Cirurgia e Processamento de Amostras para Imagem Correlativa da Válvula Pulmonar Murina

Resumo

Aqui, descrevemos um fluxo de trabalho correlativo para a excisão, pressurização, fixação e imagem da válvula pulmonar murina para determinar a conformação bruta e as estruturas da matriz extracelular local.

Resumo

As causas subjacentes da doença relacionada à válvula cardíaca (HVD) são evasivas. Os modelos animais murinos fornecem uma excelente ferramenta para estudar HVD, no entanto, a perícia cirúrgica e instrumental necessária para quantificar com precisão a estrutura e a organização em múltiplas escalas de comprimento têm prejudicado seu avanço. Este trabalho fornece uma descrição detalhada da dissecção de murina, coloração em bloco, processamento de amostras e procedimentos de imagem correlativo para a representação da válvula cardíaca em diferentes escalas de comprimento. A pressão transvalvular hidrostática foi usada para controlar a heterogeneidade temporal fixando quimicamente a conformação da válvula cardíaca. A tomografia microcomputada (μCT) foi usada para confirmar a geometria da válvula cardíaca e fornecer uma referência para o processamento da amostra a jusante necessária para a microscopia eletrônica de varredura facial do bloco serial (SBF-SEM). Imagens sem em série de alta resolução da matriz extracelular (ECM) foram tiradas e reconstruídas para fornecer uma representação 3D local de sua organização. Os métodos de imagem μCT e SBF-SEM foram então correlacionados para superar a variação espacial através da válvula pulmonar. Embora o trabalho apresentado seja exclusivamente sobre a válvula pulmonar, essa metodologia poderia ser adotada para descrever a organização hierárquica em sistemas biológicos e é fundamental para a caracterização estrutural em múltiplas escalas de comprimento.

Introdução

A válvula pulmonar (PV) serve para garantir o fluxo sanguíneo unidirecional entre o ventrículo direito e a artéria pulmonar. Malformações da válvula pulmonar estão associadas a várias formas de doença cardíaca congênita. O tratamento atual para doença da válvula cardíaca congênita (HVD) é o reparo valvular ou substituição da válvula, que pode exigir múltiplas cirurgias invasivas ao longo da vida¹do paciente . Tem sido amplamente aceito que a função da válvula cardíaca é derivada de sua estrutura, muitas vezes referida como a correlação estrutura-função. Mais especificamente, as propriedades geométricas e biomecânicas do coração ditam sua função. As propriedades mecânicas, por sua vez, são determinadas pela composição e organização do ECM. Ao desenvolver um método para determinar as propriedades biomecânicas das válvulas cardíacas murinas, modelos animais transgênicos podem ser usados para interrogar o papel do ECM na função da válvula cardíaca e disfunção^2,3,4,5.

O modelo animal murino tem sido considerado como o padrão para estudos moleculares porque modelos transgênicos estão mais facilmente disponíveis em camundongos em comparação com outras espécies. Os modelos transgênicos de Murine fornecem uma plataforma versátil para pesquisar doenças relacionadas à válvula cardíaca⁶. No entanto, os requisitos de perícia cirúrgica e instrumentação para caracterizar tanto a geometria quanto a organização do ECM têm sido um grande obstáculo no progresso da pesquisa de HVD. Os dados hstológicos na literatura fornecem uma imagem no conteúdo de matriz extracelular da válvula cardíaca murina, mas apenas na forma de imagens 2D, e são incapazes de descrever sua arquitetura 3D^7,8. Além disso, a válvula cardíaca é espacial e temporalmente heterogênea, dificultando a tiração de conclusões entre experimentos relativos à organização do ECM se a amostragem e a conformação não forem corrigidas. Métodos convencionais de caracterização 3D, como ressonância magnética ou ecocardiografia 3D, não fornecem a resolução necessária para resolver os componentes ECM^9,10.

Este trabalho detalha um fluxo de trabalho totalmente correlativo onde a heterogeneidade temporal devido ao ciclo cardíaco foi abordada pela fixação da conformação do Pv murina com pressão transvalvular hidrostática. A heterogeneidade espacial foi controlada precisamente por regiões de amostragem de interesse e registro de conjuntos de dados de diferentes modalidades de imagem, especificamente μCT e microscopia eletrônica de varredura facial de blocos seriais, em diferentes escalas de comprimento. Este método de exploração com μCT para orientação da amostragem a jusante foi proposto anteriormente, mas como a válvula pulmonar apresenta variação temporal, foi necessário um nível adicional de controle no nível cirúrgico¹¹.

