque los modelos transgénicos están más fácilmente disponibles en ratones en comparación con otras especies. Los modelos transgénicos murinos proporcionan una plataforma versátil para la investigación de enfermedades relacionadas con las válvulas cardíacas⁶. Sin embargo, la experiencia quirúrgica y los requisitos de instrumentación para caracterizar tanto la geometría como la organización de ECM han sido un obstáculo importante en el progreso de la investigación de HVD. Los datos hstológicos en la literatura proporcionan una imagen del contenido de la matriz extracelular de la válvula cardíaca murina, pero solo en forma de imágenes 2D, y no pueden describir su arquitectura 3D^7,8. Además, la válvula cardíaca es heterogénea tanto espacial como temporalmente, lo que dificulta sacar conclusiones a través de los experimentos con respecto a la organización de la ECM si el muestreo y la conformación no son fijos. Los métodos convencionales de caracterización 3D, como la resonancia magnética o la ecocardiografía 3D, no proporcionan la resolución necesaria para resolver los componentes de ecm^9,10.

Este trabajo detalla un flujo de trabajo totalmente correlativo donde se abordó la heterogeneidad temporal debida al ciclo cardíaco fijando la conformación de la PV murina con presión transvalvular hidrostática. La heterogeneidad espacial se controló con precisión mediante el muestreo de regiones de interés y el registro de conjuntos de datos de diferentes modalidades de imagen, específicamente μCT y microscopía electrónica de barrido de cara de bloque serie, a través de diferentes escalas de longitud. Este método de exploración con μCT para guiar el muestreo aguas abajo se ha propuesto anteriormente, pero debido a que la válvula pulmonar exhibe variación temporal, se necesitaba un nivel adicional de control en el nivel quirúrgico^11.

Los estudios in vivo que describen la biomecánica de la válvula cardíaca murina son escasos y, en cambio, se basan en modelos computacionales al describir el comportamiento de deformación. Es de vital importancia que los datos extracelulares locales en la escala de longitud nanométrica estén relacionados con la geometría y la ubicación de la válvula cardíaca. Esto, a su vez, proporciona distribuciones cuantificables y mapeadas espacialmente de proteínas ECM que contribuyen mecánicamente, que se pueden utilizar para reforzar los modelos biomecánicos existentes de válvulas cardíacas^12,13,14.

Protocolo

El uso de animales en este estudio fue de acuerdo con el comité institucional de cuidado y uso de animales del Nationwide Children's Hospital bajo el protocolo AR13-00030.

1. Escisión de la válvula pulmonar

1. Autoclave las herramientas necesarias para la disección del ratón. Esto incluye tijeras finas, micro pinzas, pinzas micro vasculares, pinzas de aplicación de pinzas, soportes para microagujas, tijeras de resorte y retractores.
2. Aclimata a todos los ratones durante un mínimo de 2 semanas antes de la operación. Retire los ratones C57BL / 6, aproximadamente de 1 año de edad, de sus jaulas y pese, luego eutanasia con una sobredosis de cóctel de ketamina / xilazina (3: 1 ketamina: xilazina, 0.01 ml por g).
3. Coloque el ratón en una posición de recosta dorsal en una bandeja y asegure sus extremidades con cinta adhesiva. Una vez asegurado, realizar la toracotomía.
   1. Exponga el corazón eliminando cualquier exceso de tejido adiposo y fascia.
   2. Retire la aurícula derecha y perfunda a través del ventrículo izquierdo con solución salina a temperatura ambiente (NaCl al 0,9%). La perfusión debe tomar aproximadamente 20 ml durante 30 s. Esto resulta en la exsanguinación del ratón.
4. Extirpar todo el corazón mediante la extirpación de la vena cava superior, la vena cava inferior, la arteria pulmonar y la aorta. Se debe tener especial cuidado con la arteria pulmonar. Corte aproximadamente 2 mm por encima de la unión ventriculo-arterial, ya que esto servirá como conducto para la presurización.
5. Retire los ventrículos izquierdo y derecho para exponer las cámaras a la presión atmosférica. Asegúrese de que la estructura del tronco pulmonar no se vea afectada por la extirpación de los ventrículos.

