JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يؤدي انكماش الأسمنت السني أثناء المعالجة إلى إزاحة الصفيحة الأساسية. يقلل هذا البروتوكول من المشكلة عن طريق إنشاء أساس أولي لأسمنت الأسنان يترك مساحة لتدعيم الصفيحة الأساسية. بعد أسابيع ، يمكن تثبيت الصفيحة الأساسية في موضعها على هذه السقالة باستخدام القليل من الأسمنت الجديد ، وبالتالي تقليل الانكماش.

Abstract

يستخدم علماء الأعصاب المجاهر المصغرة (المناظير) لمراقبة النشاط العصبي في الحيوانات التي تتصرف بحرية. يوفر فريق Miniscope بجامعة كاليفورنيا ، لوس أنجلوس (UCLA) موارد مفتوحة للباحثين لبناء مناظير صغيرة بأنفسهم. يعد V3 UCLA Miniscope أحد أشهر المناظير مفتوحة المصدر المستخدمة حاليا. يسمح بتصوير العابرات الفلورية المنبعثة من الخلايا العصبية المعدلة وراثيا من خلال عدسة موضوعية مزروعة على القشرة السطحية (نظام أحادي العدسة) ، أو في مناطق الدماغ العميقة من خلال مزيج من عدسة ترحيل مزروعة في الدماغ العميق وعدسة موضوعية مثبتة مسبقا في المنظار الصغير لمراقبة الصورة المنقولة (نظام ثنائي العدسات). حتى في ظل الظروف المثلى (عندما تعبر الخلايا العصبية عن مؤشرات مضان ويتم زرع عدسة الترحيل بشكل صحيح) ، يمكن أن يؤدي تغيير حجم الأسمنت السني بين الصفيحة الأساسية وتعلقها بالجمجمة عند معالجة الأسمنت إلى اختلال المحاذاة مع تغيير المسافة بين الهدف وعدسات التتابع ، مما يؤدي إلى ضعف جودة الصورة. الصفيحة الأساسية هي صفيحة تساعد على تركيب المنظار الصغير على الجمجمة وتثبت مسافة العمل بين الهدف وعدسات الترحيل. وبالتالي ، فإن التغيرات في حجم الأسمنت السني حول الصفيحة الأساسية تغير المسافة بين العدسات. يهدف البروتوكول الحالي إلى تقليل مشكلة الاختلال الناتجة عن التغيرات في الحجم في الأسمنت السني. يقلل البروتوكول من اختلال المحاذاة عن طريق بناء أساس أولي لأسمنت الأسنان أثناء زرع عدسة التتابع. وقت النقاهة بعد الزرع كاف لأساس الأسمنت السني لعلاج الصفيحة تماما ، لذلك يمكن تدعيم الصفيحة على هذه السقالة باستخدام أقل قدر ممكن من الأسمنت الجديد. في هذه المقالة ، نصف استراتيجيات الطلاء الأساسي في الفئران لتمكين تصوير النشاط العصبي باستخدام عدسة موضوعية مثبتة في المنظار المصغر.

Introduction

تعتبر مراسلات النشاط الفلوري مثالية لتصوير النشاط العصبي لأنها حساسة ولها نطاقات ديناميكية كبيرة1،2،3. لذلك ، يستخدم عدد متزايد من التجارب الفحص المجهري الفلوري لمراقبة النشاط العصبي مباشرة1،2،3،4،5،6،7،8،9،10،11،12،13،14،15 ، 16. تم تصميم أول مجهر مضان مصغر أحادي الفوتون (miniscope) في عام 2011 بواسطة Mark Schnitzer et al.5. يمكن هذا المنظار الصغير الباحثين من مراقبة ديناميكيات التألق للخلايا المخيخية في الحيوانات التي تتصرف بحرية5 (أي دون أي تقييد جسدي أو تقييد للرأس أو تخدير أو تخدير للحيوانات). حاليا ، يمكن تطبيق هذه التقنية لمراقبة مناطق الدماغ السطحية مثل القشرة6،8،15،16. المناطق تحت القشرية مثل الحصين الظهري8،11،13،14 والمخطط6،17 ؛ ومناطق الدماغ العميقة مثل الحصين البطني14 واللوزة10،18 ، وما تحت المهاد8،12.

