Murine Pulmoner Kapakçığın Korelatif Görüntülemesi için Cerrahi ve Örnek İşleme

Özet

Burada, brüt uygunluğu ve lokal hücre dışı matris yapılarını belirlemek için murine pulmoner valfin eksizyon, basınçlandırma, fiksasyon ve görüntüleme için korelatif bir iş akışı açıklıyoruz.

Özet

Kalp kapakçığı ile ilgili hastalığın (HVD) altında kalan nedenler zor bulunur. Murine hayvan modelleri HVD'yi incelemek için mükemmel bir araç sağlar, ancak yapıyı ve organizasyonu birden fazla uzunluk ölçeğinde doğru bir şekilde ölçmek için gereken cerrahi ve enstrümantal uzmanlık ilerlemesini engellemıştır. Bu çalışma, kalp kapakçığını farklı uzunluk ölçeklerinde tasvir etmek için murine diseksiyonu, en blok boyama, örnek işleme ve korelatif görüntüleme prosedürlerinin ayrıntılı bir açıklamasını sunmaktadır. Hidrostatik transvalvüler basınç, kalp kapak konformasyonunu kimyasal olarak sabitlenerek zamansal heterojenliği kontrol etmek için kullanıldı. Kalp kapakçığının geometrisini doğrulamak ve seri blok yüz taramalı elektron mikroskopisi (SBF-SEM) için gereken aşağı akış numune işleme için referans sağlamak için mikro bilgisayarlı tomografi (μCT) kullanılmıştır. Hücre dışı matrisin (ECM) yüksek çözünürlüklü seri SEM görüntüleri alındı ve kuruluşunun yerel bir 3D gösterimini sağlamak için yeniden inşa edildi. Daha sonra pulmoner kapak boyunca mekansal varyasyonun üstesinden gelmek için μCT ve SBF-SEM görüntüleme yöntemleri korelasyona uğramıştır. Sunulan çalışma sadece pulmoner kapak üzerinde olmasına rağmen, bu metodoloji biyolojik sistemlerdeki hiyerarşik organizasyonu tanımlamak için benimsenebilir ve birden fazla uzunluk ölçeğinde yapısal karakterizasyon için çok önemlidir.

Giriş

Pulmoner kapak (PV), sağ ventrikül ile pulmoner arter arasında tek yönlü kan akışını sağlamaya yarar. Pulmoner kapak malformasyonları doğumsal kalp hastalığının çeşitli formları ile ilişkilidir. Konjenital kalp kapak hastalığının (HVD) mevcut tedavisi, bir hastanın ömrü boyunca birden fazla invaziv ameliyat gerektirebilen valvüler onarım veya kapak değişimidir^1. Kalp kapakçığının işlevinin, genellikle yapı-fonksiyon korelasyon olarak adlandırılan yapısından türetildiği yaygın olarak kabul edilmiştir. Daha spesifik olarak, kalbin geometrik ve biyomekanik özellikleri işlevini belirler. Mekanik özellikler, sırayla, ECM'nin bileşimi ve organizasyonu tarafından belirlenir. Murine kalp kapakçıklarının biyomekanik özelliklerini belirlemek için bir yöntem geliştirerek, transgenik hayvan modelleri ECM'nin kalp kapak fonksiyonu ve disfonksiyonu üzerindeki rolünü sorgulamak için kullanılabilir^2,3,4,5.

Murine hayvan modeli uzun zamandır moleküler çalışmalar için standart olarak kabul edilmektedir, çünkü transgenik modeller farelerde diğer türlere kıyasla daha hazırdır. Murine transgenik modeller kalp kapakçığı ile ilgili hastalıkları araştırmak için çok yönlü bir platform sağlar⁶. Bununla birlikte, hem geometriyi hem de ECM organizasyonunu karakterize etmek için cerrahi uzmanlık ve enstrümantasyon gereksinimleri, HVD araştırmalarının ilerlemesinde önemli bir engel olmuştur. Literatürdeki Hstolojik veriler, murine kalp kapakçığı hücre dışı matris içeriğine bir resim sağlar, ancak yalnızca 2B görüntüler şeklindedir ve 3D mimarisini tarif edemez^7,8. Ek olarak, kalp kapakçığı hem mekansal hem de zamansal heterojendir, bu da örnekleme ve uygunluk düzeltilmezse ECM organizasyonu ile ilgili deneylerde sonuç çıkarmayı zorlaştırır. MRI veya 3D ekokardiyografi gibi geleneksel 3D karakterizasyon yöntemleri, ECM bileşenleri^9,10'unçözümlenmesi için gerekli çözünürlüğü sağlamaz.