2. Fijación de la presión de la válvula pulmonar

1. Tubo de presurización anastomosa con arteria pulmonar, dejando aproximadamente 1 mm de distancia entre la unión sino-tubular y el extremo del tubo para acomodar grandes movimientos de las valvas y el tronco pulmonar.
2. Eleve el depósito a una presión fisiológica análoga y llénelo con la solución salina. Pruebe el sistema de flujo a través para asegurarse de que no haya obstrucciones o burbujas de aire.
3. Conecte una llave de paso a la válvula pulmonar anastomosada y asegure un flujo adecuado a través del tubo (es decir, sin burbujas de aire) cambiando el tracto de salida. Una vez que el flujo sea adecuado, cambie el flujo de salida a la válvula pulmonar anastomosada y asegure la presurización del tronco pulmonar. Esto se identifica por la distensión del tronco pulmonar.
4. Una vez confirmada la presurización del tronco pulmonar, incorporar gradualmente solución fijadora primaria (glutaraldehído al 1,25%, paraformaldehído al 1,0% en cacodilato de 0,15 M) hasta purgar la solución salina. Esto se hace eliminando una porción, aproximadamente el 25% de la capacidad del reservorio, de la solución salina y reemplazándola con el fijador primario.
   PRECAUCIÓN: Los fijadores utilizados (paraformaldehído y glutaraldehído) son altamente tóxicos y se debe usar el equipo de protección personal (EPP) adecuado para garantizar la seguridad.
5. Coloque una gasa empapada en fijador sobre la muestra de tejido para evitar que se seque.
6. Perfundir el fijador durante 3 h, rellenando el depósito según sea necesario para mantener una presión constante. A lo largo de la fijación, no es raro que la válvula pulmonar se encoja debido a la fijación química. Si este es el caso, reponga constantemente el reservorio con fijador primario para mantener la presión fisiológica.
7. Guarde la válvula cardíaca en la solución fijadora a 4 °C hasta su uso. Las muestras se almacenaron hasta 1 semana sin ninguna diferencia discernible.

3. Tinción e incrustación de muestras en bloque^15,16

PRECAUCIÓN: Los reactivos de tinción utilizados en esta sección (ferrocianuro de potasio, tetróxido de osmio, tiocarbohidrazida, aspartato de plomo y acetato de uranilo) son altamente tóxicos y deben manipularse con extremo cuidado. Se recomienda el uso de una campana extractora de humos y un EPP adecuado.