في السنوات الأخيرة ، تم تطوير العديد من المناظير مفتوحة المصدر4,5,6,7,11,13,17,19. يمكن تجميع المنظار الصغير اقتصاديا من قبل الباحثين إذا اتبعوا الإرشادات خطوة بخطوة المقدمة من فريق Miniscope بجامعة كاليفورنيا ، لوس أنجلوس (UCLA)4,7,11,13. لأن المراقبة البصرية للنشاط العصبي مقيدة بقيود انتقال الضوء7 من وإلى المجموعة العصبية ذات الاهتمام ، تم تصميم منظار صغير يتطلب عدسة معامل الانكسار المتدرج الموضوعي (GRIN) (أو العدسة الموضوعية) ليتم تثبيتها مسبقا في الجزء السفلي من المنظار المصغر لتكبير مجال الرؤية الذي يتم ترحيله من عدسة GRIN التتابع (أو عدسة الترحيل)6,7,8,10,16,17. يتم زرع عدسة التتابع هذه في منطقة الدماغ المستهدفة بحيث يتم نقل نشاط التألق لمنطقة الدماغ المستهدفة على سطح عدسة التتابع6,7,8,10,16,17. ينتقل ما يقرب من 1/4 من فترة الضوء الجيبية الكاملة عبر عدسة GRIN الموضوعية (~ 0.25 درجة) (الشكل 1A1)، مما أدى إلى صورة مضان مكبرة6,7. لا يتم تثبيت العدسة الشيئية دائما في الجزء السفلي من المنظار الصغير ولا يلزم زرع عدسة التتابع6,7,11,13,15. على وجه التحديد ، هناك تكوينان: أحدهما بعدسة موضوعية ثابتة في المنظار الصغير وعدسة ترحيل مزروعة في الدماغ8,10,12,14,16 (الشكل 1B1) وآخر مع عدسة موضوعية قابلة للإزالة فقط6,7,11,13,15 (الشكل 1B2). في التصميم القائم على الهدف الثابت ومجموعة عدسات الترحيل المزروعة ، يتم إحضار إشارات التألق من الدماغ إلى السطح العلوي لعدسة التتابع (الشكل 1A1)7,8,10,12,14,16. بعد ذلك ، يمكن للعدسة الشيئية تكبير المجال البصري ونقله من السطح العلوي لعدسة الترحيل (الشكل 1 أ 2). من ناحية أخرى ، فإن تصميم عدسة GRIN الموضوعي القابل للإزالة أكثر مرونة ، مما يعني أن الزرع المسبق لعدسة التتابع في الدماغ ليس إلزاميا (الشكل 1B2)6,7,11,13,15. عند استخدام منظار صغير يعتمد على تصميم عدسة موضوعية قابلة للإزالة ، لا يزال الباحثون بحاجة إلى زرع عدسة في منطقة الدماغ المستهدفة ولكن يمكنهم إما زرع عدسة موضوعية6,7,11,13,15 أو عدسة ترحيل في الدماغ6,7. يحدد اختيار الهدف أو عدسة التتابع للزرع تكوين المنظار المصغر الذي يجب على الباحث استخدامه. على سبيل المثال ، يعتمد V3 UCLA Miniscope على تصميم عدسة GRIN موضوعي قابل للإزالة. يمكن للباحثين اختيار إما زرع عدسة موضوعية مباشرة في منطقة الدماغ محل الاهتمام وتركيب المنظار الصغير "الفارغ" على العدسة الشيئية6,7,11,13,15 (نظام عدسة واحدة؛ الشكل 1B2) أو لزرع عدسة ترحيل في الدماغ وتركيب منظار صغير مثبت مسبقا بعدسة موضوعية6,7 (نظام ثنائي العدسة؛ الشكل 1B1). ثم يعمل المنظار الصغير ككاميرا مضان لالتقاط صور البث المباشر للتألق العصبي الناتج عن مؤشر الكالسيوم المشفر وراثيا1,2,3. بعد توصيل miniscope بجهاز كمبيوتر ، يمكن نقل صور التألق هذه إلى الكمبيوتر وحفظها كمقاطع فيديو. يمكن للباحثين دراسة النشاط العصبي من خلال تحليل التغيرات النسبية في التألق مع بعض حزم التحليل20,21 أو اكتب رموزهم للتحليل المستقبلي.

يوفر V3 UCLA Miniscope المرونة للمستخدمين لتحديد ما إذا كانوا يريدون تصوير النشاط العصبي باستخدام نظام أحادي أو ثنائي العدسة7. يعتمد اختيار نظام التسجيل على عمق وحجم منطقة الدماغ المستهدفة. باختصار ، يمكن لنظام العدسة الواحدة فقط تصوير منطقة سطحية (أقل من عمق 2.5 مم تقريبا) وكبيرة نسبيا (أكبر من 1.8 × 1.8 مم2 تقريبا) لأن الشركات المصنعة تنتج فقط حجما معينا من العدسة الموضوعية. في المقابل ، يمكن تطبيق نظام ثنائي العدسة على أي منطقة دماغية مستهدفة. ومع ذلك ، فإن الأسمنت السني للصق الصفيحة يميل إلى التسبب في اختلال المحاذاة مع تغيير المسافة بين الهدف وعدسات الترحيل ، مما يؤدي إلى جودة صورة رديئة. إذا تم استخدام نظام العدستين ، فيجب استهداف مسافتين للعمل بدقة لتحقيق جودة التصوير المثلى (الشكل 1 أ). هاتان المسافتان الحرجتان للعمل هما بين الخلايا العصبية والسطح السفلي لعدسة الترحيل ، وبين السطح العلوي لعدسة الترحيل والسطح السفلي للعدسة الشيئية (الشكل 1A1). يؤدي أي اختلال في محاذاة العدسة أو وضعها في غير موضعها خارج مسافة العمل إلى فشل التصوير (الشكل 1C2). في المقابل ، يتطلب نظام العدسة الواحدة مسافة عمل دقيقة واحدة فقط. ومع ذلك ، فإن حجم العدسة الموضوعية يحد من تطبيقها لمراقبة مناطق الدماغ العميقة (العدسة الموضوعية التي تناسب المنظار الصغير هي حوالي 1.8 ~ 2.0 مم6،11،13،15). لذلك ، فإن زرع عدسة موضوعية محدود لمراقبة السطح ومناطق الدماغ الكبيرة نسبيا ، مثل القشرة6,15 والقرنية الظهرية ammonis 1 (CA1) في الفئران11,13 . بالإضافة إلى ذلك ، يجب استنشاق مساحة كبيرة من القشرة لاستهداف الظهرية CA111,13. نظرا لمحدودية تكوين العدسة الواحدة الذي يمنع تصوير مناطق الدماغ العميقة ، فإن أنظمة المنظار الصغير التجارية لا تقدم سوى تصميم عدسة موضوعية / عدسة ترحيل (عدستان). من ناحية أخرى ، يمكن تعديل المنظار المصغر V3 UCLA إلى نظام أحادي العدسة أو عدستين لأن عدسته الموضوعية قابلة للإزالة6،11،13،15. بمعنى آخر ، يمكن لمستخدمي V3 UCLA miniscope الاستفادة من العدسة القابلة للإزالة عن طريق زرعها في الدماغ (إنشاء نظام عدسة واحدة) ، عند إجراء تجارب تتضمن ملاحظات دماغية سطحية (أقل من 2.5 مم في العمق) ، أو عن طريق تثبيتها مسبقا في المنظار الصغير وزرع عدسة ترحيل في الدماغ (إنشاء نظام ثنائي العدسات) ، عند إجراء التجارب التي تنطوي على ملاحظات الدماغ العميقة. يمكن أيضا تطبيق نظام العدستين لمراقبة الدماغ بشكل سطحي ، ولكن يجب على الباحث معرفة مسافات العمل الدقيقة بين العدسة الشيئية وعدسة الترحيل. الميزة الرئيسية لنظام العدسة الواحدة هي أن هناك فرصة أقل لفقدان مسافات العمل مقارنة بنظام العدستين ، نظرا لوجود مسافتين للعمل يجب استهدافهما بدقة لتحقيق جودة التصوير المثلى في نظام العدستين (الشكل 1 أ). لذلك ، نوصي باستخدام نظام عدسة واحدة لملاحظات الدماغ السطحية. ومع ذلك ، إذا كانت التجربة تتطلب التصوير في منطقة الدماغ العميقة ، فيجب على الباحث أن يتعلم تجنب اختلال العدسات.