Estudos in vivo descrevendo a biomecânica da válvula cardíaca murina são esparsas e, em vez disso, dependem de modelos computacionais ao descrever o comportamento de deformação. É de fundamental importância que os dados extracelulares locais sobre a escala de comprimento do nanômetro estejam relacionados com a geometria e localização da válvula cardíaca. Isso, por sua vez, fornece distribuições quantificáveis e espacialmente mapeadas de proteínas ECM que contribuem mecanicamente, que podem ser utilizadas para reforçar os modelos de válvula cardíaca biomecânica existentes^12,13,14.

Protocolo

O uso de animais neste estudo foi de acordo com o Comitê institucional de Cuidados e Uso de Animais do Hospital Infantil Nacional sob o protocolo AR13-00030.

1. Excisão da válvula pulmonar

1. Autoclave as ferramentas necessárias para a dissecção do mouse. Isso inclui tesouras finas, micro fórceps, grampos micro vasculares, fórceps de fixação, suportes de microaclese, tesoura de mola e retratores.
2. Aclimatar todos os ratos por um mínimo de 2 semanas antes da operação. Remova os camundongos C57BL/6, aproximadamente 1 ano de idade, de suas gaiolas e pese, depois eutanize com um coquetel de cetamina/xilazina (3:1 cetamina:xylazine, 0,01 mL por g) overdose.
3. Coloque o mouse em uma posição de recumbência dorsal em uma bandeja e fixe seus membros com fita. Uma vez assegurado, faça a toracotomia.
   1. Exponha o coração removendo qualquer excesso de tecido adiposo e fáscia.
   2. Remova o átrio direito e peruse através do ventrículo esquerdo com solução salina de temperatura ambiente (0,9% NaCl). A perfusão deve levar aproximadamente 20 mL acima de 30 s. Isso resulta na exsanguinação do rato.
4. Remova todo o coração cortando a veia cava superior, veia cava inferior, artéria pulmonar e aorta. Deve-se tomar cuidado especial para a artéria pulmonar. Corte aproximadamente 2 mm acima da junção ventriculo-arterial, pois este servirá como o canal para pressurização.
5. Remova os ventrículos esquerdo e direito para expor câmaras à pressão atmosférica. Certifique-se de que a estrutura do tronco pulmonar não deve ser afetada pela remoção dos ventrículos.

2. Fixação de pressão da válvula pulmonar

1. Tubo de pressurização anastomose com artéria pulmonar, deixando aproximadamente 1 mm de distância entre a junção sino-tubular e a extremidade da tubulação para acomodar grandes movimentos dos folhetos e tronco pulmonar.
2. Eleve o reservatório a uma pressão fisiológica análoga e preencha-o com a solução salina. Teste o sistema de fluxo para garantir que não haja bloqueios ou bolhas de ar.
3. Conecte uma torneira à válvula pulmonar anastomosa e garanta o fluxo adequado através do tubo (ou seja, sem bolhas de ar) trocando o trato de saída. Uma vez que o fluxo seja adequado, mude a vazão para a válvula pulmonar anastomosa e garanta a pressurização do tronco pulmonar. Isso é identificado por distensão pulmonar do tronco.
4. Uma vez confirmada a pressurização do tronco pulmonar, incorpore gradualmente a solução fixativa primária (1,25% glutaraldeído, 1,0% paraformaldeído em 0,15 M de cacodilato) até que a solução salina seja purgada. Isso é feito removendo uma porção, aproximadamente 25% da capacidade do reservatório, da solução salina e substituindo-a pelo fixador primário.
   ATENÇÃO: Os fixativos utilizados (paraformaldeído e glutaraldeído) são altamente tóxicos e equipamentos de proteção individual (EPI) altamente tóxicos devem ser usados para garantir a segurança.
5. Coloque uma gaze fixada sobre a amostra de tecido para evitar a secagem.
6. Perfunda o fixador por 3h, reabastecendo o reservatório conforme necessário para manter uma pressão constante. Ao longo da fixação, não é incomum que a válvula pulmonar encolha por causa da fixação química. Se for esse o caso, reabastece constantemente o reservatório com fixação primária para manter a pressão fisiológica.
7. Armazene a válvula cardíaca na solução fixada a 4 °C até usar. As amostras foram armazenadas por até 1 semana sem qualquer diferença discernível.

3. Coloração e incorporação da amostra do bloco^{en 15,16}

ATENÇÃO: Os reagentes de coloração utilizados nesta seção (ferrocinídeo de potássio, tetroxida de ósmio, tiocarbohydrazida, aspartato de chumbo e acetato de urisola) são altamente tóxicos e devem ser tratados com extremo cuidado. É aconselhável o uso de um capô de fumaça e EPI adequado.