1. Tinción
   1. Lave la muestra fija de la válvula cardíaca durante 5 min con tampón de cacodilato frío de 0,15 M. Repita el lavado dos veces más.
   2. Sumergir completamente la válvula cardíaca en una solución de ferrocianuro de potasio al 1,5%, cacodilato de 0,15 M, cloruro de calcio de 2 mM y tetróxido de osmio al 2%, sobre hielo durante 1 h.
   3. Mientras la muestra se está incubando, prepare la solución de tiocarbohidrazida (TCH) disolviendo 0,1 g de TCH en 10 ml de ddH₂O. Coloque la solución en un horno de 60 °C durante 1 h. Agitar suavemente periódicamente para asegurarse de que la TCH se disuelva por completo. Filtre la solución a través de un filtro de jeringa de 0,22 μm inmediatamente antes de su uso.
   4. Lavar las muestras con ddH₂O a temperatura ambiente colocándolas en un tubo de ddH₂O durante 5 min y agitarlas ligeramente agitando el recipiente. Repita este proceso tres veces.
   5. Colóquelo en una solución de TCH filtrada durante 20 minutos a temperatura ambiente. Realice el paso de lavado tres veces (5 min cada una) con ddH₂O a temperatura ambiente como se describe en el paso 3.1.4.
   6. Una vez hecho esto, coloque la muestra en tetróxido de osmio al 2% durante 30 min a temperatura ambiente. Luego lávelo nuevamente por un total de tres veces durante 5 minutos cada una con ddH 2 O a temperatura_ambiente.
   7. Incubar la muestra en acetato de uranilo al 1% durante la noche a 4 °C.
   8. Durante este tiempo, haga una solución de 0.066 g de nitrato de plomo en 10 ml de solución de caldo de ácido aspártico. Ajuste el pH a 5.5 con 1 N KOH. Coloque la solución en un horno a 60 °C para disolver el nitrato de plomo.
   9. Después de la incubación durante la noche, realice la etapa de lavado como se describe en el paso 3.1.4. Repetir tres veces. Luego, incube el tejido de la válvula cardíaca en solución de aspartato de plomo a partir del paso 3.1.8 en un horno de 60 °C durante 30 min.
2. Deshidratación
   1. Lave los pañuelos durante 5 min a temperatura ambiente con ddH₂O. Repita tres veces.
   2. Haga soluciones frescas de 20%, 50%, 70%, 90% y 100% etanol en ddH₂O. Mantenga en hielo hasta su uso.
   3. Para deshidratar el tejido de la válvula cardíaca. Realice tratamientos posteriores de 20%, 50%, 70% y 90% de etanol en hielo durante 5 minutos cada uno. A continuación, realice dos tratamientos posteriores de etanol 100% en hielo durante 5 min.
   4. Mueva el tejido a acetona helada durante 10 minutos. Luego coloque en acetona fresca a temperatura ambiente durante 10 min.
3. Incrustación
   1. Haga la mezcla de resina (consulte la Tabla de materiales) deacuerdo con las especificaciones del fabricante: 11.4 g del componente A, 10 g del componente B, 0.3 g del componente C y 0.05-0.1 g del componente D. Inicialmente mezcle los componentes A y B calentando cada uno de los componentes a 60 °C antes de agregar los componentes C y D. La mezcla se convertirá en un color ámbar al agregar los componentes C y D. Será uniforme cuando se mezcle adecuadamente.
   2. Haga mezclas con proporciones de volumen de 25:75, 50:50 y 75:25 resina:acetona. Homogeneizar.
   3. Coloque los tejidos en tratamientos posteriores de la mezcla de resina:acetona 25:75, 50:50 y 75:25 durante 2 h cada uno a temperatura ambiente.
   4. Coloque los tejidos en resina 100% durante la noche a temperatura ambiente.
   5. Al día siguiente, coloque los pañuelos en resina fresca 100% durante 2 h a temperatura ambiente.
   6. Transfiera los tejidos de la válvula cardíaca a una cápsula de incrustación, sustituya con resina fresca al 100% y colóquelos en un horno a 60 °C durante 48 horas para curar.
4. Realice imágenes correlativas como se muestra a continuación.