يتضمن البروتوكول الأساسي لتكوين العدسة الثنائية للمناظير للتجارب زرع العدسة والطلاء الأساسي8،10،16،17. الطلاء الأساسي هو لصق صفيحة أساسية على رأس بحيث يمكن تركيب المنظار الصغير في النهاية فوق الحيوان وتصوير إشارات التألق للخلايا العصبية بالفيديو (الشكل 1 ب). يتضمن هذا الإجراء استخدام الأسمنت السني لصق الصفيحة على الجمجمة (الشكل 1C) ، لكن انكماش الأسمنت السني يمكن أن يسبب تغييرات غير مقبولة في المسافة بين عدسة الترحيل المزروعة والعدسة الموضوعية 8,17. إذا كانت المسافة المتحولة بين العدستين كبيرة جدا ، فلا يمكن التركيز على الخلايا.

تم بالفعل نشر بروتوكولات مفصلة لتجارب تصوير الكالسيوم في الدماغ العميق باستخدام المناظير8,10,16,17. استخدم مؤلفو هذه البروتوكولات نظام Inscopix8,10,16 أو غيرها من التصاميم المخصصة17 ووصفت الإجراءات التجريبية للانتقاء الفيروسي والجراحة وربط الصفيحة الأساسية. ومع ذلك ، لا يمكن تطبيق بروتوكولاتهم بدقة على أنظمة أخرى مفتوحة المصدر ، مثل نظام V3 UCLA Miniscope ، NINscope6، وفينسكوب19. يمكن أن يحدث اختلال في محاذاة العدستين أثناء التسجيل في تكوين ثنائي العدسة باستخدام UCLA Miniscope بسبب نوع الأسمنت السني المستخدم لتثبيت الصفيحة الأساسية في الجمجمة8,17 (الشكل 1 ج). هناك حاجة إلى البروتوكول الحالي لأن المسافة بين عدسة الترحيل المزروعة والعدسة الموضوعية عرضة للتحول بسبب الانكماش غير المرغوب فيه لأسمنت الأسنان أثناء إجراء الطلاء الأساسي. أثناء الطلاء الأساسي ، يجب العثور على مسافة العمل المثلى بين عدسة الترحيل المزروعة والعدسة الموضوعية عن طريق ضبط المسافة بين المنظار الصغير وأعلى عدسة الترحيل ، ويجب بعد ذلك لصق الصفيحة الأساسية في هذا الموقع المثالي. بعد ضبط المسافة الصحيحة بين العدسة الشيئية وعدسة الترحيل المزروعة ، يمكن الحصول على قياسات طولية بدقة خلوية (الشكل 1 ب; in vivo تسجيل). نظرا لأن النطاق الأمثل لمسافات العمل لعدسة التتابع صغير (50 - 350 ميكرومتر)4,8، يمكن أن يؤدي الانكماش المفرط للأسمنت أثناء المعالجة إلى صعوبة الحفاظ على العدسة الموضوعية وعدسة الترحيل المزروعة ضمن النطاق المناسب. الهدف العام من هذا التقرير هو توفير بروتوكول للحد من مشاكل الانكماش8,17 التي تحدث أثناء إجراء الطلاء الأساسي ولزيادة معدل نجاح تسجيلات miniscope لإشارات التألق في تكوين ثنائي العدسات. يتم تعريف تسجيل miniscope الناجح على أنه تسجيل بث مباشر للتغيرات النسبية الملحوظة في مضان الخلايا العصبية الفردية في يتصرف بحرية. على الرغم من أن العلامات التجارية المختلفة لأسمنت الأسنان لها معدلات انكماش مختلفة ، يمكن للباحثين اختيار علامة تجارية تم اختبارها مسبقا6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,22. ومع ذلك ، ليس من السهل الحصول على كل علامة تجارية في بعض البلدان / المناطق بسبب لوائح استيراد المواد الطبية. لذلك ، قمنا بتطوير طرق لاختبار معدلات انكماش الأسمنت السني المتاح ، والأهم من ذلك توفير بروتوكول بديل يقلل من مشكلة الانكماش. الميزة على بروتوكول الطلاء الأساسي الحالي هي زيادة معدل نجاح تصوير الكالسيوم بالأدوات والأسمنت التي يمكن الحصول عليها بسهولة في المختبرات. يتم استخدام منظار UCLA المصغر كمثال ، ولكن البروتوكول ينطبق أيضا على المناظير الأخرى. في هذا التقرير ، نصف إجراء طلاء أساسي محسن ونوصي أيضا ببعض الاستراتيجيات لتركيب نظام UCLA miniscope ثنائي العدسة (الشكل 2 أ). يتم تقديم كل من أمثلة الزرع الناجح (ن = 3 فئران) وأمثلة على الزرع الفاشل (ن = 2 فئران) للتكوين ثنائي العدسة مع منظار UCLA المصغر جنبا إلى جنب مع المناقشات لأسباب النجاح والفشل.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات التي أجريت في هذه الدراسة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان بجامعة تايوان الوطنية (رقم الموافقة: NTU-109-EL-00029 و NTU-108-EL-00158).

1. تقييم حجم تغيير الأسمنت السني

ملاحظة: تحدث تغييرات في حجم الأسمنت السني أثناء عملية المعالجة. اختبر التغيرات في حجم الأسمنت السني قبل الزرع والطلاء الأساسي. يمكن للباحثين اختبار أي نوع من الأسمنت السني واستخدام العلامة التجارية بأقل تغيير في الحجم لتدعيم الصفيحة الأساسية. مثال موضح في الشكل 3.