1. Mancha
   1. Lave a amostra fixa da válvula cardíaca por 5 minutos com tampão de cacodilato frio de 0,15 M. Repita a lavagem mais duas vezes.
   2. Submergir completamente a válvula cardíaca em uma solução de ferrocianida de potássio de 1,5%, 0,15 M de cacodilato, cloreto de cálcio de 2 mM e 2% de tetroxida de ósmio, no gelo por 1h.
   3. Enquanto a amostra estiver incubando, prepare a solução de tiocarbohydrazida (TCH) dissolvendo 0,1 g de TCH em 10 mL de ddH₂O. Coloque a solução em um forno de 60 °C por 1h. Agitar suavemente periodicamente para garantir que o TCH seja completamente dissolvido. Filtre a solução através de um filtro de seringa de 0,22 μm imediatamente antes de usar.
   4. Lave as amostras com ddH₂O de temperatura ambiente colocando-as em um tubo de ddH₂O por 5 min e agitar-a ligeiramente agitando o recipiente. Repita este processo três vezes.
   5. Coloque-o na solução TCH filtrada por 20 minutos à temperatura ambiente. Realize a etapa de lavagem três vezes (5 min cada) com ddH₂O de temperatura ambiente, conforme descrito na etapa 3.1.4.
   6. Uma vez feito, coloque a amostra em 2% de tetroxida de ósmio por 30 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, lave-o novamente por um total de três vezes por 5 min cada com temperatura ambiente ddH₂O.
   7. Incubar a amostra em acetato de 1% de urano durante a noite a 4 °C.
   8. Durante este período, faça uma solução de 0,066 g de nitrato de chumbo em 10 mL de solução de estoque de ácido aspartc. Ajuste o pH para 5,5 com 1 N KOH. Coloque a solução em um forno de 60 °C para dissolver o nitrato de chumbo.
   9. Após a incubação durante a noite, realize a etapa de lavagem conforme descrito na etapa 3.1.4. Repita três vezes. Em seguida, incubar o tecido da válvula cardíaca na solução de aspartato de chumbo a partir da etapa 3.1.8 em um forno de 60 °C por 30 min.
2. Desidratação
   1. Lave os tecidos por 5 minutos à temperatura ambiente com ddH₂O. Repita três vezes.
   2. Fazer novas soluções de 20%, 50%, 70%, 90% e 100% de etanol no DDH₂O. Mantenha no gelo até o uso.
   3. Para desidratar o tecido da válvula cardíaca. Realizar tratamentos subsequentes de 20%, 50%, 70% e 90% de etanol no gelo por 5 min cada. Em seguida, realize dois tratamentos subsequentes de 100% de etanol no gelo por 5 min.
   4. Mova o tecido para acetona gelada por 10 minutos. Em seguida, coloque em acetona fresca à temperatura ambiente por 10 minutos.
3. Incorporação
   1. Faça a mistura de resina (ver Tabela de Materiais) de acordo com as especificações do fabricante: 11,4 g do componente A, 10 g do componente B, 0,3 g do componente C e 0,05-0,1 g do componente D. Inicialmente misture os componentes A e B aquecendo cada um dos componentes a 60 °C antes de adicionar os componentes C e D. A mistura se transformará em uma cor âmbar ao adicionar os componentes C e D. Será uniforme quando bem misturado.
   2. Faça misturas com proporções de volume de 25:75, 50:50 e 75:25 resina:acetona. Homogeneizar.
   3. Coloque tecidos em tratamentos subsequentes das 25:75, 50:50 e 75:25 mistura de resina:acetona por 2h cada a temperatura ambiente.
   4. Coloque tecidos em 100% de resina durante a noite à temperatura ambiente.
   5. No dia seguinte, coloque tecidos em resina fresca de 100% por 2h à temperatura ambiente.
   6. Transfira os tecidos da válvula cardíaca para uma cápsula de incorporação, substitua com resina fresca de 100% e coloque em forno de 60 °C por 48 h para curar.
4. Realize imagens correlativas conforme mostrado abaixo.