4. Imágenes de tomografía micro-computarizada

1. Monte el bloque de muestra de resina en un soporte de muestra μCT con un adhesivo (pegamento o cinta de doble cara funciona bien).
2. Coloque el soporte en la cámara μCT y colóquelo en el escenario atornillando el collet de tal manera que no haya movimiento del soporte. El movimiento de la muestra durante el escaneo disminuirá la calidad de la imagen.
3. Abra la interfaz de usuario de μCT haciendo doble clic en el icono. Agregue un proyecto seleccionando el signo + junto a Proyectos y complete los campos necesarios.
4. Una vez creado esto, busque el proyecto creado y selecciónelo haciendo clic en él. Esto abrirá una segunda columna Adquisiciones. Seleccione el + junto a Adquisiciones y rellene los campos necesarios.
5. Cierre las puertas de la cámara y arme el sistema presionando el botón de armado en el panel frontal o el μCT. Warmup radiografías desde la interfaz de usuario seleccionando el botón que indica Warmup.
   NOTA: El sistema apagará automáticamente las radiografías después de un procedimiento de calentamiento exitoso. Active las radiografías seleccionando el botón.
6. Ajuste la rotación de la etapa de modo que el centro de la rotación de la muestra no se desvíe del centro del monitor (es decir, la muestra esté dentro del campo de visión durante todo el escaneo). Para el sistema utilizado para este experimento, esto implica ajustar la etapa de región de interés (ROI) en la pestaña desplegable como se detalla a continuación.
   1. Ajuste el ajuste de la etapa ROI estableciendo el ángulo de rotación en 0° y marcando el borde de la muestra. A continuación, la muestra se gira a 180 ° y el borde de la muestra se marca de nuevo.
   2. Ajuste la posición del eje x de la etapa de ROI de tal manera que el borde de la muestra esté entre estos dos extremos. Repita este proceso para ángulos de rotación de 90° y 270° para la posición y.
   3. En el caso de que la rotación de la muestra haga que los bordes se muevan fuera del campo de visión, disminuya la ampliación de las necesidades de μCT hasta que los bordes de la muestra sean visibles en los ángulos establecidos anteriormente y se pueda realizar un ajuste de etapa de ROI grueso.
   4. Una vez ajustado en el aumento más bajo, mueva la muestra o el detector para aumentar el aumento y las posiciones de ROI se pueden ajustar bien.
      NOTA: Es posible que sea necesario repetir este proceso para garantizar la alineación. La alineación adecuada da como resultado una muestra que muestra poco o ningún movimiento horizontal a través de todos los ángulos de rotación de la muestra.
7. Ajuste el μCT a los parámetros de escaneo deseados utilizando el software del fabricante. Estos parámetros incluyen el potencial del tubo, la corriente del tubo, la distancia del detector, la distancia de la muestra, el tiempo de exposición, la trayectoria y el número de proyecciones (consulte la Tabla S1 para los parámetros de adquisición de μCT utilizados en este estudio).
   NOTA: Los parámetros de calibración, como los escaneos de campo claro y campo oscuro, deben mantenerse según las especificaciones del fabricante, a menos que se indique lo contrario. Por ejemplo, si una muestra es demasiado grande y el sistema no puede mover la muestra fuera de la vista de campo, entonces la muestra debe eliminarse para realizar escaneos de calibración de campo claros.
8. Una vez que se establecen los parámetros, se puede ver una aproximación de la duración del escaneo presionando el botón Estimación de tiempo. Seleccione el botón Inicio para comenzar el escaneo.
9. Después de completar la exploración, asegúrese de que las radiografías estén apagadas, desenrosque el collet y retire cuidadosamente la muestra de la cámara μCT.

5. Procesamiento de muestras y correlación de imágenes

1. Reconstruir proyecciones μCT utilizando un algoritmo de retroproyección filtrada con el software proporcionado por el fabricante (ver Tabla de Materiales).
   1. Seleccione la pestaña Recon en la parte superior de la pantalla. Seleccione la pestaña Proyecto y adquisición.
   2. Seleccione la plantilla de reconocimiento asociada con la proyección posterior filtrada. Presione el botón Iniciar reconocimiento.
2. Identificar y segmentar la válvula pulmonar mediante un software de procesamiento de imágenes. Esto requiere un conocimiento previo de la anatomía de la válvula pulmonar¹⁷. A presiones arteriales elevadas, las valvas coaptan y bloquean la luz de la válvula pulmonar.
3. Identifique la orientación de corte con respecto a la dirección de escaneo y la muestra. Reoriente la muestra de tal manera que la dirección de corte esté alineada con el eje deseado.
4. Identifique las regiones de interés para imágenes de alta resolución. En este experimento, se eligió el vientre (medio) de la valva y la unión arterio-valvular.
5. Retire el exceso de resina y la muestra mediante cuchilla de afeitar o lijado para piezas grandes de material, o mediante microtomo para piezas más finas.
6. Una vez en un lugar de interés, compare la muestra física con cortes virtuales de μCT para confirmar la ubicación. Esto se hizo comparando las características anatómicas en la sección transversal.

6. Microscopía electrónica de barrido de cara de bloque serie¹⁸

1. Reduzca la sección transversal de la muestra para acomodar SBF-SEM, aproximadamente 2.0 x 1.5 x 1.8 mm.
2. Monte la muestra recortada en el talón de aluminio SBF-SEM con epoxi.
3. Cubra el bloque de muestra con oro de 35 nm. Gire la muestra en la plataforma para aplicar una capa uniforme de recubrimiento.
4. Ventile la cámara SBF-SEM y ajuste la altura de la hoja del cuchillo a la altura eucéntrica del microscopio.
5. Inserte la muestra y nivele el talón de muestra.
6. Imagen en condiciones de bajo vacío para evitar la carga y con detector de retrodescación (consulte la Tabla S2 para los parámetros de adquisición de SBF-SEM).
7. Imagen y puntada de múltiples regiones de interés a diferentes aumentos utilizando software automatizado (ver Tabla de Materiales).

