Cirugía y procesamiento de muestras para imágenes correlativas de la válvula pulmonar murina

Resumen

Aquí, describimos un flujo de trabajo correlativo para la escisión, presurización, fijación e imágenes de la válvula pulmonar murina para determinar la conformación macróstica y las estructuras locales de la matriz extracelular.

Resumen

Las causas subyacentes de la enfermedad relacionada con las válvulas cardíacas (HVD) son esquivas. Los modelos animales murinos proporcionan una excelente herramienta para estudiar la HVD, sin embargo, la experiencia quirúrgica e instrumental requerida para cuantificar con precisión la estructura y la organización en múltiples escalas de longitud han atrofiado su avance. Este trabajo proporciona una descripción detallada de la disección murina, la tinción en bloque, el procesamiento de muestras y los procedimientos de imágenes correlativas para representar la válvula cardíaca en diferentes escalas de longitud. Se utilizó presión transvalvular hidrostática para controlar la heterogeneidad temporal mediante la fijación química de la conformación de la válvula cardíaca. Se utilizó la tomografía micro computarizada (μCT) para confirmar la geometría de la válvula cardíaca y proporcionar una referencia para el procesamiento de muestras aguas abajo necesario para la microscopía electrónica de barrido facial en bloque serie (SBF-SEM). Se tomaron y reconstruyeron imágenes SEM en serie de alta resolución de la matriz extracelular (ECM) para proporcionar una representación 3D local de su organización. Los métodos de imagen μCT y SBF-SEM se correlacionaron para superar la variación espacial a través de la válvula pulmonar. Aunque el trabajo presentado es exclusivamente sobre la válvula pulmonar, esta metodología podría adoptarse para describir la organización jerárquica en sistemas biológicos y es fundamental para la caracterización estructural a través de múltiples escalas de longitud.

Introducción

La válvula pulmonar (PV) sirve para asegurar el flujo sanguíneo unidireccional entre el ventrículo derecho y la arteria pulmonar. Las malformaciones de la válvula pulmonar se asocian con varias formas de cardiopatía congénita. El tratamiento actual para la enfermedad congénita de la válvula cardíaca (HVD) es la reparación valvular o el reemplazo de la válvula, que puede requerir múltiples cirugías invasivas a lo largo de la vida de un paciente¹. Se ha aceptado ampliamente que la función de la válvula cardíaca se deriva de su estructura, a menudo conocida como el correlato estructura-función. Más específicamente, las propiedades geométricas y bi....

Protocolo

El uso de animales en este estudio fue de acuerdo con el comité institucional de cuidado y uso de animales del Nationwide Children's Hospital bajo el protocolo AR13-00030.

1. Escisión de la válvula pulmonar

1. Autoclave las herramientas necesarias para la disección del ratón. Esto incluye tijeras finas, micro pinzas, pinzas micro vasculares, pinzas de aplicación de pinzas, soportes para microagujas, tijeras de resorte y retractores.
2. Aclimata a todos los ratones durante un mínimo de 2 semanas antes de la operación. Retire los ratones C57BL / 6, aproximadamente de 1 año de edad, de sus jaulas y pese, luego eutanasia con una s....

Resultados

La anastomosis de la arteria pulmonar al tubo de presurización se muestra en la Figura 1A. Después de la aplicación de presión hidrostática, el tronco pulmonar se distiende radialmente (Figura 1B) lo que indica que las valvas de la válvula pulmonar están en una configuración cerrada. La conformación de la válvula pulmonar se confirmó mediante μCT. En este caso, las valvas fueron coaptas (cerradas) y el anillo fue circular(Figura .......

Discusión

La extirpación de los ventrículos sirve para dos propósitos. Primero, exponer el lado del ventrículo a la presión atmosférica, por lo que solo necesita aplicar una presión transvalvular desde el lado arterial de la válvula pulmonar para cerrar, y segundo, proporcionar una base estable para evitar la torsión del tronco pulmonar. Durante la presurización, el tronco pulmonar se distiende radial e inferiormente, haciéndolo propenso a torcerse, causando el colapso del tronco pulmonar. La precarga de la válvula pul.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
25% glutaraldehyde (aq)	EMS	16210	Primary fixative component
0.9% sodium chloride injection	Hospira Inc.	NDC 0409-4888-10
1 mL syringe	BD	309659
10 mL syringe	BD	309604
200 proof ethanol	EMS	15055
22G needle	BD	305156
3 mL syringe	BD	309657
3-way stopcock	Smiths Medical ASD, Inc.	MX5311L
4% osmium tetroxide	EMS	19150	Staining component
4% paraformaldehyde (aq)	EMS	157-4-100	Primary fixative component
Absorbable hemostat	Ethicon	1961
Acetone	EMS	10012
Black polyamide monofilament suture, 10-0	AROSurgical instruments Corporation	TI38402
Black polyamide monofilament suture, 6-0	AROSurgical instruments Corporation	SN-1956
C57BL/6 mice	Jackson Laboratories	664	Approximately 1 yo
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	10043-52-4
Clamp applying forcep	FST	00072-14
Cotton tip applicators	Fisher Scientific	23-400-118
DPBS	Gibco	14190-144
Dumont #5 forcep	FST	11251-20
Dumont #5/45 forceps	FST	11251-35
Dumont #7 fine forcep	FST	11274-20
Durcupan ACM resin	EMS	14040	For embedding
Fine scissor	FST	14028-10
Heliscan microCT	Thermo Fisher Scientific		Micro-CT
Ketamine hydrochloride injection	Hospira Inc.	NDC 0409-2053
L-aspartic acid	Sigma-Aldrich	56-84-8	Staining component
Lead nitrate	EMS	17900	Staining component
low-vacuum backscatter detector	Thermo Fisher Scientific	VSDBS	SEM backscatter detector
Micro-adson forcep	FST	11018-12
Millex-GP filter, 0.22 um, PES 33mm, non-sterile	EMD Millipore	SLGP033NS
Non-woven songes	McKesson Corp.	94442000
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate	Sigma-Aldrich	14459-95-1	Staining component
Potassium hydroxide	Sigma-Aldrich	1310-58-3
Pressure monitor line	Smiths Medical ASD, Inc.	MX562
Saline solution (sterile 0.9% sodium chloride)	Hospira Inc.	NDC 0409-0138-22
Size 3 BEEM capsule	EMS	69910-01	Embedding container
Sodium cacodylate trihydrate	Sigma-Aldrich	6131-99-3	Buffer
Solibri retractors	FST	17000-04
Sputter, carbon and e-beam coater	Leica	EM ACE600	Gold coater
Surgical microscope	Leica	M80
Thiocarbohydrazide (TCH)	EMS	21900	Staining component
Tish needle holder/forcep	Micrins	MI1540
Trimmer	Wahl	9854-500
Uranyl acetate	EMS	22400	Staining component
Volumescope scanning electron microscope	Thermo Fisher Scientific	VOLUMESCOPESEM	Serial Block Face Scanning Electron Microscope
Xylazine sterile solution	Akorn Inc.	NADA# 139-236