Bu çalışma, murine PV'nin hidrostatik transvalvüler basınçla uyumluluğunun sabitlenmesiyle kardiyak döngüye bağlı zamansal heterojenliğin ele alındığı tamamen korelatif bir iş akışını detaylandırmaktadır. Mekansal heterojenlik, ilgi çekici bölgeleri örneklemek ve farklı görüntüleme yöntemlerinden, özellikle μCT ve seri blok yüz tarama elektron mikroskopisinden farklı uzunluk ölçeklerinde veri setlerinin kaydedilmesiyle tam olarak kontrol edildi. Aşağı akış örneklemesine rehberlik etmek için μCT ile bu keşif yöntemi daha önce önerilmiştir, ancak pulmoner kapak zamansal varyasyon sergilediğinden, cerrahi seviye^11'deek bir kontrol seviyesine ihtiyaç duyulmuştu.

Murine kalp kapak biyomekaniği tanımlayan in vivo çalışmalar seyrektir ve bunun yerine deformasyon davranışını tanımlarken hesaplamalı modellere dayanır. Nanometre uzunluğu ölçeğindeki yerel hücre dışı verilerin kalp kapakçığının geometrisi ve konumu ile ilgili olması kritik öneme sahiptir. Bu da, mevcut biyomekanik kalp kapak modellerini^{12, 13,14}güçlendirmek için kullanılabilecek mekanik olarak katkıda bulunan ECM proteinlerinin ölçülebilir, mekansal olarak eşlenmiş dağılımlarını sağlar.

Protokol

Bu çalışmada hayvanların kullanımı AR13-00030 protokolü kapsamında Nationwide Çocuk Hastanesi kurumsal hayvan bakım ve kullanım komitesine uygun olarak yapıldı.

1. Pulmoner kapak eksizyonu

1. Fare diseksiyonu için gereken gerekli araçları otoklavlav. Buna ince makas, mikro tokalar, mikro vasküler kelepçeler, toka uygulanan kelepçe, mikroneedle tutucular, yay makası ve retraktörler dahildir.
2. Operasyondan önce tüm fareleri en az 2 hafta boyunca alıştırın. Yaklaşık 1 yaşında olan C57BL/6 fareleri kafeslerinden çıkarın ve tartın, ardından bir ketamin/ ksilazin kokteyli (3:1 ketamin:ksilazin, g başına 0.01 mL) aşırı doz ile ötenazi.
3. Fareyi bir tepsiye dorsal recumbence pozisyonuna getirin ve uzuvlarını bantla sabitleyin. Güvenli hale getirildikten sonra torakotomiyi gerçekleştirin.
   1. Fazla yağ dokusunu ve fasyayı çıkararak kalbi açığa çıkarın.
   2. Sağ kulakçık çıkarın ve oda sıcaklığında salin çözeltisi (%0,9 NaCl) ile sol ventrikülden perfüzyon. Perfüzyon 30 sn üzerinde yaklaşık 20 mL almalıdır. Bu, farenin exsanguination ile sonuçlanır.
4. Üstün vena kava, alt vena kava, pulmoner arter ve aort keserek tüm kalbi çıkarın. Pulmoner arter için özel dikkat edilmelidir. Ventrikülo-arteryal kavşaktan yaklaşık 2 mm yukarıda kesin, çünkü bu basınçlandırma kanalı görevi görecektir.
5. Odaları atmosferik basınca maruz bırakmak için sol ve sağ ventrikülleri çıkarın. Pulmoner gövdenin yapısının ventriküllerin çıkarılmasından etkilenmemesi gerektiğinden emin olun.