  1. تزن 0.5 غرام من كل مسحوق أسمنت أسنان وتخلطه مع محلوله المناسب (1 مل).
    ملاحظة: نسبة المسحوق / السائل الموصى بها في تعليمات الأسمنت السني هي 0.5 جم من المسحوق إلى 0.25 مل من المحلول للحصول على شكل صلب. يخفف بروتوكول الاختبار هذا النسبة إلى 0.5 جم / مل بحيث يمكن استنشاق الخليط في شكل سائل من أجل قياس تغير الحجم في أطراف الماصة.
  2. استخدم أطراف ماصة 0.1-10 ميكرولتر لإزالة 2.5 ميكرولتر من خليط الأسمنت السني ، ثم أغلق طرف الماصة بغراء معالجة خفيف.
  3. ضع الأطراف على رف ، وحدد أعلى مستويات خليط الأسمنت السني ، وقم بقياس مستوى خليط الأسمنت السني بعد 40 دقيقة (الفيديو التكميلي S1).
  4. بالإضافة إلى مراقبة تغيرات المستوى أثناء معالجة الأسمنت السني في الأطراف ، قم بقياس كثافة الأسمنت الجاف المتبقية. لحساب الكثافة ، قم بقياس وزن الأسمنت السني ، وقياس الحجم باستخدام مبدأ أرخميدس.
    1. باختصار ، ضع الأسمنت الجاف المتبقي في كوب مملوء بالماء ، وقم بوزن الماء الذي يفيض.
  5. استخدم الأسمنت السني بأقل انكماش لجميع البروتوكولات المفصلة أدناه.