4. Imagem de tomografia microcomputada

1. Monte o bloco de amostra de resina em um suporte de amostra μCT com um adesivo (cola ou fita dupla face funciona bem).
2. Coloque o suporte na câmara μCT e fixe-o no palco, aparafusando a collet de tal forma que não haja movimento do suporte. O movimento da amostra durante a varredura diminuirá a qualidade da imagem.
3. Abra a interface do usuário μCT clicando duas vezes no ícone. Adicione um projeto selecionando o sinal + ao lado de Projetos e preencha os campos necessários.
4. Uma vez criado, encontre o projeto criado e selecione-o clicando nele. Isso abrirá uma segunda coluna Aquisições. Selecione o + ao lado de Aquisições e preencha os campos necessários.
5. Feche as portas da câmara e arma o sistema apertando o botão de armamento no painel frontal ou no μCT. Aqueça os raios-x da interface do usuário selecionando o botão indicando aquecimento.
   NOTA: O sistema desligará automaticamente os raios-X após um procedimento de aquecimento bem sucedido. Ligue os raios-X selecionando o botão.
6. Ajuste a rotação do estágio de modo que o centro da rotação da amostra não se desvie do centro do monitor (ou seja, a amostra está dentro do campo de visão para toda a varredura). Para o sistema utilizado para este experimento, isso envolve ajustar o estágio de região de interesse (ROI) sob a guia de gotação conforme detalhado abaixo.
   1. Ajuste o ajuste do estágio do ROI definindo o ângulo de rotação para 0° e marcando a borda da amostra. A amostra é então girada para 180° e a borda da amostra é marcada novamente.
   2. Ajuste a posição do estágio DO ROI x-eixo de modo que a borda da amostra esteja entre esses dois extremos. Repita este processo para ângulos de rotação de 90° e 270° para a posição y.
   3. No caso de a rotação da amostra fazer com que as bordas se movam para fora do campo de visão, diminua a ampliação das necessidades de μCT até que as bordas da amostra sejam visíveis nos ângulos definidos acima e um ajuste grosseiro do estágio do ROI possa ser feito.
   4. Uma vez ajustado na ampliação inferior, mova a amostra ou o detector para aumentar a ampliação e as posições do ROI podem ser ajustadas bem.
      NOTA: Este processo pode precisar ser repetido para garantir o alinhamento. O alinhamento adequado resulta em uma amostra que mostra pouco ou nenhum movimento horizontal através de todos os ângulos de rotação da amostra.
7. Ajuste o μCT aos parâmetros de varredura desejados usando o software do fabricante. Esses parâmetros incluem potencial do tubo, corrente do tubo, distância do detector, distância amostral, tempo de exposição, trajetória e número de projeções (ver Tabela S1 para os parâmetros de aquisição de μCT utilizados neste estudo).
   NOTA: Os parâmetros de calibração, como varreduras de campo claro e de campo escuro, devem ser mantidos nas especificações do fabricante, a menos que seja indicado de outra forma. Por exemplo, se uma amostra é muito grande e o sistema não pode mover a amostra para fora da visão de campo, então a amostra precisa ser removida para realizar varreduras claras de calibração de campo.
8. Uma vez definidos os parâmetros, uma aproximação da duração da varredura pode ser vista apertando o botão Estimativa de Tempo. Selecione o botão Iniciar para iniciar a varredura.
9. Após a conclusão da varredura, certifique-se de que os raios-X estão desligados, desaparafusar a collet e remover cuidadosamente a amostra da câmara μCT.

5. Processamento de amostras e correlação de imagem

1. Reconstrua projeções μCT usando um algoritmo de projeção de volta filtrado com o software fornecido pelo fabricante (ver Tabela de Materiais).
   1. Selecione a guia Recon na parte superior da tela. Selecione a guia Projeto e Aquisição.
   2. Selecione o modelo de reconhecimento associado à projeção de volta filtrada. Aperte o botão Iniciar reconhecimento.
2. Identifique e segmente a válvula pulmonar usando o software de processamento de imagens. Isso requer conhecimento prévio da anatomia da válvula pulmonar¹⁷. Em pressões arteriais elevadas, os folhetos coapt e bloqueiam o lúmen da válvula pulmonar.
3. Identifique a orientação de corte em relação à direção de digitalização e amostra. Reoriente a amostra de modo que a direção de corte esteja alinhada com o eixo desejado.
4. Identifique regiões de interesse para imagens de alta resolução. Neste experimento, foi escolhida a barriga (meio) do folheto e a junção arterio-valvular.
5. Remova o excesso de resina e amostra por lâmina de barbear ou lixamento para grandes pedaços de material, ou por microtoma para peças mais finas.
6. Uma vez em um local de interesse, compare a amostra física com fatias virtuais de μCT para confirmar a localização. Isso foi feito comparando características anatômicas na seção transversal.