2. Pulmoner valf basıncı sabitlenerek

1. Pulmoner arterli anastomoz basınçlandırma tüpü, broşürlerin ve pulmoner gövdenin büyük hareketlerini karşılamak için çin-tübüler kavşak ile borunun ucu arasında yaklaşık 1 mm mesafe bırakır.
2. Rezervuarı benzer bir fizyolojik basınca yükseltin ve tuzlu su çözeltisi ile doldurun. Tıkanıklık veya hava kabarcığı olmadığından emin olmak için akış sistemini test edin.
3. Anastomosed pulmoner valf içine bir stopcock takın ve çıkış yolunu değiştirerek borudan yeterli akış sağlayın (yani hava kabarcıkları yok). Akış yeterli olduğunda, çıkışı anastomosed pulmoner valfe geçirin ve pulmoner gövdenin basınçlandırılmasını sağlayın. Bu pulmoner gövde distensiyonu ile tanımlanır.
4. Pulmoner gövdenin basınçlandırılması onaylandıktan sonra, tuzlu çözelti temizlenene kadar birincil fiksatif çözeltiyi (%1,25 glutaraldehit, 0,15 M kaodilatta%1,0 paraformaldehit) yavaş yavaş bir araya getir. Bu, tuzlu su çözeltisinin rezervuar kapasitesinin yaklaşık% 25'i olan bir kısmının çıkarılması ve birincil fiksatif ile değiştirilmesiyle yapılır.
   DİkKAT: Kullanılan fiksatifler (paraformaldehit ve glutaraldehit) oldukça zehirlidir ve güvenliği sağlamak için uygun kişisel koruyucu ekipman (KKD) giyilmelidir.
5. Kurumasını önlemek için doku örneğinin üzerine fiksatif ıslatılmış bir gazlı bez yerleştirin.
6. Sabitleyiciyi 3 saat boyunca perfuse edin, sabit bir basınç sağlamak için rezervuarı gerektiği gibi yeniden doldurun. Fiksasyon boyunca, pulmoner valf kimyasal fiksasyon nedeniyle küçülmesi nadir değildir. Bu durumda, fizyolojik basıncı korumak için rezervuarı sürekli olarak birincil fiksatif ile yeniler.
7. Kalp kapakçığını kullanıma kadar 4 °C'de sabitleyici çözeltide saklayın. Numuneler ayırt edilebilir bir fark olmadan 1 haftaya kadar saklandı.

3. En blok örnek boyama ve gömme^15,16

DİkKAT: Bu bölümde kullanılan lekelenme reaktifleri (potasyum ferrosiyanid, osmiyum tetroksid, tiyokarbohidrazid, kurşun aspartat ve uranil asetat) oldukça toksiktir ve aşırı dikkatli bir şekilde ele alınmalıdır. Duman kaputu ve uygun KKD kullanılması tavsiye edilir.