2. التخدير ، والزرع الجراحي ، والحقن الفيروسي ، والطلاء الأساسي الوهمي

  1. تخدير
    ملاحظة: يهدف هذا التقرير إلى تحسين إجراء الجراحة والطلاء الأساسي لمنظار UCLA المصغر. لذلك ، كان من المفترض أن العيار الفيروسي الأمثل لإصابة مناطق الدماغ المستهدفة كان معروفا. يمكن العثور على طرق العثور على العيار الفيروسي الأمثل في الخطوات من 1 إلى 5 من Resendez et al.8. بمجرد تحسين التخفيف الفيروسي ، يمكن البدء في الزرع الجراحي.
    1. ضع الماوس في وعاء حثي وزود الأكسجين (100٪ بمعدل تدفق هواء يبلغ 0.2 لتر / دقيقة). قم بأكسجة الماوس لمدة 5 إلى 10 دقائق.
    2. يتم تطبيق 5٪ إيزوفلوران ممزوجا بأكسجين 100٪ (معدل تدفق الهواء: 0.2 لتر/دقيقة) حتى يبدأ الفأر في فقدان توازنه ويتم تخديره في النهاية.
    3. أخرج الفأر من غرفة الحث وحقن الأتروبين (0.04 مجم / كجم ؛ حقن تحت الجلد) ، لمنع تراكم اللعاب والبوبرينورفين (0.03 مجم / كجم ؛ حقن تحت الجلد) كمسكن.
    4. حلق رأس الماوس.
    5. ارتد قناعا وثوبا معقما وقفازات. إعداد مساحة معقمة وأدوات جراحية معقمة للجراحة. تثبيت رأس الماوس (الحفاظ على التخدير مع 3 إلى 2.5 ٪ إيزوفلوران خلال هذه الخطوة) على الجهاز المجسم. بعد إجراءات المسكنات والتخدير ، تأكد من أن قضبان الأذن تثبت الرأس بشكل آمن. توفير الدعم الحراري.
    6. تأكد من ضبط الرأس في وضع مستقيم ، وتعقيم الرأس المحلوق بالبيتادين ، ثم رش الرأس بالزيلوكايين (10٪) ، وهو مسكن موضعي.
    7. ضع مرهما بيطريا على العينين لمنع الجفاف.
      ملاحظة: استخدم مرهم العيون لحماية العين أثناء جميع أحداث التخدير لمنع إصابة العين.
    8. اختبار منعكس الألم العميق للحيوان عن طريق معسر مخلبه الخلفي. بمجرد أن لا يظهر الحيوان أي منعكس انسحاب مخلب ، تابع الإجراءات الجراحية.
    9. قم بعمل شق صغير على طول المستوى السهمي الأوسط للجمجمة (يبدأ من حوالي 2 مم من الأمام إلى البريغما وينتهي بحوالي 6 مم خلف البريغما). بعد ذلك ، قم بتنظيف النسيج الضام على الجمجمة ، وقم بتثبيت ثلاثة براغي من الفولاذ المقاوم للصدأ على العظام الأمامية اليسرى وبين الجداري.
      1. عند هذه النقطة ، قلل الأيزوفلوران إلى 1-2٪. مراقبة معدل التنفس خلال العملية الجراحية بأكملها. إذا كان معدل التنفس بطيئا جدا (حوالي 1 / ثانية ، اعتمادا على الحيوان) ، قلل من تركيز الأيزوفلوران.
    10. قم بإجراء حج القحف لزرع عدسة التتابع تحت المجهر الجراحي أو المجهر المجسم باستخدام مثقاب لدغ بقطر طرف 0.7 مم. استخدم مثقابا صغيرا للاستيلاء على مثقاب الأزيز ورسم مخطط تفصيلي لمنطقة الدائرة المقصودة (لا يلزم اختراق السماكة الكاملة للكالفايوم).
      ملاحظة: يبلغ قطر عدسة الترحيل المستخدمة في البروتوكول الحالي 1.0 مم ، وطولها ~ 9.0 مم في الملعب 1 ، ونطاق مسافة العمل ~ 100 ميكرومتر - 300 ميكرومتر ؛ لذلك ، كان قطر حج القحف 1.2 ملم.
      1. تعميق الخطوط العريضة برفق حتى تنكشف الجافية.
      2. تحضير 3 مل من محلول ملحي معقم في حقنة 3 مل وتبريده في دلو ثلج. اشطف المنطقة المكشوفة بشكل متكرر ب 0.1 مل من المحلول الملحي من المحقنة لتبريد المنطقة ومنع التلف الناتج عن الحرارة والنزيف.
    11. قطف الجافية وقشرها برفق بإبرة 27 جرام.
    12. ضع علامة على إبرة حادة 27 جم على بعد 1 مم من الطرف واستخدمها لشفط قشرة الدماغ بعناية من أجل إنشاء نافذة لزرع العدسة8،11،13،17 (الشكل 2B1). إذا لزم الأمر ، اصنع إبرة حادة عن طريق طحن طرف إبرة حقن 27 جم بورق صنفرة. بعد ذلك ، قم بتوصيل الإبرة بحقنة ، وقم بتوصيل المحقنة بأنبوب ، وقم بتوصيل الأنبوب بمصدر شفط لإنشاء فراغ.
      ملاحظة: عدسة التتابع حادة وسوف تضغط على أنسجة المخ عند وضعها في منطقة الدماغ العميقة. وبالتالي ، فإن طموح القشرة يقلل من تلف الأنسجة بسبب زرع عدسة التتابع. يبلغ سمك القشرة حوالي 1 مم في الفئران ولكن يصعب تصورها تحت المجهر المجسم. تخلق العلامة معلما يسمح بتحديد عمق الإبرة بدقة أكبر من المجهر المجسم وحده. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن للمرء تحديد ما إذا كانت منطقة القشرة قد تم الوصول إليها أو تمريرها اعتمادا على المقاومة ؛ يشعر الجزء العلوي من القشرة بالنعومة نسبيا ، بينما تشعر المنطقة تحت القشرية بالكثافة. لذلك ، بمجرد أن يبدأ النسيج في الشعور بكثافة أكبر ، أوقف الطموح (الشكل 2B3).