Resultados

La anastomosis de la arteria pulmonar al tubo de presurización se muestra en la Figura 1A. Después de la aplicación de presión hidrostática, el tronco pulmonar se distiende radialmente (Figura 1B) lo que indica que las valvas de la válvula pulmonar están en una configuración cerrada. La conformación de la válvula pulmonar se confirmó mediante μCT. En este caso, las valvas fueron coaptas (cerradas) y el anillo fue circular(Figura ...

Discusión

La extirpación de los ventrículos sirve para dos propósitos. Primero, exponer el lado del ventrículo a la presión atmosférica, por lo que solo necesita aplicar una presión transvalvular desde el lado arterial de la válvula pulmonar para cerrar, y segundo, proporcionar una base estable para evitar la torsión del tronco pulmonar. Durante la presurización, el tronco pulmonar se distiende radial e inferiormente, haciéndolo propenso a torcerse, causando el colapso del tronco pulmonar. La precarga de la válvula pul...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
25% glutaraldehyde (aq)	EMS	16210	Primary fixative component
0.9% sodium chloride injection	Hospira Inc.	NDC 0409-4888-10
1 mL syringe	BD	309659
10 mL syringe	BD	309604
200 proof ethanol	EMS	15055
22G needle	BD	305156
3 mL syringe	BD	309657
3-way stopcock	Smiths Medical ASD, Inc.	MX5311L
4% osmium tetroxide	EMS	19150	Staining component
4% paraformaldehyde (aq)	EMS	157-4-100	Primary fixative component
Absorbable hemostat	Ethicon	1961
Acetone	EMS	10012
Black polyamide monofilament suture, 10-0	AROSurgical instruments Corporation	TI38402
Black polyamide monofilament suture, 6-0	AROSurgical instruments Corporation	SN-1956
C57BL/6 mice	Jackson Laboratories	664	Approximately 1 yo
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	10043-52-4
Clamp applying forcep	FST	00072-14
Cotton tip applicators	Fisher Scientific	23-400-118
DPBS	Gibco	14190-144
Dumont #5 forcep	FST	11251-20
Dumont #5/45 forceps	FST	11251-35
Dumont #7 fine forcep	FST	11274-20
Durcupan ACM resin	EMS	14040	For embedding
Fine scissor	FST	14028-10
Heliscan microCT	Thermo Fisher Scientific		Micro-CT
Ketamine hydrochloride injection	Hospira Inc.	NDC 0409-2053
L-aspartic acid	Sigma-Aldrich	56-84-8	Staining component
Lead nitrate	EMS	17900	Staining component
low-vacuum backscatter detector	Thermo Fisher Scientific	VSDBS	SEM backscatter detector
Micro-adson forcep	FST	11018-12
Millex-GP filter, 0.22 um, PES 33mm, non-sterile	EMD Millipore	SLGP033NS
Non-woven songes	McKesson Corp.	94442000
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate	Sigma-Aldrich	14459-95-1	Staining component
Potassium hydroxide	Sigma-Aldrich	1310-58-3
Pressure monitor line	Smiths Medical ASD, Inc.	MX562
Saline solution (sterile 0.9% sodium chloride)	Hospira Inc.	NDC 0409-0138-22
Size 3 BEEM capsule	EMS	69910-01	Embedding container
Sodium cacodylate trihydrate	Sigma-Aldrich	6131-99-3	Buffer
Solibri retractors	FST	17000-04
Sputter, carbon and e-beam coater	Leica	EM ACE600	Gold coater
Surgical microscope	Leica	M80
Thiocarbohydrazide (TCH)	EMS	21900	Staining component
Tish needle holder/forcep	Micrins	MI1540
Trimmer	Wahl	9854-500
Uranyl acetate	EMS	22400	Staining component
Volumescope scanning electron microscope	Thermo Fisher Scientific	VOLUMESCOPESEM	Serial Block Face Scanning Electron Microscope
Xylazine sterile solution	Akorn Inc.	NADA# 139-236