1. Boy -ama
   1. Sabit kalp kapakçığı örneğini soğuk 0,15 M kakadodylate tampon ile 5 dakika yıkayın. Yıkamayı iki kez daha tekrarlayın.
   2. Kalp kapakçığını% 1.5 potasyum ferrosiyanür, 0.15 M kakadodylat, 2 mM kalsiyum klorür ve% 2 osmiyum tetroksit çözeltisine tamamen batırın, 1 saat boyunca buz üzerinde.
   3. Numune inkübasyon yaparken, 0,1 g TCH'yi 10 mL ddH 2 O'da çözerek tiyokarbohidrazid_(TCH)çözeltisi hazırlayın. TCH'nin tamamen çözüldüğüne emin olmak için periyodik olarak hafifçe ajite edin. Çözeltiyi kullanımdan hemen önce 0,22 μm şırınna filtresinden geçirin.
   4. Numuneleri oda sıcaklığında ddH 2 O ile₅dakika boyunca ddH₂O'lik bir tüpe yerleştirerek yıkayın ve kabı sallayarak hafifçe çalkalayın. Bu işlemi üç kez tekrarlayın.
   5. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca filtrelenmiş TCH çözeltisine yerleştirin. 3.1.4 adımında açıklandığı gibi oda sıcaklığı ddH₂O ile yıkama adımını üç kez (her biri 5 dakika) gerçekleştirin.
   6. Tamamlandığında, numuneyi oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 2 osmiyum tetroksit içine yerleştirin. Daha sonra oda sıcaklığı ddH₂O ile her biri 5 dakika boyunca toplam üç kez tekrar yıkayın.
   7. Numuneyi 4 °C'de bir gecede %1 uranil asetat içinde kuluçkaya yatırın.
   8. Bu süre zarfında, 10 mL aspartik asit stok çözeltisinde 0.066 g kurşun nitrat çözeltisi yapın. 1 N KOH ile pH'ı 5,5'e ayarlayın. Kurşun nitrat çözmek için çözeltiyi 60 °C fırına yerleştirin.
   9. Gece kuluçkadan sonra, 3.1.4 adımında açıklandığı gibi yıkama adımını gerçekleştirin. Üç kez tekrarlayın. Ardından, kalp kapak dokusunu 60 °C fırında 30 ° C fırında 3.1.8 adımdan kurşun aspartat çözeltisinde 30 dakika boyunca kuluçkaya yatırın.
2. Dehidratasyon
   1. Dokuları oda sıcaklığında 5 dakika ddH₂O ile yıkayın.
   2. DDH 2 O'da %20, %50, %70, %90 ve_%100etanol taze çözümler yapın.
   3. Kalp kapak dokusunu susuzmak için. Her biri 5 dakika boyunca buz üzerinde% 20, % 50, % 70 ve% 90 etanol sonraki tedavileri gerçekleştirin. Daha sonra 5 dakika boyunca buz üzerinde% 100 etanol iki sonraki tedavileri gerçekleştirin.
   4. Dokuyu 10 dakika boyunca buz gibi asetona taşıyın. Daha sonra 10 dakika boyunca oda sıcaklığında taze aseton yerleştirin.
3. Katıştırma
   1. Reçine karışımını (bkz. Malzeme Tablosu) üreticininözelliklerine göre yapın: 11,4 g bileşen A, 10 g bileşen B, 0,3 g C bileşeni ve 0,05-0,1 g bileşen D. Başlangıçta C ve D bileşenlerini eklemeden önce bileşenlerin her birini 60 °C'ye ısıtarak A ve B bileşenlerini karıştırın. Karışım, C ve D bileşenlerinin eklenmesiyle kehribar rengine dönüşecektir. Düzgün bir şekilde karıştırıldığında düzgün olacaktır.
   2. Hacim oranları 25:75, 50:50 ve 75:25 reçine:aseton olan karışımlar yapın. İyice karıştırın.
   3. Dokuları 25:75, 50:50 ve 75:25 reçine:aseton karışımının sonraki tedavilerine oda sıcaklığında 2 saat yerleştirin.
   4. Dokuları oda sıcaklığında gece boyunca% 100 reçineye yerleştirin.
   5. Ertesi gün, dokuları oda sıcaklığında 2 saat boyunca taze% 100 reçineye yerleştirin.
   6. Kalp kapak dokularını gömme bir kapsüle aktarın, taze% 100 reçine ile değiştirin ve tedavi etmek için 48 saat boyunca 60 ° C fırına yerleştirin.
4. Aşağıda gösterildiği gibi korelatif görüntüleme gerçekleştirin.

4. Mikro bilgisayarlı tomografi görüntüleme

1. Reçine numune bloğunu yapıştırıcılı bir μCT numune tutucusuna monte haline (tutkal veya çift taraflı bant iyi çalışır).
2. Tutucuyu μCT haznesine yerleştirin ve rekolteyi tutucunun hareketi olmayacak şekilde vidalayarak sahneye sabitlayın. Tarama sırasındaki örnek hareketi görüntü kalitesini düşürecektir.
3. Simgeye çift tıklayarak μCT kullanıcı arabirimini açın. Projeler'in yanındaki + işaretini seçerek proje ekleyin ve gerekli alanları doldurun.
4. Bu oluşturulduktan sonra, oluşturulan projeyi bulun ve üzerine tıklayarak seçin. Bu ikinci bir sütun açılır Edinmeler. Edinmeler'in yanındaki + işaretini seçin ve gerekli alanları doldurun.
5. Ön paneldeki veya μCT'deki arming düğmesine basarak oda kapılarını kapatın ve sistemi silahlandırma.
   NOT: Sistem, başarılı bir ısınma prosedürünün ardından x ışınlarını otomatik olarak kapatacaktır. Düğmeyi seçerek x ışınlarını açın.
6. Sahne dönüşünü, numunenin dönüşünün merkezi monitörün merkezinden sapmayacak şekilde ayarlayın (yani, örnek tüm tarama için görüş alanı içindedir). Bu deneme için kullanılan sistem için bu, aşağıda ayrıntılı olarak belirtildiği gibi açılan sekmenin altındaki ilgi alanı (ROI) aşamasının ayarlanmasını içerir.
   1. Dönüş açısını 0° olarak ayarlayarak ve numunenin kenarını işaretleyerek yatırım getirisi aşaması ayarını ayarlayın. Numune daha sonra 180° döndürülür ve numunenin kenarı tekrar işaretlenir.
   2. Yatırım getirisi aşaması x ekseni konumunu, örneğin kenarı bu iki uç nokta arasında olacak şekilde ayarlayın. Y konumu için 90° ve 270° dönüş açıları için bu işlemi tekrarlayın.
   3. Numunenin dönmesinin kenarların görüş alanının dışına çıkmasına neden olması durumunda, numunenin kenarları yukarıdaki ayarlanan açılarda görünene ve kaba bir ROI aşaması ayarı yapılıp yapılına kadar μCT ihtiyacının büyütmesini azaltın.
   4. Alt büyütmede ayarlandıktan sonra, büyütmeyi artırmak için numuneyi veya dedektörü hareket ettirın ve yatırım getirisi konumları iyi ayarlanabilir.
      NOT: Hizalamayı sağlamak için bu işlemin tekrarlanması gerekebilir. Uygun hizalama, tüm numune dönüş açılarında çok az veya hiç yatay hareket gösteren bir örnekle sonuçlanır.
7. Üreticinin yazılımını kullanarak μCT'yi istenen tarama parametrelerine ayarlayın. Bu parametreler tüp potansiyeli, tüp akımı, dedektör mesafesi, numune mesafesi, pozlama süresi, yörünge ve projeksiyon sayısını içerir (bu çalışmada kullanılan μCT alma parametreleri için Tablo S1'e bakın).
   NOT: Açık alan ve karanlık alan taramaları gibi kalibrasyon parametreleri, aksi belirtilmedikçe üreticinin teknik özelliklerinde tutulmalıdır. Örneğin, bir örnek çok büyükse ve sistem örneği alan görünümünün dışına taşıyamıyorsa, temiz alan kalibrasyon taramaları gerçekleştirmek için numunenin kaldırılması gerekir.
8. Parametreler ayarlandıktan sonra, Zaman Tahmini düğmesine basarak tarama süresinin yaklaşık bir tahmini görülebilir. Taramaya başlamak için Başlat düğmesini seçin.
9. Tarama tamamlandıktan sonra, x ışınlarının kapalı olduğundan emin olun, rekolteyi sökün ve numuneyi μCT odasından dikkatlice çıkarın.