    13. تحضير 3 مل من محلول ملحي معقم في حقنة 3 مل وتبريده في دلو ثلج. شطف المنطقة بالمحلول الملحي لوقف النزيف وتقليل احتمالية حدوث وذمة في الدماغ.
  2. حقن الفيروس المرتبط ب Adeno (AAV)
    ملاحظة: تم استخدام AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE في التجربة الحالية. jGCaMP7s هو مؤشر كالسيوم مشفر وراثيا ينبعث منه مضان أخضر3. نظرا لأن الدراسة الحالية استخدمت فأرا من النوع البري كموضوع ، فقد كانت هناك حاجة إلى ناقل فيروسي لنقل الخلايا العصبية باستخدام جين مؤشر الكالسيوم الفلوري الأخضر وتمكين التعبير. يمكن للباحثين الذين يستخدمون الفئران المعدلة وراثيا التي تعبر عن مؤشر الكالسيوم الفلوري الأخضر حيث يمكن لموضوعاتهم تخطي البروتوكول 2.2.
    1. قم بتركيب الإبرة الداخلية لقسطرة وريدية 20 جم (IV) على الذراع المجسمة وثقب ببطء (~ 100 - 200 ميكرومتر / دقيقة) الدماغ عند الإحداثيات المناسبة (نفس الإحداثيات المستخدمة أثناء زرع عدسة التتابع) (الشكل 2B3).
    2. خفض إبرة الحقن المجهري بسرعة 100-200 ميكرومتر / دقيقة في CA1 البطني وغرس (~ 25 nL / دقيقة) 200 nL من الناقل الفيروسي في المنطقة المستهدفة (-3.16 مم AP ، 3.25 مم ML ، و -3.50 مم DV من bregma).
    3. انتظر لمدة 10 دقائق للسماح للفيروس بالانتشار وتقليل التدفق الخلفي.
    4. سحب (~ 100-200 ميكرومتر / دقيقة) إبرة الحقن المجهري.
  3. زرع عدسة التتابع
    1. تطهير عدسة التتابع مع 75 ٪ الكحول10،16 ثم شطف بمحلول ملحي خال من البيروجين. انقع العدسة في محلول ملحي بارد خال من البيروجين حتى الزرع.
      ملاحظة: تقلل العدسة الباردة من وذمة الدماغ عند وضعها في الدماغ.
    2. أمسك عدسة الترحيل باستخدام مشبك البلدغ الصغير (الشكل 2B3) الذي تم تغطية أسنانه بأنابيب الانكماش الحراري.
      ملاحظة: يمكن لمشبك البلدغ أن يمسك العدسة بإحكام دون إتلافها. ارجع إلى Resendez et al.8 لمعرفة طريقة صنع مشبك البلدغ المغطى بالأنابيب.
    3. ضع ببطء (~ 100 - 200 ميكرومتر / دقيقة) عدسة التتابع أعلى المنطقة المستهدفة (-3.16 مم AP و 3.50 مم ML و -3.50 مم DV من bregma) وقم بتثبيتها باستخدام الأسمنت السني.
  4. طلاء وهمي
    ملاحظة: الغرض من "الطلاء الأساسي الوهمي" أثناء جراحة الزرع هو إنشاء قاعدة أسمنتية للأسنان من أجل تقليل كمية الأسمنت السني التي يجب تطبيقها أثناء إجراء الطلاء الأساسي الحقيقي بعد عدة أسابيع. بهذه الطريقة ، يتم تقليل خطر حدوث تغيير في حجم الأسمنت السني.
    1. اربط العدسة الشيئية في الجزء السفلي من المنظار وقم بتجميع الصفيحة الأساسية على المنظار (في هذه الخطوة ، لم يتم بعد وضع تجميع العدسة الموضوعية المثبتة ، والصفيحة الأساسية ، والمنظار الصغير فوق جمجمة الماوس).
    2. لف 10 سم من فيلم البارافين حول الجزء الخارجي من الصفيحة الأساسية (الشكل 4 أ).
    3. امسك المنظار الصغير باستخدام مسبار الذراع المجسم باستخدام طين لاصق قابل لإعادة الاستخدام.
    4. قم بمحاذاة العدسة الشيئية أعلى عدسة الترحيل بأقل مساحة ممكنة بين العدسات (الشكل 4 ب).
    5. استخدم الأسمنت السني لتأمين وضع الصفيحة الأساسية (بحيث يلامس الأسمنت فيلم البارافين فقط).
    6. عندما يجف الأسمنت السني ، قم بإزالة الفيلم.
    7. قم بإزالة الصفيحة الأساسية والمنظار. قاعدة الأسمنت السني مجوفة (الشكل 4 ب).
    8. لحماية عدسة الترحيل من الأنشطة اليومية ومن التعرض للخدش بواسطة الماوس ، أغلق عدسة التتابع ببعض مطاط السيليكون المصبوب حتى يتم تغطية عدسة الترحيل ، وقم بتغطية مطاط السيليكون بطبقة رقيقة من الأسمنت السني (الشكل 4 ب).
    9. افصل الماوس عن الأدوات المجسمة وضع الماوس في غرفة الإنعاش.
    10. حقن كاربروفين (5 ملغ/كغ؛ حقن تحت الجلد) أو ميلوكسيكام (1 ملغ/كغ؛ حقن تحت الجلد) لتسكين وسيفتازيديم (25 ملغ/كغ؛ حقن تحت الجلد) لمنع العدوى.
      ملاحظة: استخدام المضادات الحيوية ليس بديلا عن تقنية التعقيم. يمكن الإشارة إلى المضادات الحيوية المحيطة بالجراحة (أي سيفتازيديم) في ظروف معينة ، مثل العمليات الجراحية طويلة الأمد أو وضع الغرسات المزمنة.
    11. راقب الحيوان حتى يستعيد وعيه الكافي للحفاظ على راقد القص.
    12. الفئران المنزلية بشكل فردي وحقن ميلوكسيكام (1 ملغ / كغ ؛ الحقن تحت الجلد ؛ q24h) لمدة أسبوع واحد لتخفيف آلام ما بعد الجراحة. افحص الحيوان كل يوم بعد الجراحة للتأكد من أنه يأكل ويشرب ويتغوط بشكل طبيعي.
    13. أداء الطلاء الأساسي بعد 3 أسابيع أو أكثر.