6. Microscopia eletrônica de varredura facial de bloco serial¹⁸

1. Reduza a seção transversal da amostra para acomodar o SBF-SEM, aproximadamente 2,0 x 1,5 x 1,8 mm.
2. Monte a amostra aparada no stub de alumínio SBF-SEM usando epóxi.
3. Cubra o bloco de espécimes com 35 nm de ouro. Gire a amostra na plataforma para aplicar uma camada uniforme de revestimento.
4. Desfocar a câmara SBF-SEM e ajustar a altura da lâmina da faca à altura eucêntrica do microscópio.
5. Insira a amostra e nivele o stub amostral.
6. Imagem em condições de vácuo baixo para evitar o carregamento e com detector de contra-teto (consulte tabela S2 para parâmetros de aquisição SBF-SEM).
7. Imagem e costuram várias regiões de interesse em diferentes ampliações usando software automatizado (ver Tabela de Materiais).

Resultados

A anastomose da artéria pulmonar à tubulação de pressurização é mostrada na Figura 1A. Após a aplicação da pressão hidrostática, o tronco pulmonar distends radialmente(Figura 1B) indicando que os folhetos da válvula pulmonar estão em uma configuração fechada. A conformação da válvula pulmonar foi confirmada por μCT. Neste caso, os folhetos foram coapt (fechado) e o anulo foi circular(Figura 2A).

Discussão

A remoção dos ventrículos serve a dois propósitos. Primeiro, expondo o lado ventrículo à pressão atmosférica, precisando, assim, apenas aplicar uma pressão transvalvular do lado arterial da válvula pulmonar para fechar, e segundo, fornecendo uma base estável para evitar a torção do tronco pulmonar. Durante a pressurização, o tronco pulmonar distendida radialmente e inferiormente, tornando-o propenso a torção, causando o colapso do tronco pulmonar. A pré-carga da válvula pulmonar com uma solução salin...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
25% glutaraldehyde (aq)	EMS	16210	Primary fixative component
0.9% sodium chloride injection	Hospira Inc.	NDC 0409-4888-10
1 mL syringe	BD	309659
10 mL syringe	BD	309604
200 proof ethanol	EMS	15055
22G needle	BD	305156
3 mL syringe	BD	309657
3-way stopcock	Smiths Medical ASD, Inc.	MX5311L
4% osmium tetroxide	EMS	19150	Staining component
4% paraformaldehyde (aq)	EMS	157-4-100	Primary fixative component
Absorbable hemostat	Ethicon	1961
Acetone	EMS	10012
Black polyamide monofilament suture, 10-0	AROSurgical instruments Corporation	TI38402
Black polyamide monofilament suture, 6-0	AROSurgical instruments Corporation	SN-1956
C57BL/6 mice	Jackson Laboratories	664	Approximately 1 yo
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	10043-52-4
Clamp applying forcep	FST	00072-14
Cotton tip applicators	Fisher Scientific	23-400-118
DPBS	Gibco	14190-144
Dumont #5 forcep	FST	11251-20
Dumont #5/45 forceps	FST	11251-35
Dumont #7 fine forcep	FST	11274-20
Durcupan ACM resin	EMS	14040	For embedding
Fine scissor	FST	14028-10
Heliscan microCT	Thermo Fisher Scientific		Micro-CT
Ketamine hydrochloride injection	Hospira Inc.	NDC 0409-2053
L-aspartic acid	Sigma-Aldrich	56-84-8	Staining component
Lead nitrate	EMS	17900	Staining component
low-vacuum backscatter detector	Thermo Fisher Scientific	VSDBS	SEM backscatter detector
Micro-adson forcep	FST	11018-12
Millex-GP filter, 0.22 um, PES 33mm, non-sterile	EMD Millipore	SLGP033NS
Non-woven songes	McKesson Corp.	94442000
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate	Sigma-Aldrich	14459-95-1	Staining component
Potassium hydroxide	Sigma-Aldrich	1310-58-3
Pressure monitor line	Smiths Medical ASD, Inc.	MX562
Saline solution (sterile 0.9% sodium chloride)	Hospira Inc.	NDC 0409-0138-22
Size 3 BEEM capsule	EMS	69910-01	Embedding container
Sodium cacodylate trihydrate	Sigma-Aldrich	6131-99-3	Buffer
Solibri retractors	FST	17000-04
Sputter, carbon and e-beam coater	Leica	EM ACE600	Gold coater
Surgical microscope	Leica	M80
Thiocarbohydrazide (TCH)	EMS	21900	Staining component
Tish needle holder/forcep	Micrins	MI1540
Trimmer	Wahl	9854-500
Uranyl acetate	EMS	22400	Staining component
Volumescope scanning electron microscope	Thermo Fisher Scientific	VOLUMESCOPESEM	Serial Block Face Scanning Electron Microscope
Xylazine sterile solution	Akorn Inc.	NADA# 139-236