5. Örnek işleme ve görüntü korelasyonu

1. μCT projeksiyonlarını, üretici tarafından sağlanan yazılımla filtrelenmiş bir geri projeksiyon algoritması kullanarak yeniden oluşturun (bkz. Malzeme Tablosu).
   1. Ekranın üst kısmındaki Keşif sekmesini seçin. Proje ve Edinme sekmesini seçin.
   2. Filtre uygulanmış geri projeksiyonla ilgili keşif şablonu ilişkilendirmesini seçin. Keşif Başlat düğmesine basın.
2. Görüntü işleme yazılımını kullanarak pulmoner vanayı tanımlayın ve segmentlere ayırın. Bu, pulmoner kapakçığın anatomisi hakkında önceden bilgi gerektirir¹⁷. Yüksek arteriyel basınçlarda, broşürler pulmoner kapakçığın lümenini kodlar ve bloke eder.
3. Tarama yönüne ve örneğe göre dilimleme yönünü tanımlayın. Örneği, dilimleme yönünün istenen eksenle hizalanarak yeniden yönlendirin.
4. Yüksek çözünürlüklü görüntüleme için ilgi çekici bölgeleri belirleyin. Bu deneyde broşür ve arterio-valvüler kavşağın göbeği (ortası) seçilmiştir.
5. Fazla reçineyi çıkarın ve büyük malzeme parçaları için jilet veya zımparalama veya daha ince parçalar için mikrotom ile numune alın.
6. İlgi çekici bir yere geldikten sonra, konumu onaylamak için fiziksel numuneyi sanal μCT dilimleriyle karşılaştırın. Bu, kesitteki anatomik özellikler karşılaştırılarak yapıldı.

6. Seri blok yüz taramalı elektron mikroskopisi¹⁸

1. Numunenin kesitini SBF-SEM'e uyum sağlayacak şekilde yaklaşık 2,0 x 1,5 x 1,8 mm azaltacak şekilde azaltın.
2. Kırpılmış numuneyi epoksi kullanarak SBF-SEM alüminyum saplama üzerine monte edin.
3. Numune bloğunu 35 nm altınla kapla. Eşit bir kaplama katmanı uygulamak için numuneyi platformda döndürün.
4. SBF-SEM haznesini havalandır ve bıçak bıçağının yüksekliğini mikroskop ösantrik yüksekliğine ayarlayın.
5. Örneği yerleştirin ve örnek saplamayı seviyelendirmeyin.
6. Şarjı önlemek için düşük vakum koşullarında ve geri tetektör dedektörüyle görüntü (SBF-SEM alma parametreleri için Tablo S2'ye bakın).
7. Otomatik yazılım kullanarak farklı büyütmelerde birden fazla ilgi çekici bölgeyi görüntüleyin ve dikin (bkz. Malzeme Tablosu).

Sonuçlar

Pulmoner arterin basınç tüpüne anastomozu Şekil 1A'dagösterilmiştir. Hidrostatik basınç uygulamasını takiben, pulmoner gövde, pulmoner valf broşürlerinin kapalı bir konfigürasyonda olduğunu gösteren radyal olarak(Şekil 1B)dağılır. Pulmoner kapak uyumu μCT ile doğrulandı. Bu durumda, broşürler coapt (kapalı) ve annulus dairesel (Şekil 2A). Şekil 2B,C, fiksas...

Tartışmalar

Ventriküllerin çıkarılması iki amaca hizmet eder. Birincisi, ventrikül tarafını atmosferik basınca maruz bırakmak, böylece sadece akciğer kapakçığının arteryal tarafından kapanmak için bir transvalvüler basınç uygulamak gerekir ve ikincisi, pulmoner gövdenin bükülmesini önlemek için kararlı bir taban sağlar. Basınçlandırma sırasında, pulmoner gövde radyal ve alt yönden dağılır, bükülmeye eğilimli hale getirir ve pulmoner gövdenin çökmesine neden olur. Pulmoner vananın tuzlu s...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
25% glutaraldehyde (aq)	EMS	16210	Primary fixative component
0.9% sodium chloride injection	Hospira Inc.	NDC 0409-4888-10
1 mL syringe	BD	309659
10 mL syringe	BD	309604
200 proof ethanol	EMS	15055
22G needle	BD	305156
3 mL syringe	BD	309657
3-way stopcock	Smiths Medical ASD, Inc.	MX5311L
4% osmium tetroxide	EMS	19150	Staining component
4% paraformaldehyde (aq)	EMS	157-4-100	Primary fixative component
Absorbable hemostat	Ethicon	1961
Acetone	EMS	10012
Black polyamide monofilament suture, 10-0	AROSurgical instruments Corporation	TI38402
Black polyamide monofilament suture, 6-0	AROSurgical instruments Corporation	SN-1956
C57BL/6 mice	Jackson Laboratories	664	Approximately 1 yo
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	10043-52-4
Clamp applying forcep	FST	00072-14
Cotton tip applicators	Fisher Scientific	23-400-118
DPBS	Gibco	14190-144
Dumont #5 forcep	FST	11251-20
Dumont #5/45 forceps	FST	11251-35
Dumont #7 fine forcep	FST	11274-20
Durcupan ACM resin	EMS	14040	For embedding
Fine scissor	FST	14028-10
Heliscan microCT	Thermo Fisher Scientific		Micro-CT
Ketamine hydrochloride injection	Hospira Inc.	NDC 0409-2053
L-aspartic acid	Sigma-Aldrich	56-84-8	Staining component
Lead nitrate	EMS	17900	Staining component
low-vacuum backscatter detector	Thermo Fisher Scientific	VSDBS	SEM backscatter detector
Micro-adson forcep	FST	11018-12
Millex-GP filter, 0.22 um, PES 33mm, non-sterile	EMD Millipore	SLGP033NS
Non-woven songes	McKesson Corp.	94442000
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate	Sigma-Aldrich	14459-95-1	Staining component
Potassium hydroxide	Sigma-Aldrich	1310-58-3
Pressure monitor line	Smiths Medical ASD, Inc.	MX562
Saline solution (sterile 0.9% sodium chloride)	Hospira Inc.	NDC 0409-0138-22
Size 3 BEEM capsule	EMS	69910-01	Embedding container
Sodium cacodylate trihydrate	Sigma-Aldrich	6131-99-3	Buffer
Solibri retractors	FST	17000-04
Sputter, carbon and e-beam coater	Leica	EM ACE600	Gold coater
Surgical microscope	Leica	M80
Thiocarbohydrazide (TCH)	EMS	21900	Staining component
Tish needle holder/forcep	Micrins	MI1540
Trimmer	Wahl	9854-500
Uranyl acetate	EMS	22400	Staining component
Volumescope scanning electron microscope	Thermo Fisher Scientific	VOLUMESCOPESEM	Serial Block Face Scanning Electron Microscope
Xylazine sterile solution	Akorn Inc.	NADA# 139-236