3. الطلاء الأساسي

ملاحظة: عادة ، لا يمكن إجراء إجراء الطلاء الأساسي (الشكل 5) في غضون 2-3 أسابيع من الإجراء الأولي بسبب وقت التعافي والحضانة الفيروسية. إجراءات الحث للطلاء الأساسي مماثلة لتلك الموضحة في الخطوات 2.1.1 إلى 2.1.8. ومع ذلك ، فإن الطلاء الأساسي ليس إجراء غازيا ، ولا يتطلب الحيوان سوى التخدير الخفيف. لذلك ، 0.8-1.2 ٪ isoflurane كافية ، طالما أن الحيوان لا يستطيع التحرك على الإطار المجسم. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يساعد التخدير الخفيف نسبيا في تسهيل التعبير عن العابرين المضان للخلايا العصبية أثناء المراقبة8 (الفيديو التكميلي S2).

  1. قطع بعناية الطبقة الرقيقة من سقف الأسمنت الأسنان مع rongeur العظام وإزالة المطاط سيليكون. نظف سطح عدسة التتابع بنسبة 75٪ كحول.
  2. اربط برغيا بجانب الصفيحة الأساسية لتثبيته في أسفل المنظار الصغير (الشكل 5A1).
    ملاحظة: يجب شد الصفيحة الأساسية بإحكام أسفل الجزء السفلي من المنظار الصغير لأن الفرق بين الصفيحة الأساسية المشدودة والمثبتة برفق قد يتسبب في مسافة غير متسقة.
  3. اضبط شريحة التركيز لتكون حوالي 2.7 - 3 مم من السكن الرئيسي (الشكل 5A2).
    ملاحظة: على الرغم من أنه يمكن تعديل الطول بشكل أكبر أثناء إجراء الطلاء الأساسي ، قم بتثبيته إلى 2.7 مم تقريبا ، لأن ضبط طول المنظار الصغير والطول الأمثل بين عدسة الترحيل المزروعة والعدسة الموضوعية المثبتة مسبقا أمر مربك للغاية.
  4. قم بتوصيل miniscope بلوحة الحصول على البيانات وقم بتوصيله بمنفذ USB 3.0 (أو إصدار أعلى) على جهاز كمبيوتر.
  5. قم بتشغيل برنامج الحصول على البيانات الذي طوره فريق جامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس.
  6. اضبط التعرض على 255 ، والكسب على 64x ، ومؤشر LED المثير على 5٪. يوصى بهذه الإعدادات للطلاء الأساسي الأولي ؛ ستختلف الإعدادات المحددة اعتمادا على مناطق الدماغ ومستويات التعبير عن مؤشر الكالسيوم المشفر وراثيا.
  7. انقر فوق الزر "اتصال " لتوصيل miniscope ببرنامج الحصول على البيانات ومشاهدة البث المباشر.
  8. قم بمحاذاة العدسة الموضوعية للمنظار المصغر مع عدسة الترحيل يدويا وابدأ في البحث عن إشارات التألق (الشكل 5B1).
    ملاحظة: في البداية، يسهل البحث عن إشارة التألق عمليات الضبط يدويا. نظرا لاستخدام نظام AAV للتعبير عن مؤشر الكالسيوم المشفر وراثيا ، فقد أثر كل من نوع المروج والنمط المصلي AAV على كفاءة النقل23,24. يجب أن يحتاج الباحثون إلى التحقق من التعبير عن مؤشر الكالسيوم من خلال العثور على الخلايا العصبية الفردية التي تظهر تغيرات في مضان قبل الشروع في التجارب المستقبلية.
  9. حفر الأسمنت الأسنان في أي مكان حيث يمنع miniscope (اختياري).
  10. شاهد البث المباشر لبرنامج الحصول على البيانات واستخدم هامش عدسة الترحيل كمعلم (الفيديو التكميلي S2). يظهر هامش عدسة الترحيل كدائرة رمادية تشبه القمر على الشاشة (الشكل 5B1 ؛ الأسهم البيضاء).
  11. بمجرد العثور على عدسة الترحيل ، اضبط بعناية الزوايا والمسافات المختلفة للمنظار الصغير حتى يتم العثور على إشارات التألق.
    ملاحظة: صور الخلايا العصبية أكثر بياضا من الخلفية. يشير الشكل العصبي الدقيق إلى أن الخلايا العصبية تقع بشكل مثالي على المستوى البؤري لعدسة الترحيل. تشير الخلايا العصبية المستديرة إلى أنها كانت بالقرب من المستوى البؤري. يختلف الشكل العصبي عبر الدماغ ، وهنا يظهر CA1 البطني كمثال.
  12. إذا لم تظهر أي خلية عصبية فردية تغيرات في التألق كدالة للوقت ، فأعد إغلاق القاعدة بمطاط السيليكون. لا يلاحظ مضان لأن فترة الحضانة تعتمد أيضا على خاصية الفيروس23,24. نفذ الخطوات 3.1-3.12 بعد أسبوع إضافي. (هذا اختياري).
  13. امسك المنظار الصغير في الموضع الأمثل وحرك الذراع المجسمة بطرف لاصق قابل لإعادة الاستخدام باتجاه المنظار الصغير (الشكل 5B2). قم بلصق المنظار الصغير على الذراع المجسمة بالطين اللاصق القابل لإعادة الاستخدام.
  14. اضبط أذرع x وy وz قليلا للبحث عن أفضل عرض (الفيديو التكميلي S2). بعد ذلك ، اضبط الزاوية بين سطح العدسة الموضوعية وعدسة الترحيل عن طريق تدوير قضيب الأذن أو قضيب الأسنان أو الطين اللاصق القابل لإعادة الاستخدام على المحور z. ينجح التعبير الفيروسي وزرع العدسة عندما تعرض خلية واحدة على الأقل عابرات مضان (الشكل 6 أ ؛ فيديو تكميلي S2) أثناء الطلاء الأساسي (والذي يعتمد أيضا على منطقة الدماغ ، مثل CA1).
    ملاحظة: إذا كانت الشاشة تعرض خلايا بيضاء فقط ولكن لا توجد عابرات ، فهناك سبب آخر (انظر الشكل 6B و C ومقاطع الفيديو التكميلية S4 و S5 وقسم النتائج وقسم استكشاف الأخطاء وإصلاحها).
  15. قم بتدعيم الصفيحة الأساسية (الشكل 5B2) بأسمنت الأسنان.
  16. راقب المنطقة محل الاهتمام أثناء التدعيم للتأكد من عدم تغيير الموضع الأمثل.
  17. استخدم أقل كمية ممكنة من الأسمنت مع الاستمرار في لصق الصفيحة بإحكام على قاعدة الأسمنت السني (الشكل 5B2). ضع طبقة ثانية وثالثة من الأسمنت حول الصفيحة الأساسية ولكن احرص على عدم التأثير على عدسة GRIN.
    ملاحظة: يكون تطبيق الأسمنت على الصفيحة أسهل في هذه الخطوة حيث تم تشكيل قاعدة الصفيحة الأساسية أثناء إجراء الطلاء الوهمي.
  18. افصل المنظار بعناية عن الصفيحة الأساسية عند معالجة الأسمنت. ثم ، المسمار على غطاء واقية.
  19. نقل الحيوان إلى قفص الانتعاش. راقب الحيوان حتى يستعيد وعيه الكافي للحفاظ على راقد القص.
  20. الفئران المنزل بشكل فردي. تأكد من أنه يأكل ويشرب ويتغوط بشكل طبيعي كل يوم. انتظر لمدة 5 أيام حتى يتعافى الماوس تماما ثم تحقق من تصوير الكالسيوم.
    ملاحظة: لا يوجد سوى كمية صغيرة من الأسمنت السني تحمل الصفيحة الأساسية. لذلك ، إذا تحولت الصفيحة الأساسية بشكل كبير منذ إجراء الطلاء الأساسي ، فقم بإزالة الأسمنت السني باستخدام مثقاب وقم بإجراء الطلاء الأساسي مرة أخرى.
  21. تخدير (عن طريق الحقن داخل الصفاق من خليط الكيتامين (87 ملغ / كغ) / زيلازين (13 ملغ / كغ) ) وperpuse25 الحيوان عند الانتهاء من جميع التجارب.

النتائج

تقييم تغيير حجم الأسمنت السني
نظرا لأن حجم الأسمنت السني يتغير أثناء عملية المعالجة ، فقد يؤثر بشكل كبير على جودة التصوير ، نظرا لأن مسافة عمل عدسة GRIN تبلغ حوالي 50 إلى 350 ميكرومتر 4,8. لذلك ، تم اختبار اثنين من الأسمنت السني المتاح تجاريا في هذه الحا...

Discussion

يصف هذا التقرير بروتوكولا تجريبيا مفصلا للباحثين الذين يستخدمون نظام UCLA Miniscope ثنائي العدسات. الأدوات المصممة في بروتوكولنا ميسورة التكلفة نسبيا لأي مختبر يرغب في تجربة تصوير الكالسيوم في الجسم الحي. يمكن أيضا استخدام بعض البروتوكولات ، مثل الحقن الفيروسي ، وزرع العدسة ، والطلاء الأ?...

Disclosures

هذه ليست دراسة مدعومة من الصناعة. لم يبلغ المؤلفون عن أي تضارب في المصالح المالية.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل وزارة العلوم والتكنولوجيا ، تايوان (108-2320-B-002 -074 ، 109-2320-B-002-023-MY2).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.7-mm drill bit #19008-07Fine Science Tools; USAfor surgery
0.1–10 μl pipette tips104-Q; QSPFisher Scientific; Singaporefor testing dental cement
20 G IV cathater#SR-OX2032CATerumo Corporation; Tokyo, Japanfor surgery
27 G needleAGANI, AN*2713RTerumo Corporation; Tokyo, Japanfor surgery
AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE#104487-AAV9; 1.5*10^13Addgene viral prep; MA, USAfor viral injection
Atropine sulfateAstart; Hsinchu, Taiwanfor surgery/dummy baseplating/baseplating
BaseplateV3http://miniscope.orgfor dummy baseplating/baseplating
BLU TACK#30840350Bostik; Chelsea, Massachusetts, USAReusable adhesive clay; for surgery/dummy baseplating/baseplating
Bone Rongeur Friedman13 cmDiener; Tuttlingen, Germanyfor baseplating
BuprenorphineINDIVIOR; UKfor surgery
CarprofenRimadylZoetis; Exton, PAanalgesia
CeftazidimeTaiwan Biotech; Taiwanprevent infection
Data Acquisition PCB for UCLA Miniscopepurchased on https://www.labmaker.org/collections/neuroscience/products/data-aquistion-system-daqfor baseplating
Dental cement setTempronGC Corp; Tokyo, Japanfor testing dental cement
Dental cement setTokuso CurefastTokuyama Dental Corp.; Tokyo, Japanfor testing dental cement/surgery/dummy baseplating/baseplating
Dual Lab Standard with Mouse and Rat Adaptors#51673Stoelting Co; Illinois, USAfor surgery/dummy baseplating/baseplating
Duratear ointmentAlcon; Geneva, Switzerlandfor surgery/dummy baseplating/baseplating
IbuprofenYungShin; Taiwananalgesia
IsofluranePanion & BF Biotech INC.; Taoyuan, Taiwanfor surgery/dummy baseplating/baseplating
InscopixnVista SystemInscopix; Palo Alto, CAfor comparison with V3 UCLA Miniscope
KetaminePfizer; NY, NYfor euthanasia
Normal salinefor surgery
Micro bulldog clamps#12.102.04Dimedo; Tuttlingen, Germanyfor lens implantation
Microliter Microsyringes, 2.0 µL, 25 gauge#88400Hamilton; Bonaduz, Switzerlandfor viral injection
Molding silicone rubberZA22 ThixoZhermack; Badia Polesine, Italyfor dummy baseplating
Objective Gradient index (GRIN) lens#64519Edmund Optics; NJ, USAfor dummy baseplating/baseplating
Parafilm#PM996Bemis; Neenah, USAfor dummy baseplating
Portable Suction#DF-750Doctor's Friend Medical Instrument Co., Inc., Taichung, Taiwanfor surgery
Relay GRIN lens#1050-002177Inscopix; Palo Alto, CA, USAfor dummy baseplating/baseplating
Stainless steel anchor screws1.00 mm diameter, total length 3.00 mmfor surgery
Stereo microscope#SL720Sage Vison; New Taipei City, Taiwanfor surgery/dummy baseplating/baseplating
Stereotaxic apparatus#51673Stoelting; IL, USAfor surgery/dummy baseplating/baseplating
UV Cure Adhesive#3321Loctite; Düsseldorf, Germanyfor testing dental cement
V3 UCLA Miniscopepurchased on https://www.labmaker.org/products/miniscope-complete-set-of-componentsfor surgery/dummy baseplating/baseplating
XylazineX1126Sigma-Aldrich; St. Louis, MOfor euthanasia
Xylocaine pump spray 10%AstraZeneca; Södertälje, Swedenfor surgery

References

  1. Tian, L., Hires, S. A., Looger, L. L. Imaging neuronal activity with genetically encoded calcium indicators. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (6), 647-656 (2012).
  2. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
  3. Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
  4. Campos, P., Walker, J. J., Mollard, P. Diving into the brain: deep-brain imaging techniques in conscious animals. Journal of Endocrinology. 246 (2), 33-50 (2020).
  5. Ghosh, K. K., et al. Miniaturized integration of a fluorescence microscope. Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).
  6. de Groot, A., et al. NINscope, a versatile miniscope for multi-region circuit investigations. Elife. 9, 49987 (2020).
  7. Aharoni, D., Hoogland, T. M. Circuit investigations with open-source miniaturized microscopes: past, present and future. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 141 (2019).
  8. Resendez, S. L., et al. Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses. Nature Protocols. 11 (3), 566-597 (2016).
  9. Aharoni, D., Khakh, B. S., Silva, A. J., Golshani, P. All the light that we can see: a new era in miniaturized microscopy. Nature Methods. 16 (1), 11-13 (2019).
  10. Lee, H. S., Han, J. H. Successful in vivo calcium imaging with a head-mount miniaturized microscope in the amygdala of freely behaving mouse. Journal of Visualized Experiments. (162), e61659 (2020).
  11. Cai, D. J., et al. A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time. Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).
  12. Chen, K. S., et al. A hypothalamic switch for REM and Non-REM sleep. Neuron. 97 (5), 1168-1176 (2018).
  13. Shuman, T., et al. Breakdown of spatial coding and interneuron synchronization in epileptic mice. Nature Neuroscience. 23 (2), 229-238 (2020).
  14. Jimenez, J. C., et al. Anxiety cells in a hippocampal-hypothalamic circuit. Neuron. 97 (3), 670-683 (2018).
  15. Hart, E. E., Blair, G. J., O'Dell, T. J., Blair, H. T., Izquierdo, A. Chemogenetic modulation and single-photon calcium imaging in anterior cingulate cortex reveal a mechanism for effort-based decisions. Journal of Neuroscience. , 2548 (2020).
  16. Gulati, S., Cao, V. Y., Otte, S. Multi-layer cortical Ca2+ imaging in freely moving mice with prism probes and miniaturized fluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (124), e55579 (2017).
  17. Zhang, L., et al. Miniscope GRIN lens system for calcium imaging of neuronal activity from deep brain structures in behaving animals. Current Protocols in Neuroscience. 86 (1), 56 (2019).
  18. Corder, G., et al. An amygdalar neural ensemble that encodes the unpleasantness of pain. Science. 363 (6424), 276-281 (2019).
  19. Liberti, W. A., Perkins, L. N., Leman, D. P., Gardner, T. J. An open source, wireless capable miniature microscope system. Journal of Neural Engineering. 14 (4), 045001 (2017).
  20. Lu, J., et al. MIN1PIPE: A miniscope 1-photon-based calcium imaging signal extraction pipeline. Cell Reports. 23 (12), 3673-3684 (2018).
  21. Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. Elife. 8, 38173 (2019).
  22. Lee, A. K., Manns, I. D., Sakmann, B., Brecht, M. Whole-cell recordings in freely moving rats. Neuron. 51 (4), 399-407 (2006).
  23. Burger, C., et al. Recombinant AAV viral vectors pseudotyped with viral capsids from serotypes 1, 2, and 5 display differential efficiency and cell tropism after delivery to different regions of the central nervous system. Molecular Therapy. 10 (2), 302-317 (2004).
  24. Royo, N. C., et al. Specific AAV serotypes stably transduce primary hippocampal and cortical cultures with high efficiency and low toxicity. Brain Research. 1190, 15-22 (2008).
  25. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
  26. Ziv, Y., et al. Long-term dynamics of CA1 hippocampal place codes. Nature Neuroscience. 16 (3), 264-266 (2013).
  27. Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and care, Part I: anesthetic considerations in preclinical research. ILAR journal / National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 53 (1), 55-69 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

172 UCLA Miniscope

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved